Activity of the infusion of Piper betle L. and Piper crocatum Ruiz & Pav on HeLa
cell line viability
Sari Haryanti*, Yuli Widiyastuti*, Nita Etikawati**
*Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional, Badan Litbang Kesehatan, Kementerian Kesehatan RI
**Fakultas MIPA Universitas Sebelas Maret, Surakarta e-mail: sari.haryanti@gmail.com
ABSTRAK
Sirih hijau(Piper betle L.) dan sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) merupakan tanaman yang sering dimanfaatkan oleh masyarakat Indonesia untuk mengobati berbagai macam penyakit, termasuk kanker. Bukti ilmiah untuk memperkuat dasar penggunaannya sebagai antikanker masih sangat diperlukan. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek infusa daun sirih hijau dan sirih merah terhadap viabilitas sel kanker serviks HeLa, serta potensinya dalam menghambat ekspresi protein antiapoptosis Bcl2 secara immunositokimia. Infusa sirih dikeringkan di atas penangas air hingga diperoleh ekstrak kering. Pengaruh ekstrak terhadap viabilitas sel HeLa ditetapkan melaluiuji sitotoksik dengan metode MTT assay hingga diperoleh nilai IC50. Pengaruh ekstrak aktif terhadap protein Bcl2 dilakukan dengan pengecatan immunositokimia. Uji sitotoksik infusa sirih hijau memberikan nilai IC50 49.14 µg/ml, sedangkan sirih merah tidak menunjukkan efek sitotoksik. Hasil pengecatan immunositokima secara kualitatif memperlihatkan pengurangan ekspresi protein Bcl2. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa sirih hijau mempengaruhi viabilitas sel HeLa dengan menginduksi kematian sel melalui penghambatan ekspresi protein antiapoptosis Bcl2. Dengan demikian sirih hijau cukup potensial dikembangkan sebagai agen kemopreventif untuk kanker serviks.
Kata kunci:Piper betle, Piper crocatum, sitotoksik, sel HeLa
ABSTRACT
Piper betle L. (betel leaves) and red betel (Piper crocatum Ruiz & Pav) are medicinal plant that are often used
by the Indonesian people to treat various diseases, including cancer. Scientific evidence to strengthen then use
PENDAHULUAN
Kanker merupakan jenis penyakit kompleks dengan karakteristik berupa kemampuan sel kanker untuk terus memenuhi sendiri sinyal proliferasi, menolak supresor pertumbuhan, menghindari sinyal kematian, menginduksi angiogenesis, menginvasi jaringan di sekitarnya, metastasis, re-program metabolisme energi, dan mencegah destruksi sistem imun (Hanahan and Weinberg, 2011). Jenis kanker yang paling banyak diderita wanita adalah kanker payudara, diikuti kanker kolon, kemudian kanker serviks. Di negara-negara Afrika Timur dan Asia Selatan kanker serviks merupakan jenis kanker dengan insidensi dan mortalitas tertinggi. Sebesar 86% kasus dan 88% kematian kanker serviks di seluruh dunia terjadi di negara berkembang (Singh et al., 2012). Lebih dari 99% kasus kanker serviks dikaitkan dengan infeksi genital oleh human papilloma virus/HPV (Nazari et al., 2007). Pengembangan terapi yang komprehensif untuk mengatasi kanker serviks sangat diperlukan untuk menekan jumlah kematian dan meningkatkan kualitas hidup penderita kanker.
Salah satu pengembangan terapi kanker diarahkan pada terapi kombinasi antara suatu agen kemoterapi dengan senyawa kemopreventif.
Senyawa kemopreventif didefinisikan sebagai agen yang berasal dari bahan alam, sintetik, mau-pun biologis yang dapat membalikkan, menekan dan atau mencegah perkembangan tahapan karsinogenesis (Tsao et al., 2004). Salah satu pendekatan penemuan senyawa kemopreventif adalah eksplorasi bahan alam terutama tumbuh-tumbuhan. Bahan alam mengandung berbagai senyawa biologis yang beraksi pada sel kanker melalui mekanisme yang kompleks. Tumbuhan berperan penting dalam pencegahan dan pen-gobatan kanker melalui beberapa cara: sebagai sumber potensial senyawa baru, mencegah dan menghambat terjadinya kanker, memperbaiki sistem imun, mencegah dan menurunkan efek samping pengobatan konvensional, serta mencu-kupi kebutuhan nutrisi dan psikologi (Bachrah, 2012).
Piper betle L. (sirih hijau) dan Piper crocatum Ruiz & Pav (sirih merah) merupakan tumbuhan dari famili Piperaceae yang banyak ditemukan di Indonesia. Beberapa publikasi melaporkan aktivitas daun sirih hijau sebagai antifungal (Ali et al., 2010), antibakteri (Datta et al., 2011), anti histamin (Hajare et al., 2011), antioksidan dan antiproliferasi pada sel kanker payudara MCF-7 (Abrahim et al., 2012) dan menghambat pertumbuhan tumor melanoma
qualitatively. Infusionof betel leaves were dried over a water bath to obtain a dry extract. Effect of extracts on the viability of HeLa cells determined by the cytotoxic test with MTT assay method to obtain IC50 values . Effect the activity against Bcl2 protein was tested byimmunocyitochemical test. Cytotoxic test infution of green betel leaves gave IC50 value of 49.14 ug/ml, whereas the red betel showed no cytotoxic effects. The immunocytochemical test showed a reduction in Bcl-2 protein expression.The results of this study showed that green betel leaves affect HeLa cell viability by inducing cell death through inhibition of anti-apoptotic Bcl2 protein expression. Thus green betel leaves are potential to be developed as a chemopreventive agent.
pada tikus (Patel et al., 2012), sedangkan daun sirih merah memiliki aktivitas menurunkan gula darah (Safithri dan Fahma, 2008) dan antioksidan (Alfarabi et al., 2010). Penelitian sirih merah sebagai antikanker payudara telah dilakukan Wicaksono et al., 2009. Hasilnya menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sirih merah terbukti memiliki efek antiproliferasi pada sel T47D dengan IC50 44.25 µg/ml (Wicaksono et al., 2009). Berdasarkan publikasi yang ada saat ini, kedua jenis sirih tersebut cukup potensial dikembangkan sebagai agen kemopreventif. Namun demikian, belum tersedia data ilmiah mengenai aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan kanker serviks. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek infusa daun sirih hijau dan sirih merah terhadap viabilitas sel kanker serviks HeLa, serta potensinya dalam menghambat ekspresi protein antiapoptosis Bcl2 secara immunositokimia.
METODE PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TO-OT), Tawangmangu.
Bahan
Daun sirih hijau diambil dari Kecamatan Mojosongo, Solo. Daun sirih merah merupakan koleksi kebun B2P2TO-OT. Keduanya dideterminasi di Laboratorium Farmakognosi B2P2TO-OT. Daun dicuci, dikeringkan dan diserbuk, kemudian direbus dalam panci infusa dan dibiarkan mendidih selama 10 menit. Selanjutnya infusa yang didapat dikeringkan diatas waterbath hingga diperoleh ekstrak kering.
Sel kanker serviks HeLa yang digunakan adalah koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta pada tahun 2008 kemudian ditumbuhkan, diperbanyak melalui subkultur dan disimpan dalam nitrogen cair di Laboratorium Biologi Molekuler B2P2TO-OT. Kultur sel ditumbuhkan dalam media penumbuh Dulbecco’s Modified Eagle Media/DMEM (Gibco) yang diperkaya dengan Foetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisillin-streptomisin 1 % (v/v) (Gibco).
Cara Kerja
Sejumlah 5.000 sel HeLa /sumuran ditanam pada microplate 96 sumuran dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah itu medium diganti yang baru dengan ditambahkan ekstrak kering infusa daun sirih berbagai konsentrasi (5-160 mg/ml) kemudian diinkubasi pada 37°C dalam inkubator CO2 5% selama 48 jam. Pada akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang, sel dicuci dengan PBS. Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 µl larutan MTT [(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 5 mg/ ml dalam media kultur. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam. Sel hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan reagen asam isopropanol (1 bagian HCl 4N dalam 100 bagian isopropanol), digoyang di atas shaker selama 10 menit. Serapan dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm.
ekstrak infusa daun sirih dosis 100 µg/ml selama 24 jam. Media diambil, dicuci dengan PBS. Cover slip diangkat, diletakkan di dalam 6 well plate. Preparat difiksasi dengan methanol dingin. Preparat dicuci dengan PBS 3x2 menit, kemudian ditetesi dengan hidrogen peroxidase blocking solution 3% selama 10 menit, kemudian dibuang. Pengecatan immunositokimia dilakukan dengan metode Streptavidin Biotin Amplification system sesuai petunjuk dalam kit yang digunakan (Histostain Kits-Invitrogen). Antibodi primer yang digunakan adalah Monoklonal anti Bcl-2 (Sigma) pengenceran 1:100 dengan masa inkubasi selama 1 jam. Ekspresi protein diamati di bawah mikroskop dengan cahaya perbesaran 100-400x.
Analisis Data
Data absorbansi hasil pembacaan Elisa Reader panjang gelombang 595 nm pada uji si-totoksik diolah dengan regresi linier program Excell MS Office 2007. Ekspresi protein Bcl2 pada pengecatan immunositokimia diamati se-cara kualitatif, dibandingkan intensitas warna coklat antara perlakuan ekstrak dan tanpa per-lakuan. Warna coklat merupakan warna dari substrat DAB kromogen yang sebanding dengan interaksi antara protein Bcl2 dalam sel dengan antibodi primer Bcl2.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji sitotoksik menunjukkan bahwa per-lakuan ekstrak infusa daun sirih hijau kadar 5-160 µg/mL pada sel HeLa menyebabkan ter-jadinya penurunan viabilitas dibandingkan sel tanpa perlakuan. Berdasarkan hasil penghitun-gan korelasi konsentrasi ekstrak dan % viabilitas
sel, terdapat hubungan linier antara konsentrasi dan efek sitotoksik yang dihasilkan. Perubahan morfologi tersebut dimungkinkan mengarah pada kematian sel dengan IC50 sebesar 49.14 µg/ml. Ekstrak infusa daun sirih merah tidak menunjukkan adanya perubahan viabilitas dan kematian sel. Morfologi sel HeLa serta grafik hubungan konsentrasi dan % viabilitas dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Viabilitas sel HeLa akibat perlakuan ekstrak infusa daun sirih hijau dan sirih merah.
Keterangan:
Ekstrak infusa daun sirih hijau menurunk-an viabilitas sel kmenurunk-anker serviks HeLa dengmenurunk-an IC50
yang relatif kecil, 49.14 μg/ml sehingga cukup
potensial dikembangkan sebagai alternatif agen kemopreventif. Penurunan viabilitas disebabkan karena terjadinya hambatan proliferasi dan in-duksi kematian sel. Pengamatan perubahan mor-fologi sel pada perlakuan sirih hijau memperli-hatkan terjadinya pengkerutan dan fragmentasi sel yang merupakan salah satu karakteristik ter-jadinya apoptosis. Apoptosis merupakan salah satu bentuk kematian sel yang menghasilkan ba-dan apoptosis yang kemudian difagositosis oleh makrofag atau sel di dekatnya dan didegradasi di dalam lisosom (Hetz et al., 2005).
Penelusuran mekanisme apoptosis ber-hubungan dengan ekspresi beberapa protein regulator, di antaranya protein antiapoptosis yai-tu Bcl2. Bcl2 meregulasi apoptosis jalur intrinsik yang ditimbulkan oleh stres intraseluler seperti radiasi dan senyawa sitotoksik yang menginduk-si terjadinya pelepasan menginduk-sitokrom c dari mitokon-dria yang rusak. Sitokrom c kemudian berika-tan dengan molekul adaptor APAF-1 dan iniator caspase inaktif yaitu procaspase 9, dalam suatu kompleks multiprotein yang disebut apopto-some. Selanjutnya terjadi aktivasi jalur caspase yang menghasilkan perubahan morfologi dan biokimia yang mencirikan peristiwa apoptosis (Tzifi et al., 2012).
Hasil pengecatan immunositokimia menunjukkan pengurangan intensitas warna coklat pada sel dengan perlakuan ekstrak infusa sirih hijau. Hal tersebut merupakan indikasi ter-jadinya penurunan ekspresi protein Bcl2.
Gambar 2. Efek perlakuan ekstrak infusa sirih hijau terhadap ekspresi Bcl-2 pada sel HeLa.
Keterangan:
Pengecatan dilakukan setelah sel diinkubasi selama 24 jam. (a) Kontrol sel tanpa perlakuan dengan anti-bodi Bcl2 dan (b) tanpa antianti-bodi Bcl2. (c) Perlakuan ekstrak sirih hijau 100 µg/mL dan (d) 200 µg/mL. Pengamatan dibawah mikroskop cahaya, dengan per-besaran 400x
Perbedaan aktivitas sirih hijau dan merah diduga berkaitan dengan perbedaan jenis dan jumlah senyawa fenolik. Berdasarkan hasil penelitian Abrahim et al., 2012, terdapat korelasi positif antara kadar fenolik dengan aktivitas antioksidan dan antiproliferasi sel MCF-7. Senyawa fenolik daun sirih hijau yang berperan sebagai antikanker adalah hydroxychavicol dan eugenol. Keberadaan hydroxychavicol cukup berlimpah dalam ekstrak air dan lebih poten dibandingkan eugenol (Pin et al., 2006). Batubara et al. (2011) membandingkan komponen penyusun minyak atsiri daun sirih hijau dan merah. Analisis spektra tidak mengandung champene, chavicol dan eugenol (Batubara et al., 2011).
KESIMPULAN
Ekstrak infusa daun sirih hijau menurunkan viabilitas sel melalui induksi kematian sel melalui penurunan ekspresi protein antiapoptosis Bcl2. Sirih hijau cukup potensial dikembangkan sebagai agen kemopreventif.
DAFTAR PUSTAKA
Abrahim NN., Kanthimathi MS. dan Abdul-Aziz A. 2012. Piper betle shows antioxidant activities, inhibits MCF-7 cell proliferation and increases activities of catalase and superoxide dismutase. BMC Complementary and Alternative Medicine, 12:220
Alfarabi M., Bintang M., Suryani, dan Safithri M. 2010. The Comparative Ability of Antioxidant Activity of Piper crocatum in Inhibiting Fatty Acid Oxidation and Free Radical Scavenging. Hayati J Biosci., 17(4):
201-204
Bachrah ZY., 2012. Contribution of Selected Medicinal Plants for Cancer Prevention and Therapy. Scientific Journal of the Faculty of Medicine in Niš., 29(3): 117-123
Batubara I., Rahminiwati M., Darusman LK. dan Mitsunaga T. 2011. Tyrosinase activity of Piper betle and Piper crocatum Essential Oil. Proceedings of The International Conference on Basic Science. Faculty of Science. University of Brawijaya. Malang Indonesia. Datta A., Ghoshdastidar S. dan Singh M. 2011.
Antimicrobial Property of Piper betel leaf against Clinical Isolates of Bacteria. International Journal of Pharma Sciences and Research (IJPSR), 2(3): 104-109
Hajare R., Darvhekar VM., Shewale A. dan Patil V. 2011. Evaluation of antihistaminic activity of Piper betel leaf in guinea pig. Afr. J. Pharm. Pharmacol., 5(2): 113-117,
Hanahan D. and Weinberg RA. 2011. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell,144: 647-674
Hetz CA., Torres V. and Quest AVG. 2005. Beyond Apoptosis: Nonapoptotic Cell Death in
Physiology and Disease. Review. Biochem.
Cell Biol., 83(5): 579–588.
Nazari Z., Behtash N., Gilan MM., Ganjoei TA. 2007. Cervical carcinoma simulating advanced ovarian cancer. Eur. J. Surg. Oncol., 33(1): 123-124.
Pin KY., Chuah TG., Abdull Rashih A., Rasadah MA., Law CL., and Choong TSY.. 2006. Aqueous Extraction of Hydroxychavicol from Piper Betle L. Leaves. Proceedings of the 1st International Conference on Natural Resources Engineering & Technology. Putrajaya, Malaysia, 146-152
Safithri M. and Fahma F. 2008. Potency of Piper crocatum Decoction as an Antihiperglycemia in Rat Strain Sprague dawley. Hayati J Biosci., 15(1): 45-48
Singh GK., Azuine RE., and Siahpush M. 2012. Global Inequalities in Cervical Cancer Incidence and Mortality are Linked to Deprivation, Low Socioeconomic Status, and Human Development. International Journal of MCH and AIDS, I(1): 13-26
Tsao AS., Kim ES., Hong WK., 2004. Chemoprevention of Cancer. Cancer J Clin., 54:150-18
Tzifi F., Economopoulus C., Gourgiotis D., Ardavanis A., Papageorgiou S., and Scorilas A. 2012. The Role of BCL2 Family of Apoptosis Regulator Proteins in Acute and Chronic Leukemias. Advances in Hematology 2012: 524308
