TRITERPENOID BIJI ALPUKAT (
Persea americana
) DAN
AKTIVITAS SITOTOKSIKNYA TERHADAP SEL KANKER
PAYUDARA MCF-7 DAN HATI HepG2
ANDI NUR FITRIANI ABUBAKAR
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Triterpenoid Biji Alpukat (Persea americana) dan Aktivitas Sitotoksiknya Terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7 dan Hati HepG2” adalah benar karya saya dari arahan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun di perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2016
Andi Nur Fitriani Abubakar
RINGKASAN
ANDI NUR FITRIANI ABUBAKAR. Triterpenoid Biji Alpukat (Persea americana) dan Aktivitas Sitotoksiknya Terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7 dan Hati HepG2. Dibimbing oleh SUMINAR SETIATI ACHMADI dan IRMA HERAWATI SUPARTO.
Biji alpukat (Persea americana) dikenal sebagai salah satu tanaman obat dan memiliki kandungan senyawa metabolit sekunder, yang memiliki aktivitas antioksidan, sitotoksik, dan antibakteri. Akan tetapi, upaya untuk mengidentifikasi senyawa aktif yang berpotensi sebagai antikanker dalam biji alpukat masih kurang. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan mengidentifikasi senyawa triterpenoid dari biji tersebut serta menentukan efektivitasnya dalam menghambat proliferasi sel kanker MCF-7 dan HepG2.
Simplisia diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol (14.45%). Selanjutnya ekstrak etanol dipartisi dengan n-heksana untuk menghilangkan kandungan senyawa nonpolar. Pemisahan ekstrak etanol bebas-lemak dengan kromatografi kolom gravitasi menggunakan eluen terbaik n -heksana:etil asetat (3:7) dan sistem elusi isokratik menghasilkan 8 kelompok fraksi (F1-F8). Fraksi 3 (F3) menunjukkan senyawa tunggal dan berwujud kristal yang merupakan ciri khas triterpenoid. Rekristalisasi F3 dengan n-heksana diperoleh 124 mg (4.13% dari ekstrak etanol) serbuk putih. Dari hasil identifikasi dengan pelat kromatografi lapis tipis menggunakan pereaksi Lieberman Burchard terbentuk bercak hijau di bawah sinar ultraviolet (365 nm) yang menunjukkan positif terhadap triterpenoid. Identifikasi menggunakan spektrofotometri ultraviolet, spektrofotometer inframerah transformasi fourier, dan kromatografi cair spektroskopi massa menunjukkan bahwa isolat triterpenoid memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 217 nm, memiliki gugus hidroksi, karbon ikatan rangkap (C=C) yang tidak terkonjugasi, gugus C=O karboksilat, gugus metilena (-CH2), gugus metil (-CH3) dan gem dimetil dengan bobot molekul 505 g/mol dan diduga triterpenoid sikloartana. Hasil uji 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazolium bromida menunjukkan bahwa isolat triterpenoid dapat menghambat proliferasi sel kanker MCF-7 dan HepG2 dengan nilai IC50 berturut-turut 62.43 g/mL dan 12.03 g/mL serta aman terhadap sel normal. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa triterpenoid dari biji alpukat memiliki potensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai agen antikanker.
SUMMARY
ANDI NUR FITRIANI ABUBAKAR. Triterpenoid of Avocado (Persea americana) Seed and Its Cytotoxic Activity toward Breast MCF-7 and Liver HepG2 Cancer Cells. Supervised by SUMINAR SETIATI ACHMADI and IRMA HERAWATI SUPARTO.
Avocado (Persea americana) seed is recognized as one of medicinal plants. It contains several secondary metabolites, which has antioxidant, cytotoxic, and antibacterial activities. However, efforts to identify its potential active compounds as anticancer are still relatively rare. Therefore, the purpose of this study was to determine the structure of triterpenoid isolated from avocado seeds and the cytotoxic effect on MCF-7 and HepG2 cells.
Extraction was carried out by maceration technique using ethanol, giving 14.45% yield. The crude extract was partitioned using n-hexane to eliminate the lipid constituents. The ethanol extract was further fractionated by column chromatography with n-hexane:ethyl acetate (3:7) and isocratic elution system yielded 8 main fractions (F1 to F8). Fraction 3 (F3) showed a single spot indicating triterpenoids characteristics. Repeated purification of F3 gave 124 mg (4.13% from ethanol extract) white solid. Identification on thin layer chromatography under Lieberman-Burchard reagent detection produced a green spot under ultraviolet light (365 nm), which was positive for triterpenoid. Identification of the isolate using ultraviolet-visible, Fourier infrared spectrophotometers, and liquid chromatography-mass spectrometer showed that the isolate has a maximum absorption at wavelength of 217 nm, a hydroxyl group, an unconjugated carbon-carbon double bond (C=C), carboxylate group (C=O), methylene group (-CH2), a methyl group (-CH3), and gem-dimethyl with a molecular weight of 505 g/mole. The isolated compound was suspected as cycloarthane triterpenoid. The result of a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay showed that the triterpenoid isolate inhibited cell proliferation of MCF-7 and HepG2 cell lines with IC50 values of 62 g/mL and 12 g/mL, respectively, meaning its potential for further development as an anticancer agent.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
TRITERPENOID BIJI ALPUKAT (
Persea americana
) DAN
AKTIVITAS SITOTOKSIKNYA TERHADAP SEL KANKER
PAYUDARA MCF-7 DAN HATI HepG2
ANDI NUR FITRIANI ABUBAKAR
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains
pada
Program Studi Kimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan September 2015 ini ialah Triterpenoid Biji Alpukat (Persea americana) dan Aktivitas Sitotoksiknya Terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7 dan Hati HepG2.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Ir Suminar S Achmadi, PhD dan Dr dr Irma H Suparto, MS selaku pembimbing, bapak Sabur, semua rekan calon peneliti di Laboratorium Kimia Organik, serta rekan-rekan mahasiswa Program Studi S-2 Kimia yang telah banyak membantu dalam menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada Etta, Ibu, saudara-saudariku dan teman-teman atas segala doa dan kasih sayangnya. Sebagian dana riset ini didukung oleh Lembaga Pengelola Dana Pendidikan dan untuk itu penulis mengucapkan penghargaan.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2016
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL ix
DAFTAR GAMBAR ix
DAFTAR LAMPIRAN ix
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
2 METODE PENELITIAN 2
Bahan dan Alat 2
Waktu dan Tempat Penelitian 3
Prosedur 3
3 HASIL DAN PEMBAHASAN 5
Identitas dan Kadar Air Simplisia 5
Kandungan Triterpenoid 5
Kandungan Fitokimia Ekstrak Etanol 6
Isolat Triterpenoid 6
Ciri Senyawa Triterpenoid 7
Sitotoksisitas terhadap Sel Vero, Sel MCF-7, dan Sel HepG2 11
4 SIMPULAN DAN SARAN 12
Simpulan 12
Saran 12
DAFTAR PUSTAKA 13
LAMPIRAN 16
DAFTAR TABEL
1 Kandungan fitokimia ektrak etanol biji alpukat 6 2 Hasil KKG ekstrak etanol dengan eluen n-heksana:etil asetat (3:7) di
bawah sinar UV pada λ 365 nm setelah disemprot pereaksi LB 7 3 Perbandingan hasil spektrum FTIR senyawa isolat biji alpukat dengan
senyawa triterpenoid 10
4 Nilai IC50 bahan uji terhadap sel MCF-7 dan HepG2 12
DAFTAR GAMBAR
1 Hasil uji fitokimia triterpenoid pada serbuk biji dan ekstrak etanol 6 2 Spektrum UV isolat dari ekstrak etanol biji alpukat dalam metanol 8 3 Spektrum FTIR isolat dari ekstrak etanol biji alpukat 9
4 Struktur kimia sikloartana 9
5 (a) Kromatogram isolat dari ekstrak etanol biji alpukat, (b) spektrum massa isolat dengan waktu retensi 19.00 menit 10
DAFTAR LAMPIRAN
1. Bagan kerja penelitian 17
2. Hasil determinasi tanaman alpukat 18
3. Kadar air simplisia 19
4. Rendemen ekstrak etanol biji alpukat 19
6 KLT 8 kelompok fraksi hasil KKG ekstrak etanol dengan eluen n
-triterpenoid terhadap sel Vero 20
9 Perhitungan IC50 untuk sel kanker payudara MCF-7 21 10 Perhitungan IC50 untuk sel kanker hati HepG2 22 11 Morfologi sel MCF-7 dan HepG2: sel MCF-7 normal (a), sel MCF-7
1
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman alpukat (Persea americana) merupakan salah satu anggota
Lauraceae yang banyak tumbuh di Indonesia. Hampir semua bagian tanaman ini banyak dimanfaatkan masyarakat dalam pengobatan tradisional. Salah satu bagian yang menarik dari tanaman alpukat adalah bijinya. Masyarakat Malino Sulawesi Selatan memanfaatkan biji alpukat sebagai obat herbal seperti sakit maag, sakit gigi, dan mengatasi diabetes mellitus. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa biji alpukat mengandung senyawa metabolit sekunder yang termasuk ke dalam kelas alkaloid, triterpenoid, tanin, flavonoid, saponin (Marlinda et al. 2012), dan polifenol (Kosinska et al. 2012) yang umumnya memiliki efek farmakologis. Soong et al. (2004) melaporkan bahwa ekstrak etanol biji alpukat memiliki aktivitas antioksidan secara in vitro. Kristanty et al. (2014) mengungkap ada aktivitas sitotoksik ekstrak etanol biji alpukat terhadap sel kanker payudara T47D. Pada penelitian lain juga dilaporkan bahwa ekstrak biji alpukat dapat menurunkan jumlah bakteri Mycobacterium tuberculosis (Jimenez et al. 2013), Proteus mirabilis, dan Aerobacter aerogenes (Dewi dan Sulistyowati 2013). Aktivitas antioksidan, sitotoksik, dan antibakteri tersebut mengindikasikan senyawa metabolit sekunder pada biji alpukat berpotensi sebagai antikanker.
Triterpenoid merupakan golongan senyawa yang banyak dilaporkan memiliki aktivitas antikanker. Berbagai penelitian in vitro terhadap aktivitas sitotoksik triterpenoid telah dilakukan. Seperti yang dilaporkan Hu et al. (2014), Liang et al. (2010), dan Ding et al. (2009), senyawa golongan triterpenoid mempunyai aktivitas sitotoksik dalam melawan sel kanker paru-paru A549, kolon HCT15, leukemia HL-60, hati HepG2, payudara MCF-7, HeLa, getah lambung SGC-7901, dan kulit SK-MEL-2. Adapun mekanisme kerja triterpenoid adalah dengan cara merusak permeabilitas membran mitokondria pada sel atau menyebabkan sel mengalami nekrosis dan kematian (Zakaria et al. 2011).
2
Perumusan Masalah
Beberapa penelitian melaporkan bahwa biji alpukat memiliki aktivitas sebagai antioksidan, sitotoksik, dan antibakteri. Penelitian sebelumnya juga menunjukkan bahwa fraksi etil asetat dari ekstrak etanolnya mengandung triterpenoid yang bersifat toksik. Mengingat aktivitasnya tersebut maka biji alpukat berpotensi pula sebagai antikanker. Akan tetapi, penelitian terkait biji alpukat lebih sering dilaporkan menggunakan ekstrak kasar atau fraksinya sehingga sebagian besar senyawa bioaktif dari biji alpukat belum diketahui. Informasi tentang potensi kandungan triterpenoid diharapkan dapat dijadikan bahan kajian lebih lanjut untuk pemanfaatan senyawa-senyawa kimia sebagai agen antikanker. Sehubungan dengan itu, perlu diidentifikasi senyawa triterpenoid biji alpukat serta ditentukan sitotoksisitasnya terhadap sel kanker yang dominan terjadi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi senyawa triterpenoid dari biji alpukat serta menentukan sitotoksisitasnya terhadap sel kanker payudara MCF-7 dan sel kanker hati HepG2.
Manfaat Penelitian
Hasil kajian ini diharapkan berkontribusi pada pengembangan biji alpukat sebagai agen antikanker dan landasan yang lebih kuat mengenai khasiat ekstrak etanolnya.
2 METODE PENELITIAN
Bahan dan Alat
Simplisia yang digunakan adalah biji alpukat yang dikumpulkan dari Malino, kabupaten Gowa, Sulawesi Selatan. Reagen kimia meliputi 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazolium bromida (MTT) (Sigma), Dulbecco’s
Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Gibco), Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) (Gibco), dan doksorubisin. Sel uji berupa sel Vero (ATCC CCL -81), sel MCF-7 (ATCC HTB-22), dan sel HepG2 (ATCC HB- 8065). Ketiga jenis sel tersebut adalah koleksi Pusat Studi Satwa Primata (PSSP) Lembaga Penelitian dan Pengabdian Masyarakat IPB.
3
kolom gravitasi (KKG), kromatografi cair-spektromerti massa (LC-MS) merek Waters Acquity.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai September 2015 sampai April 2016 di Laboratorium Kimia Organik Departemen Kimia Institut Pertanian Bogor (IPB), Laboratorium Bersama Departemen Kimia IPB, Laboratorium Pusat Studi Satwa Primata IPB, Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka IPB, dan Laboratorium Kesehatan Daerah DKI Jakarta.
Prosedur
Penyiapan simplisia
Sampel biji alpukat yang digunakan dideterminasi terlebih dahulu di Laboratorium Herbarium Bogoriens, Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Bogor. Sampel dibersihkan, diiris tipis, dan dikeringkan pada suhu ruang. Biji alpukat digiling menjadi ukuran 60 mesh yang selanjutnya disebut simplisia. Penentuan kadar air
Cawan porselin dipanaskan di dalam oven pada suhu 105 °C selama 2 jam, kemudian dinginkan dalam eksikator dan ditimbang bobotnya. Sebanyak 1 g simplisia dimasukkan ke dalam cawan tersebut kemudian dipanaskan di dalam oven pada suhu 105 ºC. Cawan yang berisi sampel didinginkan dalam eksikator selama 30 menit, kemudian ditimbang. Pemanasan dan penimbangan simplisia dilakukan secara berulang hingga diperoleh bobot tetap (AOAC 2006). Persentase kadar air dihitung berdasarkan persamaan berikut:
4
Eluen terbaik ditentukan dengan teknik kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan berbagai pelarut, yaitu n-heksana, kloroform, etil asetat, etanol, dan metanol. Eluen dikombinasikan untuk memperoleh eluen terbaik sehingga menghasilkan noda terbanyak dengan pola pemisahan yang terbaik (Moghadamtousi et al. 2014). Noda hasil elusi diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 365 nm. Keberadaan senyawa triterpenoid dalam ekstrak dideteksi dengan cara menyemprotkan reagen Liebermant-Buchard (LB) pada pelat KLT kemudian dipanaskan pada suhu 110 oC selama 10 menit (Nikam
et al. 2013). Golongan senyawa triterpenoid pada pelat KLT setelah disemprot dengan reagen LB ditunjukkan dengan terbentuknya noda berwarna biru kehijauan di bawah lampu UV 365 nm (Khilf et al. 2015).
Ekstrak etanol (3 g) hasil partisi difraksionasi menggunakan kromatografi kolom gravitasi (KKG) dengan eluen terbaik. Fraksionasi dilakukan menggunakan kromatografi kolom dengan diameter 2 cm dan tinggi 30 cm dengan fase diam berupa silika gel Merck 60 (0,063-0,2 mm) dan fase gerak n -heksana:etil asetat (3:7) dengan sistem elusi isokratik. Eluat ditampung setiap 10 mL dalam vial dan pola pemisahannya dipantau menggunakan KLT. Eluat yang menghasilkan jumlah dan pola noda yang sama digabungkan menjadi satu fraksi Selanjutnya eluat diuapkan pada suhu kamar. Fraksi yang memperlihatkan tanda-tanda kristal kemudian dicuci dengan n-heksana. Senyawa yang diperoleh diuji tingkat kemurniannya dengan uji kelarutan, KLT sistem eluen. Kristal selanjutnya ditentukan titik lelehnya.
Pencirian Triterpenoid
Isolat triterpenoid dicirikan dengan pembacaan spektrum UV, spektrum inframerah, dan LC-MS.
Uji Sitotoksisitas Terhadap Sel Vero, MCF-7, dan HepG2
Kultur Sel. Kultur sel yang digunakan dalam uji ini terdiri atas 3 jenis, disentrifugasi pada kecepatan 150 rpm selama 5 menit. Supernatan yang diperoleh dibuang dan pelet (sel) ditambah dengan 5 mL media. Setelah itu, dilakukan perhitungan jumlah sel menggunakan hemasitometer. Sel dihitung hingga tiap
sumur ditumbuhkan 5000 sel dalam 100 L kultur sel tiap sumur sebanyak λ6
sumur. Kultur sel diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 oC (ATCC 2014).
5
sampel dengan deret konsentrasi tertentu dimasukkan ke dalam masing-masing sumur, kemudian diinkubasi selama 48 jam dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 °C (CCRC 2009). Kontrol positif yang digunakan adalah deoksorubisin.
Uji MTT. Setelah diinkubasi selama 48 jam, ke dalam materi uji dimasukkan garam tetrazolium (MTT) 5 mg/mL sebanyak 10 L dalam tiap sumur sehingga warna campuran menjadi kuning. Tahap berikutnya ialah inkubasi selama 4 jam dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37 oC. Setelah diinkubasi dan telah terbentuk kristal formazan, larutan ekstrak dibuang. Kristal formazan yang
terbentuk dilarutkan dengan 100 L etanol λ6% pada tiap sumur, digoyang secara
stabil selama 10 menit. Warna larutan menjadi ungu. Nilai absorbans dari formazan yang terbentuk diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 595 nm (CCRC 2009).
Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas MTTberupa nilai absorbans pada tiap sumur, kemudian nilai tersebut dikonversi menjadi nilai persen inhibisi dengan menggunakan rumus:
% nhibisi bsorban kontrol bsorban kontrol bsorban sampel 100%
3 HASIL DAN PEMBAHASAN
Identitas dan Kadar Air Simplisia
Determinasi sampel di Herbarium Bogoriense menunjukkan bahwa biji alpukat adalah Persea americana Mill (Lampiran 2). Sampel yang sudah dijadikan serbuk 60 mesh memiliki kadar air 9.46% (Lampiran 3). Data kadar air ini selanjutnya digunakan untuk faktor koreksi bobot dalam perhitngan rendemen.
Kandungan Triterpenoid
6
Ekstrak etanol biji alpukat positif mengandung golongan senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, flavanoid, fenol, saponin, tanin, dan triterpenoid (Tabel 1). Hasil ini sesuai dengan uji fitokimia yang dilakukan Torres et al. (2014) dan Zuhrotun (2007). Namun, ini berbeda dengan uji fitokimia yang dilakukan oleh Kristanty et al. (2014) yang melaporkan bahwa ekstrak etanol biji alpukat mengandung golongan senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, flavanoid, saponin, dan polifenol sedangkan triterpenoid tidak terdeteksi dalam ekstrak. Faktor umum yang dapat mempengaruhi uji fitokimia antara lain perbedaan tempat tumbuh dan iklim yang menyebabkan proses metabolisme berbeda (Sari 2013).
Tabel 1 Kandungan fitokimia ekstrak etanol biji alpukat
Golongan Warna Pengamatan
Fenolik Hijau pekat +
Flavonoid Kuning +
Saponin Muncul busa +
Tanin Hitam kehijauan +
Triterpenoid Ungu pekat +
Steroid - -
Alkaloid Cokelat (pereaksi Wagner) + Kuning (pereaksi Dragendroff) - Keterangan: + = Hasil positif
- = Hasil negatif
Isolat Triterpenoid
Rendemen ekstrak kasar etanol yang diperoleh setelah dikoreksi kadar air adalah 14.45% (Lampiran 4). Nilai rendemen yang diperoleh lebih tinggi dibandingkan laporan Zuhrotun (2007), yaitu 11.52%. Banyaknya rendemen bergantung pada sifat kelarutan komponen bioaktifnya (Prabowo 2009).
7
pola noda triterpenoid yang menunjukkan pemisahan yang baik. Dari hasil fraksionasi tersebut diperoleh eluat dalam 51 vial. Pola pemisahan eluat tersebut diamati menggunakan KLT. Eluat yang memiliki pola pemisahan yang sama digabungkan dalam 1 fraksi, sehingga diperoleh 8 kelompok fraksi (Lampiran 5). Setiap kelompok fraksi yang diperoleh diuji kandungan triterpenoidnya menggunakan pereaksi LB (Tabel 2).
Tabel 2 Hasil KKG ekstrak etanol dengan eluen n-heksana:etil asetat (3:7) di
bawah sinar UV pada λ 365 nm setelah disemprot pereaksi LB. Fraksi Bobot senyawa golongan triterpenoid. Golongan senyawa triterpenoid pada pelat KLT setelah disemprot dengan pereaksi LB ditunjukkan dengan terbentuknya noda berwarna biru kehijauan (Wagner dan Bladt 1996), hijau tua sampai ungu tua (Bawa 2009), merah ungu dan ungu (Rita 2010) di bawah lampu UV 365 nm. Namun fraksi yang dianalisis lebih lanjut adalah fraksi C, karena hanya menunjukkan 1 noda senyawa, terbentuk padatan putih kekuningan yang merupakan ciri khas triterpenoid, dan memiliki nilai Rf yang mirip dengan penelitian Abubakar (2013). Oleh karena itu fraksi C direkristalisasi dengan pelarut n-heksana dan diperoleh serbuk putih sebanyak 124 mg (4.13% dari ekstrak etanol) yang larut baik dalam pelarut etanol.
Identifikasi dengan pelat KLT menggunakan pereaksi LB membentuk bercak biru kehijauan (Lampiran 6). Hal ini menunjukkan bahwa isolat merupakan golongan triterpenoid (Wagner dan Bladt 1996). Uji kemurnian isolat dianalisis dengan KLT menggunakan sistem eluen n-heksana:etil asetat (5:5), etil asetat:diklorometana (5:5), dan diklorometana:etanol (5:5). Hasil uji menunjukkan isolat telah murni karena menghasilkan noda tunggal dengan Rf dari masing-masing eluen adalah 0.57, 0.52, dan 0.83. Titik leleh serbuk putih yang diperoleh adalah 58–60 oC dengan trayek titik leleh tidak lebih dari 2 oC yang mengindikasikan bahwa senyawa relatif telah murni. Uji kelarutan menunjukkan bahwa isolat tidak larut dalam n-heksana, sedikit larut dalam etil asetat, dan larut baik dalam etanol.
Ciri Senyawa Triterpenoid
8
serapan maksimum pada panjang gelombang 217 nm dengan nilai absorbans 0.568 (Gambar 2). Serapan maksimum pada 217 nm menandakan ada eksitasi
elektron dari π ke π*. Puncak serapan pada spektrum UV ini khas untuk senyawa
triterpenoid yang memiliki kromofor berupa ikatan rangkap (C=C) yang tidak terkonjugasi (Zetra dan Prasetya 2007). Menurut Xe (2010), serapan maksimum pada panjang gelombang 210 nm sampai 230 nm diduga termasuk triterpenoid sikloartana.
Gambar 2 Spektrum ultraviolet isolat dari ekstrak etanol biji alpukat dalam metanol
Identifikasi gugus fungsi pada isolat dengan FTIR dilakukan menggunakan pelet KBr pada bilangan gelombang 400-4000 cm-1 (Gambar 3). Spektrum FTIR menunjukkan ada pita serapan pada bilangan gelombang 3428.9 cm-1; 2920.3 cm -1
9
spektrum FTIR triterpenoid sikloartana yang diisolasi dari Abies recurvata (Li et al. 2012) (Tabel 3). Struktur dasar triterpenoid sikloartana dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 3 Spektrum spektrofotometer inframerah Fourier isolat dari ekstrak etanol biji alpukat
CH3
C
H3
C
H3
H
CH3
CH3
H
H O
H
C
H3 CH3
10
1710.88 1710 C=O karboksilat
1641.35 1637 C=C
1468.47 1461 C-H pada CH2
1382.38 1367 C-H pada CH3
a
Li et al. 2012
Bobot molekul dari isolat dianalisis dengan rangkaian alat LCMS dengan kondisi operasional sebagai berikut: detektor photodiede-array yang dihubungkan ke detektor tandem quadrupole, kolom pemisahan menggunakan Water AccQTag Ultra (2.1 mm 100 mm, 1.7 m), mode ionisasi elektrospray (ESI), sumber ESI dioperasikan menggunakan mode ionisasi positif (+1) pada 150 oC, fase gerak (A) campuran akuabides + asam formiat dan (B) asetonitril, volume injeksi 1 L, suhu kolom 55 oC, laju alir 0.7 mL/menit, dan waktu analisis 45 menit. Analisis data dan kuantisasi dilakukan menggunakan peranti lunak Waters MassLynx dan QuanLynx.
Pemisahan menggunakan kromatografi cair menunjukkan satu puncak dengan intensitas tinggi dengan waktu retensi 19.00 menit (Gambar 5a). Namun, terlihat masih ada sedikit pengotor sehingga dapat dikatakan isolat belum murni. Puncak dominan tersebut selanjutnya dianalisis menggunakan spektrometri massa. Pada spektrum massa tampak bahwa puncak tersebut mempunyai massa 506 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00
11
(b)
Gambar 5 (a) Kromatogram isolat dari ekstrak etanol biji alpukat, (b) Spektrum massa isolat dengan waktu retensi 19.00 menit
Sitotoksisitas terhadap Sel Vero, Sel MCF-7, dan Sel HepG2
Sitotoksisitas bahan uji (ekstrak etanol, fraksi C, isolat) dalam penelitian ini diujikan terhadap sel Vero dan sel MCF-7. Sel Vero digunakan untuk mengevaluasi berapa tinggi aktivitas toksisitasnya terhadap sel normal guna menentukan tingkat keamanan penggunaaan bahan uji sebagai obat dari bahan alam. Konsentrasi setiap bahan uji diujikan dengan deret konsentrasi 200, 150, 100, 50, 25, dan 12.5 g/mL menggunakan uji MTT terhadap sel Vero. Hasil uji toksisitas ketiga bahan uji menunjukkan bahwa batas konsentrasi yang aman untuk ekstrak etanol biji alpukat terhadap sel normal adalah 100 g/mL, sedangkan fraksi dan isolat adalah 12.5 g/mL (Lampiran 7). Konsentrasi yang lebih tinggi dapat menghasilkan nilai penghambatan di atas 50% yang memiliki toksisitas tinggi terhadap sel normal sehingga tidak digunakan untuk pengujian terhadap sel kanker (Senthilraja et al. 2015). Hal ini karena meski nilai penghambatannya tinggi terhadap sel kanker tetapi bersifat toksik dan dapat merusak sel normal.
Bahan uji dengan konsentrasi yang aman terhadap sel normal selanjutnya diujikan terhadap sel kanker payudara MCF-7. Hasil uji ekstrak etanol, fraksi C, dan isolat terhadap sel MCF-7 yang dinyatakan dengan nilai IC50 secara berurut adalah 99.74 µg/mL, 80.05 µg/mL, dan 62.43 µg/mL dengan kontrol positif doksorubisin 4.2 x 10-4 g/mL. Nilai IC50 kurang dari 100 µg/mL menunjukkan adanya potensi bahan uji sebagai agen kemoprevensi (Meiyanto et al. 2008). Walaupun demikian hasil yang diperoleh belum sebaik kontrol positif doksorubisin pada sel kanker payudara MCF-7. Berdasarkan nilai IC50, ketiga bahan uji meningkat aktivitas sitotoksiknya terhadap sel kanker MCF-7, artinya pemurnian komponen senyawa akan meningkatkan keaktifan molekulnya sebagai antikanker terhadap sel MCF-7. Dengan demikian, isolat lebih berpotensi untuk
Sample
m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
12
dikembangkan sebagai agen kemoterapi untuk menghambat pertumbuhan tumor dan kanker. Dari uji isolat terhadap sel kanker lain, yaitu sel HepG2, diperoleh nilai IC50 12.03 µg/mL. Nilai IC50 isolat tersebut sesuai dengan standar National
Cancer Institute (NCI) Amerika yang menyatakan bahwa standar efektivitas komponen bioaktif untuk melawan sel kanker harus lebih rendah dari 30 µg/mL. Dengan nilai IC50 yang sangat rendah, isolat triterpenoid dari biji alpukat memiliki potensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai agen antikanker hati. Hasil penelitian ini mendukung penelitian yang dilakukan Hu et al. (2014), melaporkan enam senyawa triterpenoid bersifat toksik pada sel MCF-7 dengan nilai IC50 berkisar antara 78.7 dan 85.8 µg/mL dan mampu menghambat pertumbuhan sel yang lebih tinggi pada sel HepG2 dengan nilai IC50 berkisar antara 7.5 dan 9.5 µg/mL.
Tabel 4 Nilai IC50 bahan uji terhadap sel MCF-7 dan HepG2 IC50
Keterangan:*Potensi antikanker berdasarkan National Cancer Institute (NCI) Amerika, Aktif (IC50<30 g/mL), moderat aktif (30 g/m ≤ C50< 100 g/mL), tidak aktif (IC50≥100 g/mL)
4 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Berdasarkan analisis spektrum UV, FTIR, LCMS, serta pengujian dengan pereaksi LB, isolat dari ekstrak etanol biji alpukat menunjukkan keberadaan triterpenoid yang mempunyai bobot molekul 505 g/mol dan diduga sebagai sikloartana. Hasil uji sitotoksik terhadap sel kanker manusia menunjukkan bahwa isolat triterpenoid tersebut memiliki aktivitas penghambatan proliferasi sel kanker MCF-7 dan HepG2 yang tergolong moderat aktif dan aktif.
Saran
13
DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical Chemists. 2006. Official Methods of Analysis. Ed ke-14. Arlington.
[ATCC] American Type Culture Collection. 2014. A549 (ATCC-CCL185).
ATCC [internet]. [diunduh pada 2014 September 22]. Tersedia pada: www.atcc.org/Products/All/CCL-185.
[CCRC] Cancer Chemoprevention Research Center. 2009. Prosedur Tetap Uji Sitotoksik Metode MTT. Yogyakarta (ID): Fakultas Farmasi, UGM.
[NCI] National Cancer Institute (US) 2012. Cancer Treatment. NCI [internet].
[diunduh pada 2016 Mei 9]. Tersedia pada:
www.cancer.gov/cancertopics/treatment.html.
Abubakar ANF. 2013. Isolasi senyawa aktif ekstrak etanol biji alpukat (Persea americana Mill.) dan uji toksisitas terhadap Artemia salina Leach. [Skripsi] Makassar (ID):UIN Makassar.
Bawa IG. 2009. Isolasi dan identifikasi golongan senyawa toksik dari daging buah pare (Momordica charantia). J Kimia. 3(2):1907-9850.
Dewi SR, Sulistyowati. 2013. Penggunaan ekstrak biji buah alpukat (Persea americana Mill.) sebagai antibakteri Proteus mirabilis dan Aerobacter aerogenes. Stigma. 6(2):31-34.
Ding Q, Yang LX, Yang HW, Jiang C, Wang YF, Wang S. 2009. Cytotoxic and antibacterial triterpenoids derivatives from Clematis ganpiniana. J Ethnopharmacol. 126:382-385.doi:10.1016/j.jep.2009.09.028.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Bandung (ID): Penerbit ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. Ed ke-2.
Hu J, Song Y, Liu H, Yang B, Mao X, Zhao YM, Shi X. 2014. Cytotoxic and anti–inflammatory tirucallane triterpenoids from Dysoxylum binectariferum.
Fitoterapia. 99:86-91.doi.org/10.1016/j.fitote.2014.09.010.
Jimenez-Arellanes A, Luna-Herrera J, Ruiz-Nicolar R, Cornejo-Garrido J. 2013. Antiprotozoal and antimycobacterial activities of Persea americana seeds.
BMC Complement Altern Med. 13(109):1-5.
Khlif I, Jellali K, Michel T, Halabalaki M, Skaltsounis AL, Allouche N. 2015. Characteristics, phtochemical analysis and biological activities of extracts from tunisian chetoui Olea europea variety. J Chem. 418731: 1-11.
Kosinska A, Karamac M, Estrella I, Hernandez T, Bartolome B, Dykes GA. 2012. Phenolis compound profiles and antioxidant capacity of Persea americana
Mill. peels and seeds of two varieties. J Agric and Food Chem. 60:4613-4619.doi.org/10.1021/jf30090p.
Kristanty ER, Suriawati J, Sulistiyo J. 2014. Cytotoxic activity of avocado seeds extracts (Persea americana Mill.). Int Res J Pharm. 5(7):557-559.
Li YL, Gao YX, Yang XW, Jin HZ, Ye J, Simmons L, Wang N, Steinmetz A, Zhang WD. 2012. Cytotoxic triterpenoids from Abies recurvata.
Phtochemistry. 81:159-164.doi.org/10.1016/j.phtochem.201.05.032.
14
anticancer activities. Bioorg Med Chem. 20:7110– 7115.doi.10.1016/j.bmcl.2010.09.074. dan uji toksisitas ekstrak etanol biji buah alpukat (Persea americana Mill.).
J MIPA Unsrat. 1(1):24-28.
Mathias L, Vieira IJ, Braz-Filho R, Filho ER. 2000. A new pentacyclic triterpenoid isolated from Myroxylon balsamum. J Braz Chem Soc. 11(2):195-198.
Meiyanto E, Susidarti RA, Handayani S, Rahmi F. 2008. Ekstrak etanol biji buah pinang (Areca catchu) mampu menghambat prooliferasi dan memacu apoptosis sel MCF-7. J Pharm. 19(1):12-18.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL. 1982. Brine Shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituents. J Plan Medic. 45:31-34.
Moghadamtousi SZ, Karimian H, Rouhollahi E, Paydar M, Fadaeinasab M, Kadir HA. 2014. Annona muricata leaves induce G1 cell cycle arrest and apoptosis through mitochondria-mediated pathway in human HCT-116 and HT-29 colon cancer cells. J Ethnopharmacol. 156:277-289.
Mpetga JD, He HP, Hao XJ, Leng Y, Tane P. 2014. Futher cycloartane and friedelane triterpenoids from the leaves of Caloncoba glauca.
Phytochemistry. 7:52-56.doi:10.1016/j.phytol.2013.09.015.
Nikam PH. Kareparamban JA, Jadhav AP, Kadam VJ. 2013. Development and validation of high-performance thin layer chromatographic method for ursolic acid in Malus domestica Peel. Indian J Pharm Sci. 75(4): 486-489. Prabowo TT. 2009. Uji aktivitas antioksidan dari keong matah merah (Cerithidea
obtusa). [Skripsi] Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Rita WS. 2010. Isolasi, Identifikasi, dan uji aktivitas antibakteri senyawa golongan triterpenoid pada rimpang temu putih (Curcuma zedoaria Berg.). J Kimia MIPA Udayana. 4(1):20-26.
Sari MK. 2013. Uji aktivitas antikanker ekstrak kemedangan pohon penghasil gaharu hasil inokulasi. [Skripsi] Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Senthilraja P, Kathiresan K. 2015. In vitro cytotoxicity MTT assay in Vero, HepG2, and MCF-7 cell lines study of Marine Yeast. J Appl Pharm Sci. 5(3): 080-084.
Soong YY, Barlow PJ. 2004. Antioxidant activity and phenolic content of selected fruit seeds. JFood Chem. 88(3):411-417.
Torres RC, Garbo AG, Walde RZM. 2014. Lavicidal activity of Persea americana Mill. againts Aedes aegypti. Asia Pac J Trop Med. 7(1):S167-S170.
Wagner H, Bladt S. 1996. Plant drug analysis a thin layer chromatography atlas second edition. Springer Private Limited India.
Xe-Min L. 2012. Chemical constituents of Aglaia exima. [Disertasi] Kualalumpur (ID): Universitas Malaya.
15
Zakaria ZA, Mohamed AM, Jamil NS, Rofiee MS, Somchit MN, Zuraini A, Arifah AK, Sulaiman MR. 2011. In vitro cytotoxic and antioxidant properties of the aqueous, chloroform and methanol extracts of
Dicranopteris linearis leaves. AfrJBiotechnol. 10(2):273-282.
Zetra Y, Prasetya P. 2007. Isolasi senyawa -amirin dari tumbuhan Beilschmiedia roxburghianan (medang) dan uji bioaktivitasnya. Akta Kimindo. 3(1):27-32. Zhang Y, Adelakun TA, Qu L, Li X, Li J, Han L, Wang T. 2014. New terpenoid
glycosides obtained from Rosmarinus officinalis L. aerial parts. Fitoterapia. 99:78–85. doi.org/10.1016/j.fitote.2014.09.004.
16
LAMPIRAN
17
- Fraksinasi dengan Kromatografi Kolom Gravitasi (KKG)
Fraksi n-Heksana Fraksi Etanol
18
19
Lampiran 4 Rendemen ekstrak etanol biji alpukat
Sampel
heksanaμetil asetat (3μ7) di bawah sinar UV pada λ 365 nm setelah
disemprot pereaksi LB
20
21
22
23
Lampiran 10 Morfologi sel MCF-7 dan HepG2: sel MCF-7 normal (a), sel MCF-7 dengan tambahan ekstrak 150 µg/mL (b), sel MCF-7 dengan tambahan fraksi C 25 µg/mL (c), sel MCF-7 dengan tambahan isolat triterpenoid 25 µg/mL (d), sel HepG2 normal (e), sel HepG2 dengan tambahan isolat triterpenoid 25 µg/mL (f) (pembesaran 10x100)
(a) (b)
(c) (d)
24
RIWAYAT HIDUP
Andi Nur Fitriani Abubakar lahir di Bulukumba (Sulawesi Selatan) 20 April 1991, sebagai anak kedua dari pasangan Ir Andi Abubakar dan Kasturi Djalil. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD Impres Batang Kaluku pada tahun 2003, pendidikan lanjutan pertama di SMPN 1 Sungguminasa pada tahun 2006, pendidikan lanjutan atas di SMAN 1 Takalar pada tahun 2009, dan studi Strata-1 di jurusan Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Alauddin Makassar pada tahun 2013. Penulis pernah bekerja sebagai pengajar di salah satu bimbingan belajar di Makassar tahun 2010-2014. Pada tahun 2014 penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) pada Program Pascasarjana di Departemen Kimia. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di organisasi
kampus “Bogor Sains Club” tingkat Pascasarjana PB. Penulis mendapat beasiswa penelitian Kementerian Keuangan RI melalui Lembaga Pengelola Dana Pendidikan (LPDP) pada tahun 2016. Penelitian tentang Triterpenoid Biji Alpukat (Persea amaericana) dan Aktivitas Sitotoksiknya terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7 dan Hati HepG2 telah dipresentasikan secara oral pada Seminar Nasional Kimia Unjani-HKI 2016 di Bandung.
