STABILITAS PANAS ENZIM PDC DARI BAKTERI TERMOFIL
PENGHASIL ETANOL
Pujoyuwono Martosuyono1 dan Peter L. Rogers2
1 Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian 2 Department of Biotechnology, The University of New South Wales, Sydney, Australia
Penggunaan bakteri termofil telah menarik banyak pihak, terutama dalam sistem produksi bahan bakar alternatif seperti bioetanol. Keuntungan pemakaian bioetanol adalah dapat menurunkan tingkat polusi dan pemanasan global karena hasil pembakaran etanol tidak memberikan tambahan netto CO2 pada lingkungan. Satu isolat bakteri termofilik unggul telah diisolasi dari sampel kompos yang menunjukkan kemampuan untuk memproduksi etanol. Hasil identifikasi dengan sekuensing 16S rRNA menunjukkan isolat ini diklasifikasikan sebagai Geobacillus thermoleovorans, bakteri gram positif berbentuk batang yang mampu tumbuh pada kisaran substrat yang luas, dengan suhu optimum pertumbuhan 60oC dan bersifat fakultatif anaerob. Isolat tersebut juga menunjukkan aktivitas enzim Pyruvate decarboxylase (PDC), enzim kunci dalam produksi etanol. Hasil pengukuran aktivitas pada suhu 25, 40 dan 60oC yang menunjukkan stabilitas yang tinggi terhadap pemanasan dengan meningkatnya aktivitasnya setelah dilakukan pemanasan pada suhu 60oC dibandingkan dengan PDC dari Zymomonas mobilis yang kehilangan aktivitasnya secara total. Komponen lain dalam asay enzim sensitif terhadap panas sehingga pengukuran aktivitas hanya bisa dilakukan pada suhu 25oC
Kata kunci : bakteri termofil, etanol, Geobacillus thermoleovorans, PDC.
ABSTRACT. Pujoyuwono Martosuyono and P.L. Rogers. 2005. Thermal stability of PDC enzyme from thermophilic bacteria producing ethanol. There has been considerable interest in the use of thermophiles for the production of fuel and bulk chemicals such as alcohol and acids. The advantage of ethanol utilization as a fuel is the capability to reduce the pollution level and global warming since it recycles atmospheric carbon from renewable biomass such as cellulose, hemicelluose and starch, thus ‘closing the carbon balance’. One isolat of thermophilic bacteria with the capability to produce ethanol had been isolated from compost sample. Identification by 16S rRNA sequencing has revealed that the isolat is classified as Geobacillus thermoleovorans, a gram positive bacteria, rod shape, grow on wide variety of substrates with optimum growing temperature of 60oC, and facultative anaerobe. The cell extract from isolate D-2124 shows the presence of Pyruvate decarboxylase; the key enzyme in ethanol production system. Activity measurement of PDC at 25, 40 and 60oC demonstrate the thermostable character of the enzyme. Total activity of pre-incubated cell extract at 60oC was higher than other temperature while the activity of the counterpart enzyme of Zymomonas mobilis was totally lost at that temperature. The other components of enzyme assay were thermal sensitive, consequently the activity measurement was carried out at 25oC.
Keywords : thermophilic bacteria, ethanol, Geobacillus thermoleovorans, PDC.
PENDAHULUAN
Kebutuhan pemakaian minyak bumi yang terus meningkat dan diiringi dengan penyusutan suplai menyebabkan harga bahan bakar terus melambung mencapai tingkat harga yang mengganggu keseimbangan perekonomian dunia. Bertolak dari kondisi tersebut, terdapat pemikiran untuk mencari sumber bahan bakar alternatif yang dapat mensubstitusi minyak bumi dalam pemakaian sehari-hari, terutama untuk penggunaan sebagai bahan bakar kendaraan bermotor dan industri. Salah satu alternatif yang potensial untuk dikembangkan adalah penggunaan bio-etanol yaitu etanol yang dihasilkan dari proses fermentasi bahan berpati oleh mikroorganisme (Aristidou dan Penttila, 2000).
Banyak sekali keuntungan penggunaan bio-etanol sebagai bahan bakar alternatif pengganti minyak bumi. Faktor utama yang menjadi pertimbangan adalah pati
Sampai saat ini etanol diproduksi dengan teknik hidrasi katalitik etilena atau fermentasi menggunakan Saccharomyces cerevisiae dan Zymomonas mobilis (Lee, 1997). Kedua jenis mikroorganisme tersebut dikelompokkan dalam golongan mesofilik. Kelemahan kedua jenis mikroorganisme tersebut adalah kemampuan penggunaan substrat yang terbatas, yaitu hanya menggunakan glukosa untuk memproduksi etanol. Selain itu dengan suhu pertumbuhan yang berkisar antara 30-37oC menyebabkan pemisahan produk membutuhkan suplai energi karena penyulingan etanol dilakukan pada suhu 70-80oC (Lynd, 1989).
Untuk mengatasi masalah tersebut dilakukan upaya untuk mencari alternatif mikroba termofilik yang pada umumnya memiliki karakteristik mampu menggunakan berbagai macam substrat. Kelebihan lain yang ada dalam sistem termofilik ini adalah sifat fisik medium yang menunjukkan penurunan viskositas dan tegangan permukaan, serta peningkatan difusi dan kelarutan substrat pada suhu reaksi tinggi (Tolner et al., 1997). Sistem termofilik juga menunjukkan kecepatan reaksi yang tinggi (Brock, 1985) dan tidak memerlukan sistem pendingin bioreaktor. Keunggulan lainnya meliputi kemungkinan kontaminasi yang rendah, produk lebih tinggi, suplai energi dalam pemisahan produk lebih rendah, dan kemungkinan untuk melakukan fermentasi secara simultan dari polisakarida menjadi etanol (Lynd, 1989).
Karakter termofilik dari bakteri ditentukan oleh sifat-sifat biokimia dan fisiologisnya. Pada bakteri mesofil, makromolekul seperti protein dan asam nukleat akan mengalami kerusakan secara permanen akibat pemanasan. Namun demikian, komponen tersebut tetap aktif secara biologis pada bakteri termofil. Observasi terhadap aktivitas katalitik enzim yang dihasilkan oleh bakteri termofil menunjukkan aktivitas yang sangat rendah, bahkan hilang sama sekali pada suhu sedang dimana enzim dari bakteri mesofil menunjukkan aktivitas maksimumnya. Temperatur optimum dari enzim termofilik biasanya sama atau sedikit lebih tinggi dari suhu optimum pertumbuhannya (Zeikus et al., 1998).
Pyruvate decarboxylase (PDC, EC 4.1.1.1) berperan sebagai katalis dalam pengubahan hasil akhir proses glikolisis, yaitu asam piruvat menjadi asetaldehid dan CO2 dalam fermentasi alkoholik. Konversi piruvat menjadi etanol dapat dilihat pada Gambar 1.
Enzim PDC merupakan tetramer identik dari empat sub-unit, dan tiap sub-unit terdiri dari 568 asam amino dengan bobot sekitar 60 kDa (Henderson, et al., 1979) Aktivitas enzim PDC sangat tergantung pada keberadaan thiamine diphosphate (ThDP) dan Mg2+ yang berfungsi sebagai kofaktor (Alvarez et al., 1991). Kofaktor ini berfungsi sebagai stabilisator struktur kuarterner enzim pada kisaran pH yang cukup luas, antara 4,6-8,5. Pada pH diatas 8,5 aktivitas katalitik enzim PDC hilang secara total karena disosiasi kofaktor (Dobritzsch et al., 1998 ; Neveling et al., 1998). Didalam sel, enzim PDC berada dalam kesetimbangan dimer-tetramer, tetapi yang memiliki aktivitas biologis hanya bentuk tetramer (Jabs et al., 1996; Elize et al.,1999).
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri termofilik yang mampu memproduksi etanol dan melakukan karakterisasi sifat-sifat fisiologis dan biokimianya.
BAHAN DAN METODE
Bahan dan alat.
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini berkategori pure analysis kecuali disebutkan secara khusus. Sementara itu peralatan yang digunakan meliputi gas kromatografi (Packard, series 427), spektrofotometer Ultraspect 2000 (Pharmacia Biotech) yang dihubungkan dengan komputer dengan program Swift II untuk analisis enzim, PCR (Perkin Elmer 2400), ABI prism DNA sequencer, inkubator goyang, sentrifuse Beckman J-21, perangkat ultrasonik, dan peralatan gelas yang lazim dipakai. Penelitian ini dilakukan pada tahun 2003 di Laboratorium Departemen Bioteknologi, The University of New South Wales, Sydney, Australia.
Gambar 1. Reaksi pembentukan etanol dari piruvat dengan kerja enzim Pyruvate decarboxylase (PDC) dan Alcohol dehydrogenase (ADH)
Figure 1. Conversion of pyruvate to ethanol by means of PDC and ADH action Pyruvate decarboxylase,
TPP, Mg2+ alcohol dehydrogenase
Piruvat Asetaldehid Etanol
Metode.
Isolasi dan seleksi bakteri penghasil etanol
Isolasi bakteri dilakukan dari sampel kompos dalam fase termogenik (suhu 60-80oC) berusia 2-6 bulan yang diperoleh dari lokasi pengomposan di Lucas Heights Landfill di Sydney, NSW, Australia. Teknik yang digunakan meliputi cara sebar langsung (direct plating) dan menggunakan media diperkaya (enrichment media) dengan xylosa sebagai satu-satunya sumber karbon dan penambahan 4% etanol sebagai medium seleksi. Isolasi dan seleksi koloni dilakukan dalam medium padat dengan komposisi sama. Koloni yang tumbuh dimurnikan dengan cara mengambil tiap koloni tunggal untuk diseleksi lebih lanjut.
Kemampuan tiap isolat untuk memproduksi etanol dilakukan dengan cara menumbuhkan tiap isolat dalam erlenmeyer berisi medium cair dengan menggunakan xylosa sebagai sumber karbon tunggal pada suhu 60oC. Sampel diambil pada jam ke-0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 30, 36, 42, dan 48. Tiap sampel diukur jumlah biomassa dan supernatannya digunakan untuk pengukuran jumlah etanol menggunakan kromatografi gas dengan kolom Porapak Q (ukuran fase diam 100-200 mm), gas pembawa nitrogen, suhu oven 160oC (isotermal), suhu injektor dan detektor 200oC dan menggunakan detektor Flame Ionization Detector (FID).
Suhu optimum pertumbuhan dan produksi etanol
Isolat yang menunjukkan kemampuan menghasilkan etanol digunakan untuk karakterisasi lebih lanjut. Suhu optimum pertumbuhan dan produksi etanol diukur pada suhu 50, 60 dan 70oC dalam medium Thermophilic Minimum Media (TMM) dengan menggunakan xylose sebagai sumber karbon dan medium TMM tanpa xylose.
Karakterisasi sifat fisiologis dan biokimia isolat terpilih
Penetapan karakter sifat fisiologi dan biokimia isolat terpilih dilakukan dengan cara melakukan uji penggunaan substrat, uji Voges-Proskauer, dan motilitas bakteri. Uji penggunaan substrat dilakukan dengan cara memasukkan glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, mannitol, xilosa, arabinosa, salicin, sorbitol, urea dan sitrat kedalam medium sebagai satu-satunya sumber karbon. Pertumbuhan isolat dalam medium diamati dan diberikan kode positif (+) jika menunjukkan ada pertumbuhan dan negatif (-) jika tidak. Uji motilitas dilakukan dengan menanamkan satu ose biakan bakteri kedalam agar dan dilihat pergerakannya menembus medium agar.
Uji keberadaan dan stabilitas panas enzim Pyruvate decarboxylase (PDC)
Enzim kunci yang menentukan kemampuan suatu mikroorganisme dalam memproduksi etanol adalah enzim pyruvate decarboxylase. Keberadaan enzim ini pada isolat terpilih dilakukan dengan cara menguji aktivitasnya. Enzim dilepas dari sel dengan cara memecah sel menggunakan teknik ultrasonik. Aktivitas enzim diukur dengan melakukan asay enzim berdasarkan reaksi berantai dekarboksilasi dan dehidrogenasi pada suhu 25, 40 dan 60 oC. Komposisi pereaksi yang digunakan dalam asay ini disampaikan pada Tabel 1. Keberlangsungan reaksi diketahui dengan melihat penurunan absorbansi pada panjang gelombang 340 nm. Satu unit aktivitas PDC dinyatakan sebagai jumlah enzim (PDC) yang mengubah 1 mikromol piruvat menjadi asetaldehid per menit pada pH 6,0 dengan kondisi analisis yang digunakan.
Aktivitas enzim diukur pada suhu 25, 40, 50 dan 60oC. Karena komponen reaksi pada umumnya sensitif terhadap panas, maka campuran komponen Na-piruvat, bð-NADH dan ADH coupling enzyme dimasukkan sesaat sebelum pengukuran aktivitas. Selain itu dilakukan juga modifikasi dengan cara perlakuan pemanasan ekstrak sel pada suhu 40 dan 60oC sebelum diukur aktivitasnya pada suhu 25oC (suhu optimum aktivitas PDC dari bakteri mesofil). Sebagai kontrol positif digunakan ekstrak sel dari Z. mobilis, sedangkan ekstrak sel E.coli DH5 sebagai kontrol negatif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi, seleksi dan identifikasi bakteri terpilih
satu isolat tunggal yang dihasilkan dan disebar pada medium padat untuk menghasilkan koloni tunggal yang berbeda satu sama lain.
Tahap isolasi memerlukan strategi untuk mendapatkan isolat dengan karakteristik yang diinginkan. Penambahan etanol pada medium seleksi dimaksudkan untuk memperoleh isolat tahan terhadap etanol dengan pemikiran bahwa isolat dengan kemampuan memproduksi etanol harus tahan terhadap keberadaan etanol dalam medium. Penelitian ini belum mencakup pelaksanaan pengujian tingkat toleransi isolat terhadap etanol yang dapat mengganggu sistem membran bakteri.
Pengujian terhadap kemampuan produksi etanol dari tiap isolat menunjukkan adanya 3 isolat yang mempunyai karakteristik sebagai bakteri penghasil etanol. Ketiga isolat tersebut adalah C-2112, D-2124, dan F-2121. Pada kondisi fermentasi aerobik ketiga isolat menghasilkan etanol yang sangat kecil yaitu 0,2-1,9 g/l. Sedangkan pada kondisi anaerob ketiga isolat mampu tumbuh dengan baik dan jumlah etanol yang dihasilkan lebih tinggi yaitu berkisar antara 2,5-3,7 g/l. Hasil tertinggi ditunjukkan oleh isolat D-2124.
Melalui teknik pewarnaan Gram dapat diidentifikasi bahwa ketiga isolat tersebut adalah bakteri gram positif, berbentuk batang, dan mampu membentuk spora. Untuk mengklasifikasikan secara lebih akurat, dilakukan analisis sekuens 16S rRNA sebagai acuan. Hasil analisis menunjukkan bahwa isolat C-2112 dan F-2121 diidentifikasi sebagai Bacillus caldoxyloliticus dan isolat D-2124 adalah Geobacillus thermoleovorans.
Suhu optimum pertumbuhan dan produksi etanol.
Hasil pengamatan terhadap pertumbuhan dan produksi etanol pada suhu 50, 60, dan 70oC menunjukkan bahwa suhu optimum untuk pertumbuhan dan produksi etanol adalah 60oC (Gambar 2). Pada suhu 50oC pertumbuhan bakteri dan etanol yang dihasilkan sedikit lebih rendah, sedangkan pada suhu 70oC pertumbuhan bakteri sangat rendah dengan fase lag yang panjang etanol yang diproduksi sangat rendah, kurang dari 0,2 g/l.
Karakterisasi sifat fisiologis dan biokimia isolat D-2124.
Sifat fisologis dan biokimia diamati dengan melihat kemampuan memanfaatkan substrat yang bervariasi dan uji lain yaitu uji Voges-Proskauer, dan motilitas. Hasil pengujian disajikan pada Tabel 2. Pada tabel tersebut tampak bahwa isolat D-2124 mampu tumbuh pada berbagai substrat, meliputi glukosa, sukrosa, xilosa, sorbitol dan urea. Aktivitas fermentasi bisa diamati dengan produksi asam dan gas selama fase pertumbuhan. Motilitas bakteri dapat dilihat dengan melihat pergerakan kultur pada medium menembus agar.
Kemampuan untuk tumbuh pada berbagai macam substrat seperti glukosa, sukrosa dan xylosa menjadikan isolat ini potensial untuk dikembangkan lebih lanjut. Xylosa merupakan gula pentosa yang keberadaannya Gambar 2. Suhu optimum pertumbuhan bakteri D-2124 dalam
medium TMM
Figure 2. Optimum growth temperature of isolate D-2124 in TMM medium.
Tabel 2. Penggunaan substrat, produksi asam, gas, dan uji VP, metil red, serta motilitas isolat D-2124
Table 2. Substrate utilization, acid and gas production, VP and
** + = membentuk gas dan atau asam/form gas and or acid
sangat melimpah sebagai produk hidrolisis bahan lignoselulosa. Kayu-kayuan dan limbah pertanian seperti jerami padi dan batang gandum bisa dimanfaatkan sebagai bahan baku yang murah untuk produksi etanol. Dengan demikian diharapkan biaya produksi etanol yang 60% ditentukan oleh harga substrat bisa ditekan dan mampu bersaing dengan harga minyak (Hahn-Hagerdal et al., 1994).
Aktivitas PDC dan uji stabilitas terhadap pemanasan
Ekstrak sel dari ketiga isolat digunakan dalam uji aktivitas PDC mengingat ketiganya mampu memproduksi etanol. Hasil pengukuran aktivitas PDC pada suhu 25, 40 dan 60oC ditunjukkan pada gambar 3. Pada suhu 40 dan 60oC terjadi penurunan aktivitas enzim PDC walaupun komponen reaksi yang tidak tahan panas (Na-piruvat,
bð-NADH dan ADH coupling enzyme) dimasukkan sesaat sebelum pengukuran. Aktivitas PDC hilang pada suhu 60oC.
Pengukuran aktivitas ekstrak sel yang dipanaskan pada suhu 40 dan 60oC sebelum pengukuran aktivitasnya pada suhu 25oC yang merupakan suhu optimum PDC yang dihasilkan oleh bakteri mesofil ditunjukkan pada Gambar 4 dan 5. Hasil pengujian stabilitas enzim terhadap pemanasan pada suhu 40 dan 60oC menunjukkan bahwa aktivitas enzim yang ditunjukkan oleh ketiga isolat menunjukkan peningkatan, sedangkan ekstrak sel Z.mobilis kehilangan aktivitas secara total pada suhu 60oC. Sebagai kontrol negatif digunakan ekstrak sel E.coli DH5að yang sama sekali tidak menunjukkan aktivitas enzim. Aktivitas enzim dan aktivitas spesifik PDC dari ketiga isolat dan kontrol seperti yang tertera pada Gambar 4 dan 5.
C-2112 D-2124 F-2121 Z. mobilis E. coli Ekstrak sel dari isolat
Keberadaan enzim Pyruvate decarboxylase (PDC) pada isolat G. thermoleovorans D-2124 dengan karakter stabil terhadap pemanasan memberikan nilai tambah lagi pada isolat ini. Ekstrak sel menunjukkan aktivitas PDC yang menurun pada suhu 40oC bahkan hilang sama sekali pada suhu 60oC. Hal ini diakibatkan rusaknya komponen reaksi pada suhu tersebut. Elize et al (1999) menyatakan bahwa kofaktor thiamin diphosphate terdisosiasi pada suhu tinggi. Demikian pula untuk komponen pyruvate dan alkohol dehidrogenase yang akan kehilangan aktivitasnya pada suhu lebih dari 40oC.
Hasil yang sebaliknya ditunjukkan pada perlakuan pemanasan ekstrak sel (pra inkubasi) sebelum pengukuran aktivitas enzim pada suhu optimum PDC (25oC) yang menunjukkan peningkatan aktivitas enzim PDC dari ekstrak sel isolat terpilih. Sedangkan PDC dari Zymomonas mobilis mengalami penurunan secara signifikan pada 40oC dan hilang sama sekali pada suhu 60oC.
Kestabilan terhadap pemanasan kemungkinan disebabkan oleh komposisi asam amino yang lebih didominasi oleh asam-asam amino yang bersifat hidrofobik sehingga memiliki ketahanan struktur yang lebih baik jika dibandingkan dengan enzim PDC yang dihasilkan oleh bakteri mesofil (Tolner et al., 1997; Zeikus et al., 1998). Selain itu jumlah asam amino sistein juga kemungkinan lebih sedikit dibandingkan PDC dari bakteri mesofil sehingga auto oksidasi pada suhu tinggi bisa dihindari (Hiromasa et al., 1994; Candy et al., 1998). Dengan demikian aktivitas enzim PDC dari isolat bakteri termofil juga akan meningkat karena suhu optimumnya lebih tinggi dibandingkan enzim PDC dari bakteri mesofil.
KESIMPULAN
Isolat D-2124 memilki karakter yang cukup bagus untuk dijadikan sebagai isolat unggul dalam sistem produksi etanol. Dengan kemampuan tumbuh pada suhu tinggi, penggunaan substrat yang luas, dan tingkat produksi etanol yang cukup tinggi menjadikan isolat ini ideal untuk dikembangkan lebih lanjut. Kemampuannya untuk memanfaatkan xylosa sebagai substrat memungkinkan biaya produksi etanol dimasa depan akan lebih murah mengingat gula ini sangat berlimpah di alam dengan nilai ekonomi yang rendah.
PDC yang dihasilkan oleh isolat D-2124 ini menunjukkan stabilitas terhadap pemanasan. Aktivitasnya pada suhu 60oC meningkat pada saat PDC dari Z. mobilis hilang total.
Untuk meningkatkan kemampuan produksi etanol dari isolat D-2124, diperlukan penelitian lebih lanjut. Optimasi kondisi fermentasi, formulasi medium dan kestabilan karakter isolat tersebut menjadi faktor yang bisa digunakan dalam penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Alvarez, F.J., J. Ermer., G. Hubner., A. Schellenberger., and R. L. Schowen. 1991. Catalytic power of pyruvate decarboxylase. Rate limiting events and microscopic rate constant from primary carbon and secondary hydrogen isotope effects. J. Am. Chem. Soc. 113: 8402-8409.
Aristidou, A., and M. Penttilä. 2000. Metabolic engineering applications to renewable resource utilization. Current opinion in biotechnology. Vol. 11 (2): 187-198.
Brock, T. D. 1985. Life at high temperatures. Science. Vol. 230: 132-137.
Candy, J.M., and R. G. Duggleby. 1998. Structure and properties of pyruvate decarboxylase and site directed mutagenesis of the Zymomonas mobilis enzyme. Biochimica et Biophysica Acta. 1385: 328-338.
Dobritzsch, D., S. Konig., G. Schneider., and G. Lu. 1998. High resolution crystal structure of pyruvate decarboxylase from Zymomonas mobilis: implication for substrate activation in pyruvate decarboxylases. J. Biol. Chem. Vol. 273(32): 20196-202 04.
Elize H. Muller, E. H., E. J. Richards., J. Norbecka, K. L. Byrne, K. A. Karlsson, G.H.J. Pretorius, P. A. Meacock. , A. Blomberg., and S. Hohmann. 1999. Thiamine repression and pyruvate decarboxylase autoregulation independently control the expression of the Saccharomyces cerevisiae PDC5 gene. FEBS Letters. Vol. 449 (2-3): 245-250
Hahn-Hagerdal, B., H. Jeppsson., K. Skoog., B. A. Prior . 1994. Biochemistry and physiology of xylose fermentation by yeasts. Enzyme and Microbial Technology. Vol. 16 (11): 933-943 Henderson, C.E., R. N. Perham., and J. T. Finch. 1979. Structure
and symmetry of B. stearothermophilus pyruvate dehydrogenase multienzyme complex and implications for eucaryote evolution. EMBASE. Vol. 17 (1):85-93
Hiromasa, Y., A. Yoichi., S. Yamamshita. 1994. Thermal Diassembly of Pyruvate Dehydrogenase Multienzyme Complex from Bacillus stearothermophilus. Biosci. Biotechnol. Biochem. Vol. 58 (10): 1904-1905.
Jabs, M.K., S. Konig., S. Hohmann., and G. Hubner. 1996. Purification and characterization of pyruvate decarboxylase from a haploid strain of Saccharomyces cerevisiae. Biol. Chem. 377: 313-317.
Lee, J. 1997. Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol. J. Biotechnology. Vol. 56 (1): 1-24.
Lynd, L. R. 1989. Production of ethanol from lignocellulosic materials using thermophilic bacteria: critical evaluation of potential and review. Adv. In Biochem. Eng./Biotechnol. Springer-Verlag. 38: 1-52.
Neveling, U., R. Klasen., S. bringer-Meyer., and H. Sahm. 1998. Purification of pyruvate dehydrogenase multienzyme complex of Zymomonas mobilis and identification and sequence analysis of the corresponding genes. J. Bacteriol. Vol. 180(6): 1540-1548.
Tolner, B., B. Poolman., and W. N. Konings. 1997. Adaptation of microorganisms and their transport systems to high temperatures. Comparative Biochem. And Physiol. Vol. 118 (3): 423-428.
