INDUKSI KERAGAMAN GENETIK DENGAN SINAR
GAMMA PADA JERUK SIAM PONTIANAK (C
itrus nobilis var.
microcarpa
) SECARA
IN VITRO
ANDRI INDRAYASA
A24061354
DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA
FAKULTAS PERTANIAN
ANDRI INDRAYASA. Induksi Keragaman Genetik dengan Sinar Gamma pada Jeruk Siam Pontianak (Citrus nobilis var. microcarpa) secara In Vitro . (Di bawah bimbingan AGUS PURWITO dan ALI HUSNI).
Di antara berbagai jenis jeruk, jeruk siam mendominasi produksi jeruk di
Indonesia. Tetapi, jenis jeruk ini masih memiliki jumlah biji yang relatif banyak,
warna kulit yang kurang menarik, dan kulitnya sulit dikupas. Teknik pemuliaan
konvensional pada jeruk memerlukan waktu yang cukup lama dan biaya yang
besar, serta dibatasi oleh heterozigositas yang tinggi, tipe reproduktif melalui
embrio nuselar dan juga juvenilitas. Pemuliaan mutasi dengan menggunakan
mutagen fisik seperti sinar gamma merupakan salah satu alternatif untuk
meningkatkan keragaman yang dapat mengubah satu atau lebih karakter tanpa
mengubah karakteristik asalnya. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan
varietas unggul jeruk siam Pontianak yang memiliki karakter agronomi dan
kualitas buah yang lebih baik.
Percobaan ini telah dilakukan melalui beberapa tahap, mulai dari
perbanyakan kalus embriogenik, iradiasi sinar gamma pada kalus, pendewasaan
embrio somatik, perkecambahan embrio somatik, analisis keragaman genetik
berdasarkan karakter morfologi dan analisis stomata sehingga diperoleh informasi
bahwa pemberian mutagen sinar gamma dapat menyebabkan perubahan baik
morfologi maupun jumlah kromosom.
Kegiatan persiapan dan perbanyakan bahan tanam telah dilaksanakan
selama 3 bulan di Laboratorium Kultur Jaringan, kelompok peneliti Biologi Sel
dan Jaringan, BB-Biogen, selanjutnya kalus tersebut diiradiasi di BATAN Jakarta
dengan dosis 0, 10, 20, 30, dan 40 Gy. Regenerasi kalus menjadi planlet (tanaman
lengkap) dilakukan melalui jalur embriogenesis somatik. Pendewasaan embrio
somatik primer (fase globular) menjadi embrio somatik dewasa (Fase hati, fase
torpedo, dan fase kotiledon) dilakukan pada media MW dengan penambahan
ABA dengan konsentrasi 1.0, 1.5, 2.0, dan 2.5 mg/l. Untuk meningkatkan
viii
Malt pada media kultur. Perkecambahan embrio somatik dilakukan dalam media
MW dengan penambahan 0.5 mg/l GA3.
Untuk pengujian keragaman genetik yang terjadi akibat iradiasi sinar
gamma, dilakukan dengan cara pengamatan morfologi yang diamati dari
perubahan bentuk tanaman secara visual. Pendugaan jumlah kromosom dilakukan
dengan pengamatan terhadap jumlah kloroplas di dalam sel penjaga pada stomata.
Selanjutnya dilakukan analisis data dengan program NTSYS ver. 2.02.
Hasil analisis ragam pada tahap pertumbuhan kalus setelah iradiasi
menunjukkan bahwa pemberian mutagen sinar gamma dapat mempengaruhi
pertumbuhan dan perkembangan kalus dalam proliferasi maupun pendewasaan
serta perkecambahan embrio somatik. Perubahan morfologi yang terjadi dapat
dilihat secara visual, yaitu pada karakter jumlah daun, bentuk daun, bentuk ujung
daun, tinggi planlet, warna daun, dan ketegapan tanaman. Perubahan yang terjadi
pada tingkat kromosom dapat dilihat berdasarkan jumlah kloroplas yang terdapat
pada sel penjaga pada stomata. Berdasarkan hasil analisis jumlah kloroplas di
dalam sel penjaga diperoleh calon mutan yang diduga merupakan tanaman triploid
yaitu regeneran yang berasal dari pemberian iradiasi sinar gamma pada dosis 10
microcarpa
) SECARA
IN VITRO
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Pertanian pada Fakultas Pertanian
Institut Pertanian Bogor
OLEH
ANDRI INDRAYASA A24061354
DEPARTEMEN AGRONOMI DAN HORTIKULTURA
FAKULTAS PERTANIAN
Judul :
INDUKSI KERAGAMAN GENETIK DENGAN SINAR
GAMMA PADA JERUK SIAM PONTIANAK (
Citrus
nobilis var. microcarpa
) SECARA
IN VITRO
Nama
: ANDRI INDRAYASA
NIM :
A.24061354
Menyetujui, Dosen Pembimbing
Pembimbing I Pembimbing II
Dr. Ir. Agus Purwito, MSc. Agr Dr. Ali Husni, MSi NIP : 19611101 198703 1 003 NIP: 19641209 199203 1 002
Mengetahui:
Ketua Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Agus Purwito, MSc. Agr NIP : 19611101 198703 1 003
Penulis bernama lengkap Andri Indrayasa, dilahirkan di Bandung pada
tanggal 12 Februari 1988 dan merupakan anak kedua dari tiga bersaudara dari
pasangan Bapak Indra Koswara dan Ibu Nurhayati
Jenjang pendidikan yang ditempuh penulis diantaranya pada tahun 1992
menempuh pendidikan di TK Bandung Institut dan lulus pada tahun 1994.
Pendidikan dasar di tempuh pada tahun 1994 di SDN Taruna Karya I Kota
Bandung dan lulus tahun 2000. Pada tahun 2000 penulis menempuh pendidikan di
SMPN 46 Bandung dan lulus tahun 2003. Pada tahun 2003 penulis menempuh
pendidikan di SMAN 26 Bandung dan lulus tahun 2006.
Pada tahun 2006, penulis diterima sebagai mahasiswa Instititut Pertanian
Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Tahun 2007, penulis
memasuki Departemen Agronomi dan Horikultura, Fakultas Pertanian, Institut
Pertanian Bogor. Selama kuliah penulis aktif dalam organisasi daerah Bandung
(PAMAUNG) periode 2007/2008, Dewan Perwakilan Mahasiswa (DPM) Fakultas
Pertanian komisi internal periode 2007/2008 dan komisi pengawas BEM periode
2008/2009, serta sebagai anggota Koperasi Mahasiswa (KOPMA) IPB. Selain itu
penulis pun pernah menjadi asisten mata kuliah Metode Statistik dan Rancangan
Percobaan serta asisten praktikum mata kuliah Pembiakan Tanaman.
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada
Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian
Bogor, penulis melakukan penelitian yang berjudul “Induksi Keragaman Genetik dengan Sinar Gamma pada Jeruk Siam Pontianak (Citrus nobilis var. microcarpa) secara In Vitro” dibimbing oleh Dr. Ir. Agus Purwito, MSc, Agr. dan Dr. Ali Husni, MSi.
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat
dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini.
Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada semua pihak
yang membantu dalam penyusunan skripsi ini, dan secara khusus kepada:
1. Dr. Ir. Agus Purwito, MSc.Agr dan Dr. Ali Husni, MSi selaku dosen
pembimbing, yang telah banyak memberikan bimbingan dan saran dalam
proses penelitian sampai penyusunan skripsi.
2. Ibu Maryati Sari selaku pembimbing akademik yang telah membimbing
penulis selama menjalani studi.
3. Dr. Dewi Sukma, SP, MSi. sebagai penguji.
4. Ayah dan ibu beserta seluruh keluarga besar yang selalu mendukung
dalam segala aktivitas penulis.
5. Tanoto Foundation yang telah memberikan beasiswa kepada penulis
selama kuliah.
6. Seluruh jajaran karyawan dan staf BB-Biogen yang telah banyak
membantu penulis dalam kegiatan penelitian.
7. Teman-teman Agronomi dan Hortikultura angkatan 43 yang telah
memberikan motivasi dan saran.
8. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian skripsi.
Penulis menyadari akan segala kekurangan dalam penyusunan skripsi ini,
namun demikian penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi
perkembangan kemajuan penelitian pada umumnya, khususnya pada tanaman
jeruk.
Bogor, 25 Februari 2011
Penulis
Halaman
DAFTAR TABEL ... viii
DAFTAR GAMBAR ... ix
DAFTAR LAMPIRAN ... x
PENDAHULUAN ... 1
Latar Belakang ... 1
Tujuan ... 3
Hipotesis ... 3
TINJAUAN PUSTAKA ... 4
Tanaman Jeruk ... 4
Jeruk Siam Pontianak ... 5
Budidaya Jeruk Siam Pontianak... 7
Embriogenesis Somatik pada Jeruk ... 8
Buah Jeruk Tanpa Biji ... 9
Induksi Mutasi pada Kultur Jaringan ... 10
Mutagen Sinar Gamma ... 12
BAHAN DAN METODE ... 14
Tempat dan Waktu ... 14
Bahan dan Alat ... 14
Metode Percobaan ... 14
Pelaksanaan ... 17
Analisis Data ... 22
HASIL DAN PEMBAHASAN ... 24
1. Proliferasi Kalus Embriogenik Hasil Iradiasi ... 26
2. Pendewasaan Embrio Somatik ... 30
3. Perkecambahan Embrio Somatik ... 33
4. Pertumbuhan Regeneran Mutan ... 34
5. Evaluasi Keragaman Genetik ... 37
KESIMPULAN DAN SARAN ... 43
Kesimpulan ... 43
Saran ... 43
DAFTAR PUSTAKA ... 44
2
DAFTAR TABEL
Nomor
Halaman
1. Klasifikasi Ilmiah Jeruk Siam (Sari, 2004) ... 5
2. Kelebihan dan kekurangan penggunaan berbagai jenis jaringan yang
digunakan untuk mutasi (Roose dan Williams, 2007). ... 12
3. Pengaruh dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap luas kalus
jeruk siam Pontianak (cm2) pada 2 MST. ... 28
4. Pengaruh dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap luas kalus
jeruk siam Pontianak (cm2) pada 4 MST. ... 29
5. Pengaruh dosis radiasi dan konsentrasi ABA pada media pendewasaan
embrio somatik (MW dan MW + 500 mg/l EM) setelah 4 MST ... 32
6. Pengaruh dosis iradiasi terhadap perkecambahan embrio somatik
pada 4 MST. ... 33
7. Keragaman regeneran jeruk siam Pontianak secara in vitro hasil
perlakuan sinar gamma. ... 36
8. Jumlah kloroplas didalam sel penjaga pada regeneran mutan
terseleksi. ... 39
9. Kisaran, rataan, ragam fenotipik (σ2f) dan standar deviasi ragam
Nomor
Halaman
1. (a) buah, dan (b) tanaman jeruk siam Pontianak. ... 6
2. Diagram alir percobaan. ... 22
3. Kalus embriogenik hasil perbanyakan (a) penampakan kalus di botol
kultur, dan (b) penampakan secara mikroskopik pada perbesaran
10 X. ... 24
4. Kondisi umum planlet di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok
Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, BB-Biogen. ... 25
5. Eksplan kalus jeruk siam Pontianak yang terkontaminasi (a) bakteri
dan (b) cendawan. ... 26
6. Embrio somatik abnormal (a) kompak, (b) roset dan kompak. ... 26
7. Tahap pendewasaan embrio somatik jeruk siam Pontianak, (a) fase
globular, (b) fase hati, (c) fase torpedo, (d) dan fase kotiledon. ... 31
8. Perkembangan embrio somatik, a) dan b) tahap pendewasaan,
c) tahap perkecambahan embrio somatik jeruk siam Pontianak. ... 34
9. Karakter morfologi regeneran mutan dalam media pembesaran
( MW + 500 mg/l EM). ... 35
10. Panjang dan lebar stomata serta kloroplas di dalam sel penjaga pada
stomata jeruk siam Pontianak. ... 38
11. Dendogram regeneran jeruk in vitro berdasarkan karakter morfologi. ... 40
12. Regeneran-regeneran mutan yang telah disambung, (a) M-10/5,
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor
Halaman
1. Komposisi Media MW (Morrel dan Wetmore, 1961) ... 50
2. Data biner pengamatan morfologi pada 15 regeneran kontrol dan mutan ... 51
3. Deskripsi Jeruk Siam Pontianak ... 52
4. Sidik ragam luas kalus pada 2 MST ... 53
5. Sidik ragam luas kalus pada 4 MST ... 53
6. Sidik ragam jumlah kloroplas di dalam sel penjaga ... 53
Latar Belakang
Jeruk merupakan salah satu buah yang paling digemari di Indonesia. Hal
ini ditandai dengan semakin meningkatnya konsumsi jeruk di Indonesia dari tahun
ke tahun. Konsumsi buah jeruk pada tahun 1995-2004 mengalami peningkatan
sebesar 12.15% per tahun (Hutabarat dan Setyanto, 2008). Total konsumsi jeruk
Indonesia pada tahun 2004 mencapai 2 161.90 ribu ton (Hutabarat dan Setyanto,
2008) sedangkan produksi jeruk dalam negeri hanya 2 071.08 ribu ton (Deptan,
2009). Rendahnya produksi jeruk di Indonesia antara lain disebabkan tingkat
produktivitasnya masih rendah. Produktivitas kebun jeruk di Indonesia masih jauh
dari kebun-kebun di negara lain yaitu hanya 12.22 ton per hektar sedangkan
Australia dan Amerika Serikat masing-masing mencapai 19.38 dan 37. 81 ton per
hektar (FAO, 2007)
Di antara berbagai jenis jeruk, jeruk siam mendominasi produksi jeruk di
Indonesia. Namun, jenis jeruk ini mempunyai limbah atau bagian yang tidak
dikonsumsi paling tinggi di antara jenis lainnya. Limbah tersebut berupa serasah
sisa yang dimakan, kulit buah, dan biji. Jenis jeruk ini juga peka terhadap hama
dan penyakit serta cekaman lingkungan (Sukarmin dan Ihsan, 2008). Selain itu
menurut Husni (2008) jeruk jenis ini rasanya cukup manis tetapi belum sesuai
dengan kategori yang diinginkan pasar dunia untuk dikonsumsi dalam keadaan
segar. Jeruk siam masih mempunyai biji yang relatif banyak (14-24 biji per buah)
dan mempunyai warna kulit yang belum begitu menarik sehingga kalah bersaing
dengan jeruk yang diproduksi negara lain. Kebutuhan pasar dunia terhadap buah
jeruk yang dikonsumsi segar saat ini perlu memenuhi kategori buah yang tidak
berbiji (seedless), mudah dikupas (easy peeling), dan mempunyai tipe mandarin
dengan warna yang menarik (pigmented) (Husni, 2010). Oleh karena itu, perlu
dilakukan perbaikan mutu buah melalui pemuliaan untuk meningkatkan porsi
buah yang dapat dimakan serta memenuhi trend kebutuhan pasar dunia.
Perbaikan sifat genetik dan agronomi tanaman dapat dilakukan melalui
2
yang diinginkan (Soedjono, 2003). Namun teknik pemuliaan konvensional
memerlukan waktu yang cukup lama dan biaya yang besar. Menurut Sukarmin
dan Ihsan (2008) untuk mendapatkan varietas unggul baru jeruk diperlukan
tahapan yang panjang dan waktu yang cukup lama, yaitu 6-15 tahun. Menurut
Agisimanto dan Sutarto (2008) perbaikan genetik Citrus spp melalui hibridisasi
dihambat dan dibatasi oleh sifat heterozigositas yang tinggi, tipe reproduktif
melalui embrio nuselar dan juga juvenilitas, yang berujung kepada kebutuhan
seleksi yang besar. Menurut Suryowinoto (2000) salah satu alternatif pemecahan
masalah yaitu melalui teknik kultur jaringan atau teknik in vitro yang salah
satunya dengan cara induksi mutasi.
Dalam penelitian ini dilakukan induksi mutasi dengan iradiasi
menggunakan sinar gamma untuk menginduksi keragaman pada tanaman jeruk
siam. Menurut Sutjahjo et al. (2007) teknik in vitro melalui variasi somaklonal
dan perlakuan mutasi fisik seperti iradiasi sinar gamma pada jaringan atau
sekelompok sel (kalus) merupakan alternatif untuk mendapatkan varian yang
diinginkan. Selanjutnya Agisimanto dan Sutarto (2008) menambahkan bahwa
radiasi seperti sinar gamma paling banyak digunakan untuk menghasilkan
karakter yang diinginkan untuk pemuliaan tanaman. Teknik ini sudah banyak
digunakan pada berbagai spesies tanaman, terutama yang memiliki variasi genetik
yang sempit, untuk memperbaiki karakter spesifik di dalam kultivar lokal yang
adaptif pada lingkungan spesifik. Iradiasi pengion seperti sinar gamma merupakan
mutagen yang paling efektif untuk pemuliaan tanaman, karena menginduksi
perubahan lebih banyak bila dibandingkan secara kimia karena kemampuan
penetrasinya lebih jauh ke dalam jaringan. Kosmiatin et al. (2010) melaporkan
adanya peningkatan keragaman genetik pada tanaman jeruk batang bawah
Japhanese Citroen (JC) untuk ketahanan terhadap cekaman alumunium (Al) hasil
Tujuan
• Mempelajari pengaruh perlakuan biotin pada beberapa konsentrasi terhadap proliferasi kalus embriogenik yang telah diiradiasi.
• Mempelajari pengaruh perlakuan ABA pada beberapa konsentrasi terhadap
pendewasaan embrio somatik yang telah diiradiasi.
• Meningkatkan keragaman genetik jeruk siam dengan menggunakan mutagen
sinar gamma.
• Mendapatkan informasi mengenai keragaman genetik hasil iradiasi melalui analisis morfologi dan jumlah kloroplas di dalam sel penjaga pada regeneran
yang dihasilkan.
Hipotesis
• Pemberian dosis iradiasi yang berbeda dapat meningkatkan keragaman genetik jeruk siam Pontianak.
• Terdapat konsentrasi biotin yang terbaik untuk proliferasi kalus embriogenik
jeruk siam Pontianak hasil radiasi sinar gamma.
• Terdapat interaksi antara dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap
perkembangan kalus jeruk siam Pontianak.
TINJAUAN PUSTAKA
Tanaman Jeruk
Tanaman jeruk adalah tanaman buah tahunan yang berasal dari Asia. Cina
dipercaya sebagai tempat pertama kali jeruk tumbuh. Sejak ratusan tahun yang
lalu, jeruk sudah tumbuh di Indonesia baik secara alami atau dibudidayakan.
Tanaman jeruk yang ada di Indonesia adalah peninggalan Belanda yang
mendatangkan jeruk manis dan keprok dari Amerika dan Italia (Menegristek,
2000).
Jeruk merupakan sumber vitamin C yang sangat baik. Jus jeruk
mengandung asam askorbat 20-60 mg per 100 ml. Vitamin lain yang tak kalah
penting adalah vitamin A, tiamin, niasin, riboflavin, asam pantotenat, biotin, asam
folat, inositol, dan tokoferol. Kandungan vitamin A berkisar antara 250-420 IU,
tiamin 70-120 µg, asam folat 1.2 µg, dan inositol 135 mg setiap 100 ml jus
(BB-Pascapanen, 2009).
Jenis jeruk lokal yang dibudidayakan di Indonesia adalah jeruk Keprok
(Citrus reticulata/nobilis L.), jeruk Siam (C. microcarpa L. dan C.sinensis L.)
yang terdiri atas Siam Pontianak, Siam Garut, Siam Lumajang, jeruk manis (C.
auranticum L. dan C. sinensis L.), jeruk sitrun/lemon (C. medica), jeruk besar (C.
maxima Herr.) yang terdiri atas jeruk Nambangan-Madium dan Bali. Jeruk untuk
bumbu masakan yang terdiri atas jeruk nipis (C. aurantifolia), jeruk Purut (C.
hystrix) dan jeruk sambal (C. hystix ABC) (Menegristek, 2000).
Indonesia merupakan negara tropis di mana berbagai jenis jeruk banyak
dijumpai dan dibudidayakan mulai dari dataran rendah hingga dataran tinggi.
Bahkan beberapa jenis jeruk tersebut telah menjadi unggulan daerah maupun
nasional seperti jeruk manis Pacitan dari daerah Pacitan, Jawa Timur; jeruk manis
Waturejo dari Jawa Tengah; keprok SoE dari Nusa Tenggara Timur; Keprok Batu
55 dari Batu, Jawa Timur; Siam Madu, Keprok Maga, dan Beras Sitepu dari
Medan, Sumut; Siam Pontianak dari Kalimantan Barat; dan Pamelo Nambangan,
Sri Nyonya, serta Magetan dari Magetan, Jawa Timur (Martasari dan Mulyanto,
Jeruk siam memiliki ciri khas yang tidak dimiliki jeruk keprok lainnya.
Dilihat sekilas memang tidak jauh berbeda. Perbedaannya terletak pada kulitnya
yang tipis dan mengkilap. Disamping itu, kulit jeruk siam menempel lebih lekat
dengan dagingnya, sedangkan pada jeruk keprok lainnya terdapat ruang pemisah
yang lebih jelas. Jeruk siam memiliki ukuran yang ideal, tidak terlalu besar dan
tidak terlalu kecil (Setiawan, 1992).
Jeruk Siam Pontianak
Jeruk Pontianak yang dikenal sebagai jeruk siam ini memiliki ciri antara
lain buahnya berwarna hijau kekuningan, mengkilat, dan permukaannya halus
(Gambar 1). Ketebalan kulitnya sekitar 2 mm. Berat tiap buah sekitar 75.6 g.
Bagian ujung buah berlekuk dangkal. Daging buahnya bertekstur lunak dan
mengandung banyak air dengan rasa manis yang segar. Setiap buah mengandung
sekitar 20 biji. Tabel 1 menunjukkan klasifikasi ilmiah dari jeruk siam Pontianak.
Jeruk siam tumbuh berupa pohon berbatang rendah dengan tinggi 2-8
meter (Gambar 1). Umumnya tanaman ini tidak berduri. Batangnya bulat atau
setengah bulat dan memiliki percabangan yang banyak dengan tajuk yang sangat
rindang. Ciri khas lainnya tanaman ini adalah dahannya kecil dan letaknya
berpencar tidak beraturan. Daunnya berbentuk bulat telur memanjang, elips, atau
lanset dengan pangkal tumpul dan ujung meruncing seperti tombak. Permukaan
atas daun berwarna hijau tua mengkilat sedangkan permukaan bawah hijau muda.
Panjang daun 4-8 cm dan lebar 1.5-4 cm. Tangkai daunnya bersayap sangat
sempit sehingga bisa dikatakan tidak bersayap (Sarwono, 1994).
Tabel 1. Klasifikasi Ilmiah Jeruk Siam (Sari, 2004)
Kerajaan Plantae Divisio Spermatophyta
Kelas Dicotyledonae Subkelas Rosidae
Ordo Eutales Familia Rutaceae
6
Bunga jeruk merupakan bunga lengkap yang terdiri atas ovarium (bakal
buah), kepala putik, kepala sari, mahkota, dan tangkai putik (Sukarmin dan Ihsan,
2008). Kelopak bunga berjumlah 4-5, ada yang menyatu ada yang tidak. Mahkota
bunga kebanyakan berjumlah 4-5 dan berdaun lepas. Tonjolan dasar bunga
beringgit atau berlekuk di dalam benang-sari (Sarwono, 1994).
Cairan nektar diproduksi oleh jaringan bagian atas bunga jantan. Nektar
diproduksi sampai 48 jam sesudah bunga mekar. Bunga jeruk mekar pagi hari
pukul 09.00 hingga pukul 16.00. Sementara itu kepal putik sudah matang/reseptif
sebelum bunga mekar, sedangkan bunga jantan matang beberapa jam sesudah
bunga mekar. Degan demikian kemungkinan terjadinya penyerbukan sendiri
cukup besar. Persentase bunga jadi buah setiap jenis berbeda, Washington Navel
Orange (WNO) paling sedikit, yaitu 0.04%, Valencia 1.5%, sedangkan limau
tertinggi dapat mencapai 6.5%. Melihat kecilnya persentase fruit set buah jeruk,
peran serangga penyerbuk sangat penting, terutama dalam mengatasi masalah
inkompatibel sendiri (Ashari, 1995).
Gambar 1. (a) buah, dan (b) tanaman jeruk siam Pontianak.
Salah satu masalah utama bagi perbenihan jeruk adalah adanya sifat
poliembrioni pada benih jeruk, yaitu benih mempunyai embrio lebih dari satu.
Embrio yang dihasilkan dapat berupa embrio zigotik dan nucellar. Embrio zigotik
berasal dari peleburan pollen dan ovum, sedangkan embrio nucellar merupakan
hasil perkembangan dari sel nuselus tanaman induk (Herdiyanto et al., 2008).
Budidaya Jeruk Siam Pontianak
Tanaman jeruk bisa berbuah di daerah-daerah basah, setelah periode
kering singkat. Tanaman membentuk tunas-tunas baru dengan bunga. Jeruk siam
Pontianak berbunga pada bulan Oktober-November, dan musim berbuahnya pada
bulan Juni-Agustus (Sarwono, 1994). Iklim yang cocok untuk penanaman jeruk
siam adalah iklim tipe B dan C, berdasarkan penggolongan Smith dan Ferguson.
Idealnya pada iklim ini curah hujan optimal sekitar 1 500 mm/tahun. Di samping
itu, jeruk siam memerlukan banyak sinar matahari. Jenis jeruk ini memberikan
hasil yang optimum di daerah kering dengan pengaturan air (irigasi) yang baik
(Pracaya, 2002).
Bibit jeruk yang biasa ditanam berasal dari perbanyakan vegetatif berupa
penyambungan tunas pucuk. Bibit yang baik adalah yang bebas penyakit, mirip
dengan induknya (true to type), subur, berdiameter batang 2-3 cm, permukaan
batang halus, akar serabut banyak, akar tunggang berukuran sedang dan memiliki
sertifikasi penangkaran bibit (Pracaya, 2002).
Jarak tanam yang digunakan bervariasi dari satu lokasi yang lainnya.
Kebun jeruk di dataran rendah (lahan basah) jarak tanamnya relatif lebih jarang
dibanding kebun jeruk di dataran tinggi, karena 40% dari lahan basah terpakai
untuk keperluan pembuatan drainase dan pembuatan jalan. Di pulau Jawa biasa
digunakan jarak tanam 7 x 7 meter atau 8 x 8 meter. Tetapi jarak tanam yang
dianjurkan untuk jeruk siam adalah 6 x 6 meter. Jarak tanam yang lebih besar
umumnya tidak memberi pengaruh terhadap tanaman kecuali rendahnya populasi
tanaman per hektarnya. Sebelum penanaman, lubang tanam yang sudah dibuat
diisi dengan pupuk kandang/kompos yang dicampur tanah lapisan atas (Sarwono,
1994).
Tanaman jeruk baru menghasilkan buah setelah berumur 3 - 4 tahun dan
puncak produksi pada umur tahun ke 8-9. Pembersihan atau penyiangan paling
tidak harus dilakukan dua kali dalam satu tahun, diantaranya satu kali bersamaan
dengan pemupukan, lainnya menjelang panen. Dengan penyiangan yang baik
diharapkan pupuk yang diberikan efektif termanfaatkan untuk pohon jeruk.
8
P (Urea dan TSP) sebanyak 2 kali. Untuk tanaman berumur 2 tahun diberi 3-4 kali
pemupukan dengan jenis yang sama (Pracaya, 2002).
Hama yang banyak menyerang tanaman jeruk ini adalah Avid citricidus
dan kutu daun. Tapi serangga ini bisa dibasmi dengan mempergunakan
insektisida. Sedang penyakit yang sering muncul adalah penyakit cendawan
Phitophthora, tapi bisa diatasi dengan penyemprotan fungisida BB (Bubur Bordo
2 %) (Sarwono, 1994).
Embriogenesis Somatik pada Jeruk
Regenerasi tanaman dapat dilakukan melalui dua cara, yaitu organogenesis
(melalui pembentukan organ langsung dari eksplan) dan embriogenesis somatik
(melalui pembentukan embrio somatik). Dibandingkan dengan embriogenesis,
organogenesis mempunyai keunggulan, yaitu peluang terjadinya mutasi lebih
kecil, metodenya lebih mudah, dan tidak memerlukan subkultur berulang sehingga
tidak menurunkan daya regenerasi dari kalus. Namun demikian, untuk keperluan
pemuliaan tanaman, embriogenesis lebih dianjurkan karena tanaman yang
diperoleh berasal dari satu sel somatik sehingga peluang terjadinya khimera lebih
rendah (Gray, 2005). Menurut Husni (2010) sifat ini menguntungkan untuk
manipulasi genetik secara in vitro karena perubahan genetik yang terjadi akibat
mutasi, transformasi genetik melalui fusi protoplas dan rekayasa genetik pada satu
sel akan menghasilkan mutan atau hibrida dengan utuh tanpa adanya khimera.
Selain itu embrio somatik primer (massa proembrio) yang diperoleh dapat
dilipat-gandakan dengan cepat menjadi embrio sekunder sehingga memungkinkan
dilakukannya manipulasi in vitro tanpa dibatasi oleh ketersediaan material
eksplan. Menurut Gray (2005) embrio somatik biasanya berasal dari sel tunggal
yang kompeten dan berkembang membentuk fase globular, hati, torpedo dan
akhirnya menjadi embrio somatik dewasa yang siap dikecambahkan membentuk
planlet.
Tahapan akhir dan yang paling kritis ialah saat terjadinya tanaman baru
yang berasal dari individu sel. Dalam hal ini, tanaman baru dapat dihasilkan dari
sel-sel kalus atau suspensi sel tunggal. Teknologi untuk menghasilkan regenerasi
haruslah tepat agar dapat menstimulasi diferensiasi bagian-bagian tanaman yang
berasal dari sel-sel totipoten. Kebanyakan dalam diferensiasi ini hanya diperoleh
salah satu bagian tanaman, bagian akar, atau bagian tunas. Setiap bagian tanaman
membutuhkan kondisi tertentu agar dapat beregenerasi (Welsh, 1991).
Pada jeruk siam (simadu dan Pontianak), induksi kalus embriogenik
(putih-hijau bergranul dengan permukaan mengkilat) dapat diperoleh dari eksplan
nuselus yang diisolasi dari buah muda yang berumur 30-90 hari setelah antesis
yang ditanam pada medium MW + BA 3 mg/l + EM 500 mg/l + sukrosa 3%.
Proses pendewasaan kalus embriogenik dilakukan pada media MW + EM 500
mg/l dengan penambahan ABA. Untuk tahap perkecambahan sehingga
menghasilkan bibit somatik (planlet) dilakukan dengan penambahan GA3 pada
konsentrasi 0.5 mg/l (Husni et al., 2010).
Buah Jeruk Tanpa Biji
Tanpa biji (seedless) adalah karakter utama pada buah yang dikonsumsi
segar dan penting untuk industri minuman karena biji pada buah dapat
memberikan aroma yang tidak sedap dan rasa pahit (bitterness). Pemuliaan buah
khususnya jeruk pada saat ini terkonsentrasi untuk mengembangkan kultivar
unggul baru jeruk yang tanpa biji (Ollitrault et al., 2007).
Mutagenesis merupakan cara yang efisien untuk mengembangkan buah
tanpa biji karena sterilitas adalah salah satu efek dari perlakuan mutagen yang
sering terjadi (Ollitrault et al., 2007). Hensz (1971) dalam Olitrault et al. (2007)
mengembangkan ‘Star Ruby’ grapefuit tanpa biji menggunakan iradiasi pada
benih dengan menggunakan termal neutrón. Setelah Hensz sukses
mengembangkan kultivar tanpa biji menggunakan iradiasi, metode ini kemudian
digunakan pada berbagai kultivar yang perbanyakannya menggunakan biji. Hearn
(1984) menghasilkan ‘Pineapple’ orange dan ‘Duncan’ grapefruit tanpa biji
dengan mutagen sinar gamma pada benih. Hearn juga berhasil mengembangkan
‘Foster’ grapefruit menggunakan iradiasi mata tunas dengan menggunakan sinar
gamma. Chen et al. (1991) dalam Ollitrault et al. (2007) menggunakan iradiasi
10
menggunakan mutagen sinar gamma pada eksplan mata tunas (Ollitrault et al.,
2007).
Varietas komersial penting pada jeruk seperti Washington Navel Orange
(WNO), Marsh Grapefruit, Shamouti Orange, dan Salustiana Orange merupakan
hasil dari pemuliaan mutasi. Sutarto et al. (2009) melaporkan jeruk tanpa biji
didapatkan pada jeruk mandarin ( Citrus reticulata L. Blanco) cv. SoE dan
pumello (Citrus grandis L. Osbeck) cv. Nambangan pada dosis 20 dan 40 Gy
dengan menggunakan eksplan bud wood. Iradiasi sinar gamma menginduksi
karakter buah seperti sifat tanpa biji, warna kulit, warna daging buah, dan
ketebalan endocarp. Teknik mutasi induksi seperti mutagen fisik atau kimia
adalah cara terbaik untuk meningkatkan keragaman spesies tanaman karena
mutasi alami frekuensi terjadinya sangat rendah. Teknik mutasi sangat
berkontribusi pada pemuliaan tanaman dan telah banyak menghasilkan varietas
yang produktivitasnya tinggi dan memiliki nilai ekonomi.
Verietas baru jeruk umumnya muncul dari hasil perpindahan benih antar
lokasi dan mutasi mata tunas. Hanya sedikit varietas baru yang diperoleh dari
program pemuliaan (Martasari et al., 2004). Spesies jeruk mempunyai
heterozigositas yang tinggi, kebanyakan sifatnya adalah poligenik yaitu dikontrol
oleh banyak gen. Probabilitas gen-gen yang berekombinasi pada hibrida untuk
menyusun kembali karakter-karakter penting dari varietas tradisional terdahulu
sangat rendah. Pemuliaan jeruk dihambat dengan tingginya juvenilitas pada bibit
nuselar dan zigot. Berbagai kesulitan yang muncul dari penyerbukan silang
konvensional untuk perakitan varietas baru sebagian dapat diatasi dengan strategi
baru program pumuliaan jeruk melalui iradiasi, fusi protoplas, dan produksi
tanaman jeruk transgenik (Martasari et al. 2004).
Induksi Mutasi pada Kultur Jaringan
Pada dasarnya evolusi tanaman terjadi karena mutasi yang terus menerus
di alam. Oleh karena itu banyak yang beranggapan bahwa keragaman yang ada
sekarang terutama disebabkan oleh mutasi (Lubis, 2005). Mutasi adalah
perubahan pada materi genetik suatu organisme yang terjadi secara tiba-tiba, acak,
Mutasi dapat terjadi secara spontan (spontaneous mutation) dan dapat juga terjadi
melalui induksi (induced mutation). Secara mendasar tidak terdapat perbedaan
antara mutasi yang terjadi secara alami dan mutasi hasil induksi. Keduanya dapat
menimbulkan variasi genetik untuk dijadikan dasar seleksi tanaman, baik seleksi
secara alami (evolusi) maupun seleksi buatan (pemuliaan) (BATAN, 2005).
Menurut Crowder (2006) mutasi adalah suatu proses dimana suatu gen mengalami
perubahan struktur. Dalam arti luas, mutasi dihasilkan dari segala macam tipe
perubahan bahan genetik yang mengakibatkan perubahan penampakan fenotipe
yang diturunkan yang bukan dihasilkan dari proses seksual. Batasan ini termasuk
keragaman kromosom dan position effect maupun mutasi gen.
Banyak tanaman yang ditumbuhkan dengan teknik kultur jaringan tidak
sama dengan tipe tetuanya. Perbedaan ini merupakan kejadian umum yang
berhubungan dengan kultur jaringan dari sel-sel tunggal, yang disebut keragaman
somaklonal. Tanaman regeneran memperlihatkan perbedaan-perbedaan morfologi,
ketahanan penyakit dan sistem enzimnya. Teknik kultur jaringan telah digunakan
untuk mengembangkan tanaman tebu dan kentang yang tahan terhadap penyakit.
Tanaman-tanaman ini tidak selalu memiliki daya produksi lebih tinggi
dibandingkan varietas komersial, tetapi dapat digunakan sebagai tetua dalam suatu
program pemuliaan (Crowder, 2006).
Kombinasi antara teknik kultur jaringan dengan induksi mutasi dengan
sinar gamma dapat menghasilkan keragaman genetik yang lebih tinggi daripada
tanaman yang tumbuh dari biji. Sistem kultur itu sendiri sering menyebabkan
perubahan-perubahan nukleotida yang disebabkan karena zat yang terkandung
dalam medium tersebut, seperti giberelin, auksin, garam mineral, dan sebagainya
(Crowder, 2006).
Mutasi merupakan salah satu metode pemuliaan untuk meningkatkan
keragaman genetik tanaman. Dosis iradiasi yang diberikan untuk mendapatkan
mutan tergantung pada jenis tanaman, fase tumbuh, ukuran, kekerasan, dan bahan
yang akan dimutasi (Soedjono, 2003). Tabel 2 menunjukkan kelebihan dan
kekurangan penggunaan berbagai jenis jaringan yang digunakan bahan yang akan
12
dosis mutagen, makin sering terjadi mutasi dan makin sering terjadi kerusakan
gen yang tidak diharapkan (Welsh, 1991).
Tabel 2. Kelebihan dan kekurangan penggunaan berbagai jenis jaringan yang digunakan untuk mutasi (Roose dan Williams, 2007).
Jaringan target Kemudahan untuk digunakan
Waktu untuk mengevaluasi
Peluang terjadinya
khimera
Mengidentifikasi mutant
Polen Baik Lama Tidak ada Sulit
Benih Baik Lama Rendah Beragam
Kalus embriogenik Sulit Lama Rendah Mudah
Ruas batang Sulit Lebih pendek Tinggi Mudah
Mata tunas Baik Lebih pendek Tinggi Mudah
Keberhasilan radiasi untuk meningkatkan keragaman populasi sangat
ditentukan oleh radiosensitivitas genotipe yang diradiasi. Radiosensitivitas dapat
diukur berdasarkan nilai LD50 (lethal dose 50%) yaitu dosis yang menyebabkan
kematian 50% populasi bahan tanaman (Herison et al; 2008). Menurut Sutarto et
al. (2009) radiosensitivitas pada jeruk berkisar pada 40-100 Gy, tergantung pada
spesies dan varietas yang digunakan. Kosmiatin et al. (2010) melaporkan kalus
embriogenik jeruk batang bawah (JC) yang diiradiasi sinar gamma dengan dosis
0-30 Gy menunjukkan sensitivitas yang tinggi pada dosis 30 Gy.
Mutagen Sinar Gamma
Mutagen dapat dikelompokkan menjadi mutagen fisik dan kimia. Mutagen
kimia yang sering digunakan yakni ethylenscimine (EL), diethylsulphate (DES),
ethylmethane sulphonate (EMS), ethyl nitroso urea (ENH), dan methyl nitroso
urea (MNH) serta kelompok azida. Mutagen fisik yang sering digunakan adalah
sinar-X, gamma (Co60), netron cepat (Nf), dan thermal neutron (Nth) (Soedjono,
2003).
Saat ini mutagen yang paling banyak digunakan adalah sinar gamma. Sinar
gamma ditemukan tahun 1900 oleh Paul Ulrich Villard yang dapat menyebabkan
ketidakstabilan inti sel. Panjang gelombang sinar gamma lebih pendek dan energy
per photon lebih besar dari pada sinar-X, sehingga potensial untuk merubah
iradiasi menggunakan sinar ultra violet (UV) dapat digunakan, walaupun
kemampuan penetrasi ke dalam jaringan lebih rendah bila dibandingkan dengan
radiasi pengion sinar-X dan sinar gamma. Menurut Crowder (1996) sinar gamma
yang dipancarkan dari isotop radioaktif mempunyai panjang gelombang lebih
pendek dari sinar X, daya tembusnya lebih kuat, dikenal sebagai sinar kuat,
penting untuk menginduksi perubahan genetik.
Faktor yang mempengaruhi terbentuknya mutan antara lain adalah
besarnya dosis iradiasi. Dosis iradiasi diukur dalam satuan Gray (Gy), 1 Gy sama
dengan 0.10 krad yakni 1 J energy per kilogram iradiasi yang dihasilkan. Dosis
iradiasi dibagi tiga, yaitu tinggi (>10 k Gy), sedang (1-10 k Gy), dan rendah (< 1 k
Gy). Perlakuan dosis tinggi akan mematikan bahan yang dimutasi atau
mengakibatkan sterilitas. Dosis iradiasi yang diberikan untuk mendapatkan mutan
tergantung pada jenis tanaman, fase tumbuh, ukuran, kekerasan, dan bahan yang
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Penelitian dilaksanakan dari bulan Januari sampai November 2010.
Iradiasi sinar gamma dilakukan di Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi
Isotop dan Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN), Pasar Jumat,
Jakarta. Kultur in vitro dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok
Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor. Analisis stomata
dilakukan di Laboratorium Mikro Teknik, Departemen Agronomi dan
Hortikultura, IPB.
Bahan dan Alat
Eksplan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kalus embriogenik
jeruk siam steril yang berasal dari nuselus muda jeruk siam pontianak yang telah
tersedia di Laboratorum. Media dasar yang digunakan adalah media MW (Morel
dan Wetmore, 1961). Zat pengatur tumbuh dan vitamin yang menjadi perlakuan
dalam penelitian ini adalah ABA dan biotin. Bahan lain yang digunakan meliputi
ekstrak malt, alkohol, aquades, spirtus, dan agar-agar. Alat yang digunakan antara
lain Irradiator Gamma Chamber 4000 A, otoklaf, laminar air flow cabinet,
Erlenmeyer, labu takar, pipet, pH meter, stirrer, timbangan analitik, cawan petri,
pinset, sudip, gunting, bunsen, botol kultur, dan alumunium foil.
Metode Percobaan
Penelitian ini terdiri dari empat percobaan yaitu:
1. Proliferasi Kalus Embriogenik Hasil Iradiasi
Rancangan percobaan yang digunakan yaitu Rancangan Acak Lengkap
(RAL) dua faktor yaitu dosis iradiasi sebagai faktor pertama dengan dosis 0, 10,
0.05, 0.10, 0.15, 0.20, dan 0.25 mg/l. Setiap perlakuan diulang sebanyak 10 kali
sehingga terdapat 250 satuan percobaan.
Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + ε ijk Keterangan:
Yijk = respon pengamatan pengaruh dosis radiasi ke-i, konsentrasi biotin ke-j,
dan ulangan ke-k
μ = rataan umum
αj = nilai tambah pengaruh dosis radiasi ke-i
βk = nilai tambah pengaruh konsentrasi biotin ke-j
(αβ)ij = nilai tambah pengaruh interaksi dosis radiasi ke-i dengan konsentrasi biotin ke-j
εijk = galat percobaan
2. Pendewasaan Embrio Somatik
Percobaan ini adalah percobaan RAL faktorial dengan 2 faktor. Dosis
iradiasi sinar gamma sebagai faktor pertama dan konsentrasi ABA sebagai faktor
kedua dan diulang sebanyak 10 kali sehingga terdapat 250 satuan percobaan.
Percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk menentukan konsentrasi ABA yang
tepat untuk mendewasakan embrio somatik. Setiap populasi kalus yang telah
diperbanyak kemudian disubkultur ke dalam media pendewasaan embrio somatik
yaitu media MW dengan penambahan 1, 1.5, 2, dan 2.5 mg/l ABA dan pada
media MW + 500 mg/l EM dengan penambahan 0, 1, 1.5, 2, dan 2.5 mg/l ABA
selama 4 minggu untuk mendewasakan embrio somatik (pre-embrio dan globular)
menjadi fase hati, torpedo, dan kotiledon.
Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij + ε ijk Keterangan:
Yijk = respon pengamatan pengaruh dosis radiasi ke-i, konsentrasi ABA ke-j,
dan ulangan ke-k
μ = rataan umum
αj = nilai tambah pengaruh dosis radiasi ke-i
16
(αβ)ij = nilai tambah pengaruh interaksi dosis radiasi ke-i dengan konsentrasi ABA ke-j
εijk = galat percobaan
3. Perkecambahan Embrio Somatik
Rancangan yang digunakan pada percobaan ini yaitu Rancangan Acak
Lengkap faktor tunggal. Perbedaan dosis iradiasi digunakan sebagai perlakuan
dan diulang sebanyak 10 kali. Percobaan ini bertujuan untuk mengecambahkan
embrio somatik dewasa menjadi individu baru tanaman yang lengkap, mempunyai
daun dan akar (bibit somatik) atau biasa disebut dengan planlet. Embrio somatik
yang berada pada tahap kotiledon, selanjutnya dilakukan subkultur ke dalam
media MW + 500 mg/l EM + 0.5 mg/l GA3 untuk perkecambahan.
Yij = μ + αi + ε ij Keterangan:
Yij = respon pengamatan pengaruh dosis radiasi ke-i, dan kelompok ke-j
μ = rataan umum
αj = nilai tambah pengaruh dosis radiasi ke-i
εij = galat percobaan
4. Pertumbuhan Regeneran Mutan
Rancangan yang digunakan pada percobaan ini yaitu Rancangan Acak
Lengkap faktor tunggal. Regeneran mutan terseleksi digunakan sebagai perlakuan.
Benih embrio somatik (planlet) yang diperoleh dalam media perkecambahan
kemudian disubkultur kedalam media MW + 500 mg/l EM untuk pemanjangan
dan pembesaran tunas selama 4 MST.
Yij = μ + αi + εij Keterangan:
Yij = respon pengamatan pengaruh regeneran mutan ke-i, dan ulangan ke-j
μ = rataan umum
εij = galat percobaan
Pelaksanaan
Persiapan Peralatan dan Pembuatan Media
Sebelum digunakan, botol kultur yang akan diisi media dan peralatan
tanam in vitro dicuci dengan detergen, kemudian disterilkan dalam otoklaf pada
tekanan 17.5 psi dan suhu 121o C selama satu jam. Botol bekas kultur sebelumnya
yang terkontaminasi, terlebih dahulu disterilkan dalam otoklaf sebelum dicuci
dengan detergen. Laminar air flow cabinet dinyalakan satu jam sebelum
digunakan dengan blower dalam keadaan hidup. Penyemprotan alkohol 70% pada
bagian dalam laminar dilakukan agar kesterilan laminar lebih terjamin.
Setiap satu liter media dibuat dengan cara mencampurkan larutan stok
dengan jumlah volume tertentu seperti yang tercantum dalam Tabel Lampiran 1.
Gula pasir sebanyak 30 g ditambahkan pada campuran larutan stok. Aquades
ditambahkan sampai volume campuran mencapai 1 liter. Pengadukan dilakukan
dengan magnetic stirrer, dan pH campuran ditera agar mencapai nilai 5,8 dengan
menambahkan HCl 1 N atau KOH 1 N. Selanjutnya ke dalam campuran
ditambahkan 2.5 mg phytagel sebagai pemadat. Campuran dimasak dan terus
diaduk sampai mendidih. Setiap satu liter media dibuat untuk 40 botol.
Alumunium foil penutup botol diberi kode, kemudian media disterilisasi dalam
autoclave selama 20 menit. Media yang telah disterilisasi disimpan di ruang
media pada suhu 16o C.
Tahap I: Perbanyakan Kalus Embriogenik
Kalus jeruk siam Pontianak steril yang berumur 1 bulan diperbanyak
dalam media MW + 500 mg/l EM. Penanaman dilakukan pada laminar air flow
cabinet. Untuk menghindari kontaminasi, bagian dalam laminar disemprot dengan
alkohol 70% sebelum digunakan. Semua alat dan bahan yang akan digunakan
dalam penanaman juga disemprot dengan alkohol 70% sebelum dimasukkan ke
18
yang digunakan dicelupkan ke dalam alkohol 96% kemudian dibakar pada api
bunsen selama kurang lebih satu menit, sedangkan cawan petri cukup dibakar
sebentar agar kesterilannya lebih terjamin. Hal yang sama dilakukan beberapa kali
saat menanam. Penanaman dimulai dengan mengeluarkan bahan tanaman dari
dalam botol menggunakan pinset yang telah dingin, kemudian dimasukkan ke
dalam botol yang baru. Setiap botol kultur diisi 5 gerombol kalus embriogenik
dengan ukuran 0.15 – 0.20 cm. Botol ditutup kembali menggunakan alumunium
foil. Kode perlakuan dan tanggal tanam ditulis pada tutup botol. Semua kalus
dalam botol diinkubasi di ruang kultur selama 4 minggu dengan suhu 16o C,
kelembaban udara 60%, dan penyinaran selama 16 jam per hari dengan intensitas
cahaya 1000 lux.
Tahap II: Iradiasi Sinar Gamma pada Kalus Embriogenik
Kalus jeruk hasil perbanyakan yang telah berumur 4 MST diberi perlakuan
iradiasi sinar gamma di Pusat Penelitian dan Pengembangan Teknologi Isotop dan
Radiasi Badan Tenaga Nuklir Nasional, Pasar Jumat, Jakarta menggunakan
Irradiator Gamma Chamber 4000 A. Radiasi sinar gamma irradiator tersebut
bersumber dari 60Co. Botol dalam keadaan tertutup dimasukkan ke dalam tabung
irradiator. Setelah tabung ditutup, irradiator diaktifkan sehingga kalus dalam
botol terkena radiasi sinar gamma dari 60Co yang berada pada bagian dasar
irradiator. Dosis iradiasi 0, 10, 20, 30, dan 40 Gy. Laju dosis iradiasi pada saat
perlakuan adalah 0.96481 kgray/jam (96.481 krad/jam). Lama iradiasi untuk
setiap dosis iradiasi disesuaikan dengan laju dosis yang digunakan. Pada saat
iradiasi dilakukan, kalus jeruk yang mendapatkan dosis iradiasi 0 Gy sebagai
kontrol tidak diiradiasi dan tetap disimpan di ruang kultur.
Tahap III: Regenerasi Kalus Embriogenik yang Telah Diiradiasi
Kalus embriogenik yang telah diiradiasi kemudian diregenerasikan melalui
jalur embriogenesis somatik. Tahapan embriogenesis somatik pada penelitian ini
yaitu proliferasi, pendewasaan, dan perkecambahan embrio somatik, serta
Proliferasi kalus embriogenik
Setelah diiradiasi, semua kalus disubkultur termasuk kalus perlakuan dan
kontrol disubkultur pada media proliferasi kalus embriogenik yaitu MW + 500
mg/l EM dengan penambahan 0.50, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 mg/l biotin selama
empat minggu. Prosedur penanaman sama dengan prosedur penanaman saat
perbanyakan bahan tanaman. Pada penutup botol dituliskan kode perlakuan dan
tanggal tanam.
Pendewasaan embrio somatik
Kalus embriogenik yang telah membentuk sturuktur embrio somatik
primer (PEM dan fase gloubular) disubkultur ke media pendewasaan embrio
somatik yaitu media MW dengan penambahan 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg/l ABA dan
media MW + 500 mg/l EM dengan penambahan 0.0, 1.0, 1.5, 2.0, dan 2.5 mg/l
ABA selama 4 minggu. Prosedur penanaman sama dengan prosedur penanaman
saat perbanyakan bahan tanam. Pada penutup botol dituliskan kode perlakuan dan
tanggal tanam.
Perkecambahan embrio somatik
Embrio somatik yang telah dewasa (fase hati, fase torpedo, dan fase
kotiledon) kemudian dipindahkan ke media perkecambahan yaitu MW + 500 mg/l
EM + 0.5 mg/l GA3 selama 4 minggu. Setiap botol terdiri dari 5 embrio somatik
dewasa. Prosedur penanaman sama dengan prosedur penanaman saat perbanyakan
bahan tanam. Pada penutup botol dituliskan kode perlakuan dan tanggal tanam.
Pertumbuhan regeneran mutan
Embrio somatik yang telah berkecambah menjadi individu yang lengkap
kemudian dipotong batangnya lalu ditanam pada media MW + 500 mg/l EM
selama 4 minggu. Setiap botol terdiri dari satu regeneran mutan (planlet). Planlet
20
Tahap IV: Evaluasi Keragaman Genetik
Pengujian Keragaman Genetik Mutan Terseleksi dengan Menggunakan Penanda
Morfologi
Data karakter morfologi terhadap jumlah daun, bentuk daun, kedudukan
daun, dan warna daun diubah menjadi data biner dengan skoring data berdasarkan
kriteria-kriteria yang sudah ditetapkan pada setiap variabel. Bila ada nilai pada
kriteria tersebut diskor “1” atau tidak ada nilai diskor “0”.
Berdasarkan pada keragaman morfologi yang muncul, selanjutnya dihitung
matrik kesamaan antar galur mutan yang dihitung berdasarkan Dice algoritme
yang terdapat dalam paket program NTSYSpc (Numerical Taxonomy and
Multivariate Analysis System) versus 2.02 (Rohlf, 1998).
Analisis Stomata
Pengamatan stomata dilakukan di akhir pengamatan, yaitu pada 4 MST.
Stomata diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400
kali. Luas bidang pandang mikroskop pada perbesaran 400 kali adalah 0.28 mm2.
Penghitungan jumlah stomata dilakukan pada satu bidang pandang di dalam satu
preparat. Rata-rata jumlah stomata setiap perlakuan merupakan hasil rata-rata
jumlah stomata/bidang pandang dari 7 daun, kemudian hasilnya dikonversi
menjadi jumlah stomata/ mm2. Ukuran stomata diukur berdasarkan panjang dan
lebar stomata. Setiap preparat daun jeruk siam diukur satu stomata. Ukuran
stomata setiap perlakuan merupakan hasil rata-rata dari 15 stomata yang dipilih
secara acak. Selain itu diamati juga jumlah kloroplas di dalam sel penjaga. Setiap
daun mutan diamati 5 stomata untuk dihitung jumlah kloroplas di dalam sel
penjaganya.
Pengamatan
Pengamatan dilakukan setiap minggu dengan peubah yang diamati yaitu :
- Luas Kalus, pengukuran luas kalus dilakukan pada 2 dan 4 MST.
Pengukuran luas dilakukan dengan cara menghitung panjang dan lebar
kalus dari bawah botol kultur menggunakan penggaris.
- Warna Kalus, diamati secara visual
2. Percobaan Pendewasaan Embrio Somatik
- Jumlah Embrio Somatik, menghitung jumlah embrio somatik (fase
globular, fase hati, fase torpedo, dan fase kotiledon) yang tumbuh setelah 4
MST. Penghitungan dilakukan di dalam laminar dengan cara
mengeluarkan embrio dari botol kultur lalu dipindahkan ke dalam cawan
petri.
3. Percobaan Perkecambahan Embrio Somatik
- Jumlah benih somatik (planlet) yang dihasilkan.
4. Pertumbuhan Regeneran Mutan
- Tinggi planlet (cm), pengukuran planlet dilakukan setelah 4 MST pada
media pembesaran tunas (MW + 500 mg/l EM). Proses pengukuran
menggunakan penggaris dengan cara menempelkan alat ukur ke dinding
botol kultur yang dimulai dari pangkal batang hingga daun tertinggi dari
planlet.
- Jumlah daun, Jumlah daun yang tumbuh dihitung setelah 4 MST pada
media pembesaran tunas (MW +500 mg/l EM). Perhitungan berdasarkan
daun yang telah terbuka penuh yang muncul pertama kali.
- Warna daun, secara visual
- Jumlah akar, Menghitung jumlah akar yang tumbuh setelah 4 MST pada
media pembesaran tunas (MW + 500 mg/l EM).
- Bentuk daun (normal, roset)
- Bentuk ujung daun (lancip, membulat)
- Jumlah kloroplas dan stomata, pengamatan jumlah kloroplas
menggunakan mikroskop cahaya dengan pembesaran 100x10 sedangkan
pengamatan jumlah stomata menggunakan pembesaran 40x10.
- Ukuran stomata, panjang dan lebar stomata diukur menggunakan software
22
[image:33.595.79.548.78.505.2]
Gambar 2. Diagram alir percobaan.
Analisis Data
Data kuantitatif yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan uji
t-student dan uji F. Untuk membandingkan dua nilai tengah digunakan uji t-t-student
sedangkan untuk membandingkan tiga nilai tengah atau lebih digunakan uji F.
Perlakuan yang berpengaruh nyata dan sangat nyata pada uji F, diuji lanjut
menggunakan DMRT (Duncan Multiple Range Test). Untuk mengetahui
perlakuan yang menghasilkan keragaman paling tinggi, dilakukan uji keragaman
fenotipik dari masing-masing perlakuan dosis radiasi.
Keragaman fenotipik (σ2f) dihitung melalui perbandingan ragam fenotipik dengan standar deviasi ragam fenotipik (Sd σ2f) variabel yang diamati. Nilai ragam fenotipik dihitung menurut Steel & Torrie (1995) sebagai berikut:
Tahap II
Iradiasi sinar gamma (0, 10, 20, 30, 40 Gy)
Tahap III
Regenerasi
‐ Proliferasi embrio somatik (0.50, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 mg/l biotin)
‐ Pendewasaan embrio somatik (1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mg/l ABA dan 0 dan500 mg/l EM)
‐ Perkecambahan embrio somatik (MW + 500 mg/l EM + 0.5 mg/l GA3)
‐ Pertumbuhan regeneran mutan (MW + 500 mg/l EM)
Tahap IV
Evaluasi keragaman genetik
‐ Pengujian keragaman genetik berdasarkan analisis morfologi
‐ Analisis stomata
Tahap I
σ2 f
Standar deviasi ragam fenotipik (Sd σ2f) dihitung berdasarkan rumus Anderson dan Brancoft (1952) dikutip Darajat (1987) sebagai berikut:
Sd σ2f
Kriteria penilaian terhadap luas atau sempit dihitung sebagai berikut (Darajat,
1987):
Apabila σ2f > 2 Sd σ2f, berarti keragaman fenotipiknya luas Apabila σ2f < 2 Sd σ2f, berarti keragaman fenotipiknya sempit
Data biner hasil pengamatan morfologi dilakukan analisis dengan
menggunakan UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Aritmatic Means)
dengan fungsi SIMQUAL menjadi dendogram dengan menggunakan program
NTSYSpc 2.02 for windows (Rohlf, 1998). Hasil analisis tersebut dapat diketahui
hubungan kekerabatan antara tanaman yang satu dengan yang lain berdasarkan
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kondisi Umum Percobaan
Kalus jeruk siam Pontianak yang dipergunakan dalam penelitian ini yaitu
kalus yang telah tersedia di laboratorium Biologi Sel dan Jaringan, BB-Biogen.
Kalus tersebut berasal dari nuselus yang diisolasi dari buah muda jeruk siam
Pontianak yang telah berumur 30-90 hari setelah anthesis. Kalus merupakan sel
kompeten yang belum terdiferensiasi. Kalus tersebut telah berumur 5 tahun sejak
inisiasi dan dilakukan subkultur setiap satu bulan secara periodik untuk menjaga
viabilitasnya. Untuk mendapatkan kalus embriogenik yang mengandung
pre-embrio (PEM) dari jeruk siam dilakukan subkultur pada media MW + 500 mg/l
EM (Ekstrak Malt) tanpa penambahan zat pengatur tumbuh. Media ini merupakan
media yang sangat responsif terhadap pembentukan kalus embriogenik pada
tanaman jeruk siam (Husni et al., 2010).
Hasil subkultur kalus pada media yang sama setiap empat minggu
diperoleh kalus embriogenik yang ditandai dengan banyaknya PEM pada populasi
sel/kalus yang dihasilkan (Gambar 3). Kalus yang dihasilkan terlihat sangat
embriogenik dengan warna kalus putih mengkilap walaupun media yang
digunakan tidak mengandung zat pengatur tumbuh. Banyaknya jumlah PEM yang
dihasilkan diduga disebabkan oleh kondisi kalus yang diperoleh pada tahap awal
[image:35.595.134.488.534.651.2]sangat juvenil dan viable.
Gambar 3. Kalus embriogenik hasil perbanyakan (a) penampakan kalus di botol kultur, dan (b) penampakan secara mikroskopik pada perbesaran 10 kali.
Secara umum, pertumbuhan dan perkembangan eksplan setelah perlakuan
iradiasi sinar gamma menunjukkan respon yang cukup baik. Hal ini ditunjukkan
dengan tidak terjadinya kematian akibat dosis iradiasi yang diberikan. Kondisi
lingkungan di dalam ruang penyimpanan eksplan cukup terkontrol. Penyinaran
menggunakan lampu neon 20 watt selama 24 jam sehari dengan intensitas
rata-rata 1900 lux. Suhu di dalam ruangan selalu dijaga pada kisaran 16-20o C. Namun
demikian serangga seperti semut masih ada yang masuk ke dalam ruangan dan
sering hinggap diatas botol eksplan, hal ini menyebabkan resiko kontaminasi yang
dihadapi eksplan semakin tinggi akibat dari jamur dan bakteri yang dibawa oleh
serangga dapat masuk ke dalam celah botol. Gambar 4 menunjukkan kondisi
umum planlet di ruang kultur laboratorium Biologi Sel dan Jaringan BB-Biogen.
Gambar 4. Kondisi umum planlet di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, BB-Biogen.
Kontaminasi merupakan gangguan utama yang terjadi pada eksplan yang
ditanam secara in vitro. Kontaminasi pada media mengganggu pertumbuhan
eksplan bahkan dapat menyebabkan kematian. Kontaminasi disebabkan oleh
cendawan dan bakteri yang tumbuh di permukaan media atau disekeliling eksplan.
Keberadaan cendawan ditandai dengan munculnya cendawan berwarna putih,
hijau, dan hitam di permukaan media. Kontaminasi pada kultur jaringan dapat
disebabkan oleh adanya kesalahan manusia pada saat penanaman seperti spora
cendawan masuk ke dalam botol karena botol terlalu lama dibiarkan terbuka pada
saat penanaman. Gambar 5 menunjukkan eksplan kalus yang terkontaminasi
26
Gambar 5. Eksplan kalus jeruk siam Pontianak yang terkontaminasi (a) bakteri dan (b) cendawan.
Pada saat regenerasi khususnya tahap pendewasaan dan perkecambahan
embrio somatik ada beberapa embrio yang berkembang abnormal (Gambar 6)
baik pada kontrol maupun yang diberi iradiasi. Embrio abnormal tersebut tidak
membentuk salah satu fase perkembangan embrio somatik (fase globular, fase
hati, fase torpedo, atau fase kotiledon) sehingga tidak mampu beregenerasi
[image:37.595.186.439.85.274.2]menjadi tanaman yang lengkap.
Gambar 6. Embrio somatik abnormal (a) kompak, (b) roset dan kompak.
1. Proliferasi Kalus Embriogenik Hasil Iradiasi
Kalus adalah kumpulan sel yang meristematik, karena berasal dari
jaringan embriogenik yang sel-selnya masih terus membelah pada sebagian besar
kultur kalus. Meristematik menurut Hunault (1979) dalam George et al. (2008)
A B
didefinisikan sebagai kelompok dari sel isodiametrik, yaitu sel dengan meristem
atau jaringan yang berpotensi untuk pertumbuhan totipotensi. Jaringan meristem
memungkinkan pertumbuhan organ tanaman, seperti tunas dan akar, ataupun
seluruh atau sebagian tanaman lain. Embrio somatik mempunyai sifat bipolar,
dimana pada satu bagian akan tumbuh tunas dan pada bagian lainnya tumbuh
akar.
Regenerasi kalus hasil iradiasi sinar gamma yang tepat sangat
menentukan keberhasilan kalus beregenerasi menghasilkan tunas dalam jumlah
yang banyak. Kalus embriogenik harus melalui beberapa tahapan sebelum
beregenerasi menjadi tunas. Pada penelitian ini tahapan regenerasi yang dilalui
yaitu proliferasi kalus embriogenik hasil iradiasi, pendewasaan dan
perkecambahan embrio somatik, serta pertumbuhan regeneran mutan (planlet).
Proliferasi kalus embriogenik bertujuan untuk meningkatkan jumlah
embrio somatik primer (PEM dan globular) dan melihat pengaruh vitamin biotin
yang digunakan sebagai perlakuan. Vitamin disintesa pada tanaman normal untuk
kebutuhan pertumbuhan dan perkembangannya. Vitamin dibutuhkan oleh
tanaman sebagai katalis dari berbagai macam proses metabolik. Pada saat sel dan
jaringan ditumbuhkan secara in vitro, beberapa vitamin menjadi faktor pembatas
untuk pertumbuhan sel. Biotin (vitamin H) digunakan dalam jumlah sedikit pada
media kultur yang berkisar antara 0.01-1.0 mg/l (Bhojwani dan Razdan dalam
El-Shiaty, 2004). Hasil penelitian Al-Khayri dalam El-Shiaty (2004) menyatakan
bahwa pertumbuhan kalus terbaik pada kelapa pada media MS dengan
penambahan 0.5 mg/l thiamine dan 2.0 mg/l biotin. Hasil penelitian Badawy et al.
(2009) pada kultur supensi phoenix dactylifera L. Cv. Sakkoty kalus embriogenik
terbaik didapat dengan penambahan biotin dengan konsentrasi 2.5 mg/l.
Hasil uji F menunjukkan konsentrasi biotin tidak memberikan pengaruh
yang nyata terhadap perkembangan kalus. Berdasarkan rata-rata luas kalus
tertinggi setelah 2 MST terdapat pada konsentrasi 0.15 mg/l biotin (Tabel 3)
namun setelah 4 MST pertambahan luas kalus yang terbaik terdapat pada
konsentrasi 0.05 mg/l biotin (Tabel 4). Menurut George (2008) pertumbuhan
28
proliferasi masa sel kalus secara cepat dan fase dimana proliferasi masa sel kalus
bertahap menurun hingga pada akhirnya terjadi kematian pada sel kalus.
Pengaruh iradiasi sinar gamma setelah 4 minggu dapat diamati dari
perubahan warna dan pertumbuhan serta perkembangan kalus. Kalus yang
mendapat perlakuan iradiasi sebagian besar kondisinya baik dan tidak
menunjukkan gejala-gejala kerusakan. Kalus sebelum diiradiasi berwarna putih
mengkilap dan remah (friable), namun setelah iradiasi beberapa individu sel
mengalami perubahan warna seperti putih kekuningan dan kuning kecoklatan
namun struktur kalus tetap remah. Pada dosis 10 Gy beberapa populasi kalus
mengalami kecoklatan, namun setelah disubkultur selama 4 minggu terbentuk
struktur kalus baru yang embriogenik.
Berdasarkan hasil pengaruh iradiasi sinar gamma terhadap pertumbuhan
dan perkembangan kalus diperoleh bahwa respon kalus terhadap iradiasi ada yang
positif dan negatif. Hasil uji F pada taraf 5% berbeda nyata pada perlakuan dosis
iradiasi. Dosis iradiasi pada 10, 20, dan 30 Gy dapat menghambat pertumbuhan
dan perkembangan kalus. Pertumbuhan dan perkembangan kalus hasil perlakuan
iradiasi 40 Gy pada 4 MST memberikan respon yang positif yang ditandai dengan
kalus yang lebih luas dibandingkan dengan kontrol.
Tabel 3. Pengaruh dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap luas kalus jeruk siam Pontianak (cm2) pada 2 MST.
Dosis iradiasi
(Gy)
Biotin (mg/l)
Rata-rata 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
0 0.49efg 0.70bcdefg 1.15a 0.77abcdefg 0.67bcdefg 0.76ab 10 0.37g 0.38g 0.52defg 0.45fg 0.42g 0.43c 20 0.54cdefg 0.61bcdefg 0.65bcdefg 0.72bcdefg 0.73bcdefg 0.66b 30 0.89abcde 0.60cdefg 0.67bcdefg 0.93abcd 0.45fg 0.68b 40 0.96abc 0.88abcdef 0.67bcdefg 0.66bcdefg 1.05ab 0.86a Rata-rata 0.66 0.63 0.73 0.68 0.66
KK (%) ……… 57.67 ……….
Tabel 4. Pengaruh dosis iradiasi dan konsentrasi biotin terhadap luas kalus jeruk siam Pontianak (cm2) pada 4 MST.
Dosis iradiasi
(Gy)
Biotin
Rata-rata 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
0 0.76ghij 0.80ghij 2.26a 1.75abc 1.10cdefghij 1.36ab 10 0.49ij 0.66ghij 0.59hij 0.57hij 0.38j 0.54c 20 0.96defghij 1.12cdefghi 1.17cdefghi 1.22cdefghi 1.38bcdefg 1.19b 30 1.76abc 0.94efghij 1.66abcde 0.90fghij 1.67abcd 1.17b 40 1.71abc 1.57abcdef 1.09cdefghij 1.26cdefgh 1.98ab 1.52a Rata-rata 1.20 1.05 1.17 1.14 1.30
KK (%) ……… 55.90 ……….
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang berbeda berarti berbeda nyata berdasarkan uji DMRT dengan alfa 0,05
Keragaman luas kalus embriogenik jeruk siam Pontianak yang dinyatakan
oleh nilai koefisien keragaman (KK) yang tinggi dengan nilai 57.67% pada umur
2 MST dan 55.90% pada umur 4 MST. Nilai KK lebih besar dari 30%
menunjukkan adanya keragaman yang tinggi (Gomez dan Gomez, 1995). Pada
minggu ke empat setelah subkultur, sebagian embrio telah mencapai fase globular,
yaitu pada perlakuan 0 Gy pada media MW + 500 mg/l EM.
Interaksi antara dosis iradiasi sinar gamma dan konsentrasi biotin
memberikan pengaruh yang sangat nyata terhadap perkembangan kalus jeruk siam
Pontianak. Pertambahan luas kalus tertinggi pada umur 2 MST terdapat pada
perlakuan 0 Gy*0.15 mg/l biotin namun tidak berbeda nyata dengan perlakuan 40
Gy*0.25 mg/l, 40 Gy*0.05 mg/l, 30 Gy*0.20 mg/l, 30 Gy*0.05 mg/l, 40 Gy*0.10
mg/l, dan 0 Gy*0.20 mg/l (Tabel 3). Pertambahan luas kalus tertinggi pada umur
4 MST terdapat pada perlakuan 0 Gy* 0.15 mg/l biotin namun tidak berbeda nyata
dengan perlakuan 40 Gy*0.25 mg/l, 30 Gy*0.05 mg/l, 0 Gy*0.20 mg/l, 40
Gy*0.05 mg/l, 30 Gy*0.25 mg/l, 30 Gy*0.15 mg/l, 40 Gy*0.10 mg/l (Tabel 4).
Perkembangan kalus embriogenik hasil iradiasi memiliki respon yang berbeda
terhadap konsentrasi biotin yang diberikan, hal tersebut diduga disebabkan karena
terjadinya mutasi pada kalus hasil iradiasi sehingga terjadi perubahan respon
terhadap konsentrasi biotin yang diberikan pada media kultur.
30
tertinggi pada dosis iradias 0 Gy terdapat pada kalus dengan penambahan
konsentrasi 0.15 mg/l biotin namun tidak berbeda nyata dengan konsentrasi 0.2
mg/l biotin baik pada umur 2 maupun 4 MST. Hasil ini sesuai dengan yang
dilaporkan oleh El-Shiaty et al. (2004) yang menggunakan biotin dengan
konsentrasi tinggi (5 mg/l) untuk meningkatkan inisiasi dan proliferasi kalus
kelapa.
2. Pendewasaan Embrio Somatik
Untuk mendorong pertumbuhan dan perkembangan PEM dan globular
yang dihasilkan menjadi embrio somatik dewasa dilakukan pemindahan ke media
MW dengan penambahan asam absisik (ABA) untuk membantu proses
embriogenesis secara normal. Selain itu, ABA juga berfungsi sebagai pencegahan
terhadap pertumbuhan prematur pada embrio. Husni et al. (2010) melaporkan
bahwa semakin tinggi konsentrasi ABA yang terkandung dalam media kultur
maka semakin banyak embrio somatik yang dewasa.
Pada proses pendewasaan, embrio somatik berhenti berproliferasi,
ukurannya meningkat, dan mulai mengakumulasi cadangan nutrisi seperti
karbohidrat, protein dan lemak. Embrio dirangsang untuk menjadi dewasa dengan
menggunakan asam absisik (ABA) dan meningkatkan potensial osmotik
(Egerstsdotter, 1999). Menurut Renukdas et al. (2006) peningkatan efisiensi
pendewasaan embrio somatik dapat dilakukan dengan penambahan etilen
antagonis pada konsentrasi tinggi (10 µM) seperti spermidine, ABA, dan AgNO3.
Media yang digunakan untuk pendewasaan sama dengan pada tahap proliferasi,
namun dengan penambahan zat pengatur tumbuh seperti ABA, meningkatkan
potensial osmotik, dan dalam beberapa kasus digunakan auksin dan/atau sitokinin.
Sukrosa dan polyethylene glycol (PEG) biasanya digunakan untuk meningkatkan
potensial osmotik (Egerstsdotter, 1999). Dosis ABA yang tinggi (0.5 mg/l) pada
fase perkembangan embrio dapat mempercepat perkembangan embrio menjadi
fase torpedo dan kotiledon. ABA juga dapat menginduksi embriogenesis somatik
dan pendewasaan embrio somatik pada beberapa tanaman seperti wortel dan
embrio somatik (fase globular, fase hati, fase torpedo, dan fase kotiledon) pada
jeruk siam Pontianak
Dari hasil penelitian yang dilakukan tidak terjadi pendewasaan pada
embrio somatik yang diberi dosis 20, 30, dan 40 Gy pada setiap konsentrasi ABA
baik pada media kultur yang diberi EM maupun yang tidak. Kemampuan kalus
beregenerasi dipengaruhi oleh kondisi eksplan (kalus) dan komposisi media
(George, 2008). Kondisi kalus pada saat diregenerasikan telah mengalami tekanan
akibat iradiasi sinar gamma. Menurut Biswas dalam Sutjahjo et al. (2007) kalus
yang mengalami tekanan seleksi yang lebih berat akan mengalami kerusakan
fisiologi dan gangguan metabolisme. Hal inilah yang menyebabkan sulitnya
beregenerasi pada kalus yang mengalami tekanan iradiasi pada dosis 20, 30, dan
40 Gy. Sehubungan hal tersebut, embrio somatik yang digunakan pada
percobaan selanjutnya hanya yang diberi perlakuan iradiasi sinar gamma pada
dosis 0 dan 10 Gy.
[image:42.595.120.491.393.533.2].
Gambar 7. Tahap pendewasaan embrio somatik jeruk siam Pontianak, (a) fase globular, (b) fase hati, (c) fase torpedo, (d) dan fase kotiledon.
Berdasarkan hasil pendewasaan embrio somatik dengan penambahan ABA
dalam media MW diperoleh bahwa hanya struktur embrio somatik primer (PEM
dan globular) yang diiradiasi dengan dosis 10 Gy pada media dengan
pengambahan 2.5 mg/l ABA yang dapat tumbuh dan berkembang menjadi embrio
somatik dewasa (Tabel 6). Hal ini ditandai dengan adanya struktur torpedo dan
kotiledon pada media tersebut.
Untuk meningkatkan frekuensi pendewasaan embrio somatik tahap
B C
32
kultur. Penambahan EM pada media yang telah mengandung 2 mg/l dan 2.5 mg/l
ABA dapat meningkatkan frekuensi pendewasaan menjadi lebih tinggi.
Penambahan EM pada media yang telah mengandung 2 mg/l ABA menghasilkan
embrio somatik dewasa sebanyak 6 embrio somatik (1 fase hati, 3 fase torpedo,
dan 2 fase kotiledon) dan pada 2.5 mg/l ABA sebanyak 5 embrio somatik (1 fase
torpedo, dan 4 fase kotiledon) dari dosis iradiasi 0 Gy. Sedangkan penambahan
EM pada dosis iradiasi 10 Gy dengan media kultur yang telah mengandung 1.5
mg/l ABA menghasilkan 9 embrio somatik dewasa (7 fase hati, dan 2 fase
torpedo). Hal ini menandakan bahwa proembrio yang diiradiasi memiliki respon
[image:43.595.79.538.354.658.2]yang berbeda bila dibandingkan dengan kontrol.
Tabel 5. Pengaruh dosis radiasi dan konsentrasi ABA pada media pendewasaan embrio somatik (MW dan MW + 500 mg/l EM) setelah 4 MST
Dosis Radiasi
(Gray)
Konsentrasi (mg/l)
Globular Hati Torpedo Kotiledon ABA Ekstrak
Malt
0
1 0 8 - - -
1.5 0 6 - - -
2 0 12 - - -
2.5 0 16 - - -
10
1 0 8 - - -
1.5 0 13 - - -
2 0 24 - - -
2.5 0 22 - 1 4
0
0 500 4 - - - 1 500 3 - - - 1.5 500 11 - - -
2 500 19 1 3 2 2.5 500 23 - 1 4
10
0 500 0 - 1 - 1 500 3 - - - 1.5 500 12 7 2 -
2 500 15 - - - 2.5 500 9 - - -
Penambahan berbagai macam ekstrak organik pada media kultur sering
memberikan respon pertumbuhan yang diinginkan. Bahan organik kompleks
tersebut antara lain protein hidrolisat, air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak malt,
kultur jeruk. Ekstrak malt merupakan sumber karbohidrat utama yang telah
digunakan untuk menginisiasi embriogenesis pada jaringan nuselus oleh Rangan
et al. dalam Thorpe (2008). Ekstrak malt diketahui mempunyai peran dalam
multiplikasi embrio somatik pada Citrus sinensis (Das et al. dalam Thorpe, 2008),
dan pada Citrus spp. yang lain (Jumin dalam Thorpe, 2008). Ekstrak malt juga
meningkatkan efisiensi perkecambahan fase kotiledon pada sour orange (Carimi
et al dalam Thorpe, 2008). Ekstrak malt biasa digunakan pada media kultur jeruk
dengan konsentrasi 0.5 – 1 g/l (Thorpe, 2008).
3. Perkecambahan Embrio Somatik
Embrio somatik yang telah dewasa (torpedo dan kotiledon)
dikecambahkan dalam media MW + 0.5 mg/l GA3. Media tersebut merupakan
media terbaik untuk perkecambahan embrio somatik jeruk siam (Husni et al.,
