111. . METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di laboratorium Kimia Pangan, Rekayasa dan Gizi Masyarakat Pusat Antar Universitas Institut Pertanian Bogor, serta laboratorium yang ada di lingkungan Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi Fateta IPB.
Penelitian dilaksanakan dari bulan Juli 1999 sampai dengan bulan Agustus 2000. 3.2 Bahan dan Alat
Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah minyak sawit merah dengan merk "Carotino" yang diperoleh dari Malaysia. Bahan lain yang digunakan meliputi emulsifier Sukrosa ester asam lemak dengan nama dagang Ryoto Sugar Ester tipe S-1670 (HLB 16), S-1570 (HLB 15), S-370 (HLB 3), dan tipe P-1570 (HLB 15) dari Mitsubishi-Kasei Food Corporation (MFC) Japan, Tween 80, Gum Arabik, CMC (Carboxymethyl Cellulose), beberapa jenis flavor (Flavor jemk dan nanas) dari International Flavors & Fragrances-PT Essence Indonesia, pemanis (aspartam dan high fiuktosa simp), pengawet Sodium Benzoat, pengkelat Etilen Diamin Tetra Asetat (EDTA), antioksidan Butil Hidroksi Toluen (BHT), Air mineral "Aqua", Standar P-karoten dari Sigma, dan bahan-bahan kimia lain untuk keperluan analisa kimia pada minyak dan minuman emulsi.
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini meliputi satu unit peralatan Homogenizer Toraw dengan kecepatan 8000 rpm untuk pembuatan minuman
33
emulsi, satu unit peralatan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) merk Shimadzu, Spektrofotometri, Haake Viscometer RC-20, Vorteks, Stopwatcll, peralatan titrasi dan peralatan gelas lainnya yang diperlukan untuk analisa kimia dan analisa sifat fisik produk emulsi.
3.3 Metode Penelitian
Metode Penelitian ini terdiri dari tiga tahapan: (1) Penentuan Jenis dan Konsentrasi Emulsifier Tujuan:
a. Mendapatkan nilai HLB yang tepat yang mampu membentuk emulsi dari kombinasi dua jenis emulsifier sukrosa ester asam lemak dengan nilai HLB yang berbeda yaitu S-1670 (nilai HLB 16) dan S-370 (nilai HLB 3).
b. Mendapatkan jenis emulsifier yang tepat dengan konsentrasi tertentu yang mampu membentuk emulsi secara baik pada berbagai rasio minyak dan air. Emulsifier yang digunakan meliputi emulsifier campuran dari sukrosa ester asam lemak dengan nilai HLB 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 dan 16, sukrosa ester asam lemak tipe S-1570 (HLB 15), sukrosa ester asam lemak tipe P-1570 (HLB 15), Tween 80, CMC, dan Gum Arabik.
Metode:
a. Untuk mendapatkan emulsifier campuran dengan nilai HLB tertentu, dilakukan pencampuran dua jenis emulsifier dengan nilai HLB yang berbeda yaitu emulsifier Sukrosa Ester Asam lemak tipe S-1670 (HLB 16) dan emulsifier Sukrosa Ester Asam Lemak tipe S-370 (HLB 3) sehingga di dapatkan emulsifier campuran dengan nilai HLB 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15
dan 16. Persentase berat tiap jenis emulsifier yang dibutuhkan untuk lnembuat campuran emulsifier tersebut dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: 100% (X - HLB B) %A = HLB A
-
HLB B Sumber: Dziezak (1988) Keterangan:A = Emulsifier A (Sukrosa Ester Asam Lemak tipe S-1670 dengan nilai HLB 16) B = Emulsifier B (Sukrosa Ester Asam Lemak tipe S-370 dengan nilai HLB 3) X = Nilai HLB emulsifier yang diinginkan
b. Untuk mengetahui kemampuan emulsifier membentuk emulsi dilakukan pembuatan emulsi. Mula-mula fase air d m emulsifier dicampurkan dengan konsentrasi tertentu (0,25%; 0,5%; 0,75%, 1,0%) dalam homogenizer dan dihomogenisasi selama lebih kurang 1 (satu) menit. Selanjutnya ditambahkan fase minyak s e d i i t demi sedikit sambil diiomogenisasi sehingga diperoleh emulsi yang homogen (lebih kurang 3 menit). Rasio minyak dan air yang digunakan yaitu 46; 5:5; 6:4; 7:3 d m 8:2. Pada tahapan ini diperoleh rasio minyak dan air serta jenis dan konsentrasi emulsifier yang mampu membentuk emulsi yang stabil.
Pengamatan:
Pengamatan dilalrukan setiap hari terhadap kestabilan emulsi yang dihasilkan melalui pengamatan secara visual (secara langsung). ' ~ m u l s i dianggap stabil apabila lebih dari 30 hari emulsi yang terbentuk tetap homogenlstabil.
(2) Formulasi Minuman Emulsi Minyak Sawit Merah Tujuan:
Memperoleh formula emulsi dengan penambahan bahan tambahan makanan lainnya (pemanis, pengawet, pengkelat, dan flavor) dengan tujuan bahwa penambahan tersebut tidak mempengamhi kestabilan emulsi yang terbentuk. Metode:
Metode pembuatan minuman emulsi dengan penambahan bahan tambahan lainnya (pemanis, pengawet, pengkelat dan flavor) dapat dilihat pada Gambar 8. Bahan tambahan yang digunakan antara lain simp fiuktosa, BHT, EDTA, Benzoat, serta flavor jernk. Banyaknya bahan tambahan yang digunakan bernpa pengawet Benzoat 0,2%; antioksidan BHT 200 ppm; dan pengkelat EDTA 200 ppm mengikuti penelitian Saputra (1996). Sedangkan pemanis h k t o s a dicobakan pada konsentrasi 10-15% dan flavor 1-1,5%.
Pengamatan:
Pengamatan yang dilakukan terhadap minuman emulsi meliputi pengujian terhadap sifat fisik, sifat kimia, dan pengujian secara organoleptik. Pengujian terhadap sifat fisik meliputi viskositas (Metode Haake Viscometer). Pengujian terhadap sifat kimia meliputi bilangan asam (metode titrasi; AOAC, 1990), bilangan peroksida (metode titrasi; AOAC, 1990), kandungan karoten total (Metode Spektrofotometri; Packer, 1992), dan kadar beta karoten (Metode HPLC; Packer, 1992). Pengujian mikrobiologi yaitu total mikroba (metode TPC, Fardiaz, 1987). Pengujian organoleptik meliputi rasa, aroma, wama, kekentalaJi, dan penampakan keselumhan berdasarkan uji kesukaan (Soekarto, 1985).
36
Air Minyak
1
+-- El~lulsifier (1%)1
+--
BHT (200 ppm)+--
Benzoat (0,2%) EDTA (200 ppm)Homogenisasi
-
(rf: 1 menit, 8000 rpm) Homogenisasi (+ 1 menit,8000 rpm) Ditarnbahkan perlahan-lahan sambil dihomogenisasiHomogenisasi (+ 3 menit, 8000 rpm)
I
'
Sirup ~ u ~ o s a ( l ~ - - i ~ % )+---
Flavor (1-1,5%) Homogenisasi (zk 4 menit, 8000 rpm)1
Emulsi O N PengemasanGambar 8. Diagram alir pembuatan minuman emulsi (3) Penentuan Umur Simpan Minuman Emulsi
Tujnan:
Pada tahapan ini dilahwkan percobaan untuk menentukan umur simpan minuman emulsi yang dihasilkan dengan menggunakan metode akselerasi
37
(percepatan) sehingga diketahui pada saat kapan minuman emulsi masih dapat dikatagorikan sebagai minuman emulsi yang kaya kandungan beta karoten.
Metode:
Penentuan karakteristik mutu minuman emulsi kaya beta karoten adalah pada kandungan beta karoten dari produk tersebut yang nlerupakan kondisi kritisnya untuk dapat dikatakan sebagai produk yang kaya kandungan beta karoten atau tidak. Kondisi kritis ini dinyatakan apabila produk minuman emulsi kaya beta karoten tersebut masih memiliki kadar beta karoten lebih kurang 100 ppm.
Pengamatan terhadap perubahan karakteristik mutu minuman emulsi adalah perubahan kandungan beta karoten produk selama waktu penyimpanan, dalain ha1 ini adalah penurunannya. Metode akselerasi dilakukan terhadap minuman emulsi yang dihasilkan dengan cara dipanaskan pada suhu 60°C . d m 90°C, selanjutnya pada setiap 0 jam, 1 jam, 2 jam, 3 jam, 4 jam, 5 jam dan 6 jam dilakukan analisa kandungan beta karoten dengan metode HPLC (Packer, 1992). Penentuan umur simpan dengan metode akselerasi dilakukan dengan menggunakan model Anhenius.
Data hasil pengamatan selanla penyimpanan ditabulasikan, selanjutnya dilahkan tahap-tahap penentuan umur simpan produk dengan menggunakan bantuan persamaan Arrheius yaitu sebagai berikut:
1. Data hasil analisa karakteristik beta karoten pada berbagai waktu penyimpanan/pemanasan pada berbagai suhu diplotkan sehingga didapatkan persamaan regresi liniernya. Dari regresi ini diperoleh dua persamaan regresi untuk dua kondisi suhu (T) penyimpanan produk yaitu Y = a
+
bX, dimana Y = nilai karakteristik minuman emulsi, X = waktu penyimpanan (dalarn ha1ini lan~anya pemanasan, dalam jam), a = nilai karakteristik minuman en~ulsi pada waktu penyimpanan, b = laju perubahan nilai karakteristik.
2. Dari masing-masing persamaan tersebut akan diperoleh nilai slope (b) yang mempakan konstanta laju reaksi pembahan karakteristik minuman emulsi. 3. Nilai Ink dan 1/T yang merupakan parameter persamaan Arrhenius
ditabulasikan, selanjutnya nilai Ink diplotkan terhadap nilai 1/T (PK) dan didapatkan nilai intersep dan slope dari persamaan regresi linier Ink = lnko - (EalR)(IIT), di mana Ink0 = intersep, EalR = slope, Ea = energi aktivasi dan R = konstanta gas ideal = 1,986 ka!./mol°K.
4. Dengan persamaan yang diperoleh pada tahap (3) didapatkan nilai konstanta ko yang mempakan faktor preeksponensial dan nilai energi aktivasi reaksi perubahan karakteristik minuman emulsi (Ea). Lebih lanjut ditentukan model persamaan kecepatan reaksi (k) p e ~ b a h a n karakteristik minuman ernulsi k = ko.emT. Persamaan ini disebut persamaan Arrhenius.
5. Dengan persamaan Arrhenius dapat dihitung nilai kecepatan reaksi (k) pembahan karakteristik minuman emulsi pada suhu (T) penyimpanan yang ditentukan.
6. Umur simpan minuman emulsi dihitung dengan menggunakm persamaan kinetika reaksi ordo satu: A, = &.e-" (di mana ts = umur simpan produk). Perhitungan menggunakan data karakteristik mutu awal minuman emulsi (kondisi minuman emulsi pada waktu t=O atau Ao) dan nilai karakteristik mutu minuman enlulsi pada kondisi kritis (kondisi pada waktu t=t atau A,).
Peneuiian Sifat Fisik
(1) Viskositas (Metode Haake)
Pengukuran viskositas minuman emulsi dilakukan dengan menggunakan alat Haake Viskometer RC-20. Sejumlah sampel (lebih kurang 40 ml) dimasukkan kedalam wadah khusus pada alat Haake viskometer. Pengukuran viskositas dilakukan pada suhu 25'C. Nilai viskositas yang temkur dalam satuan Pascal- detik (Pas). Nilai yang diperoleh dikonversi menjadi satuan centipoises (cp).
Nilai viskositas terukur Perhitungan (cp) =
1000 Peneuiian Sifat Kimia
(1) Bilangan Asam, Metode Titrasi (AOAC, 1990)
Bilangan
asam
adalah jumlah miligram KOH yang dibutuhkan untuk menetralkan asam-asam lemak bebas dari satu gram minyak atau lemak. Bilangan asam dipergunakan untuk mengukur jumlah asam lemak bebas yang terdapat dalam minyak atau lemak. Sampel minuman emulsi yang akan dianaIisa ditimbang sejumlah 20 gram dalam erlenrneyer 250 ml, lalu ditambah 50 ml alkohol netral 95%, dipanaskan sampai mendidih dalam penangas air s h b i l diaduk (lebih kurang 10 menit). Larutan ini kemudian dititrasi dengan larutan KOH 0,OlN dengan indikator fenolftalein 1% dalam alkohol sampai terbentuk wama merah jambu persisten selama 10 detik.Perhitungan bilangan asanl:
ml KOH
x
N KOH x 56,l Bilangan asam (mg KOWg sampel) =Berat sampel (g) Keterangan : N = normalitas KOH
(2) Bilax~gan Peroksida, Metode Titrasi (AOAC, 1990)
Bilangan peroksida adalah nilai terpenting untuk menentukan derajat kerusakan pada minyak atau lemak. Contoh sebanyak 5 gram dimasukkan kedalam erlenmeyer 250 ml. Ditambahkan 30 ml larutan carnpuran asam asetat glasial 100% dan khloroform (312). Setelah minyak melarut, ditambahkan 0,5 ml larutan KI jenuh dan dikocok selama 1 menit serta didiamkan selama 5 menit dalam ruang gelap. Setelah 5 menit, ditambahkan 30 ml air destilata kedalam larutan tersebut dengan larutan Na2S20, 0,lN dengan indikator amilum 1% sampai warna biru hilang. Penetapan blanko dibuat dengan cara yang sama.
( S - B ) x N x 1000
Bilangan Peroksida (meq11000 g sampel) =
G
Keterangan:
S = jumlah ml Na2S203 yang dipakai contoh B = jumlah ml Na2S203 yang dipakai blanko N = normalitas Na2S20,
G = berat contoh (gram)
(3) Kandungan Karoten Total, Metode Spektrofotometri (Packer, 1992) Contoh minyak sawit atau enlulsi ditimbang beratnya (+ 1 gram), selanjutnya didispersikan dalam 3 ml KOH 5% dalam metanol di dalam tabung reaksi bertutup. Headspace diisi dengan gas N2, kemudian disaponifikasi pada suhu 60°C selama 1 jam di dalam penangas air dengan kondisi gelap.
Setelah itu, tabung reaksi didinginkan dan ditambahkan 2 ml air bebas ion dan 6 ml heksan. Headspace diisi dengan gas N2, ditutup dan dikocok dengan tangan selama 1 menit. Kemudian disentrifuge ( 20 menit, 2000 rpm), larutan bagian atas dipindahkan ke tabung reaksi yang bersih.
4 1
Bagian bawah ekstrak yang pertama, diekstrak lagi dengan penambahan 6
1111 heksan, disentrifuge dan lapisan atas dipindahkan ke tabung reaksi yang berisi
hasil ekstraksi yang pertama. Selanjutnya hasil ekstrak tersebut dita~nbahkan 3 nml asam asetat 5%, headspace diisi dengan gas nitrogen, ditutup, dan dikocok dengan tangan selanla I (satu) menit. Setelah itu disentrifige (20 menit, 2000 rpm), lapisan atas dipindahkan ke tabung reaksi bersih.
Hasil ekstraksi ini heksannya di evaporasi dengan nitrogen, sehingga diperoleh konsentrat yang kering di dasar tabung. Ekstrak ini selanjutnya diencerkan dengan 3 ml pelarut campuran acetonitri1:metanol = 1 : 1, selanjutnya siap diukur absorbansinya pada panjang gelombang 450 nm menggunakan spektrofotometer.
Kandungan total karotenoid dalarn ekstrak dapat dihitung dengan menggunakan nilai El" (1 cm) untuk P-karoten, yaitu 2600. Setelah pengukuran absorbansi dilakukan, larutan dievaporasi kembali dengan nitrogen sampai kering untuk dipergunakan pada analisa kadar P-karoten.
Perhitungan: 10
v .
Total karoten @pm) =-
x A x F P - E l % ~ c r n B Keterangan:10 = faktor konversi dari persen kadar 0-karoten standar menjadi satuan mg/ml atau hg/),l El"
,,,,
= nilai koefisien ekstingsi P-karoten dalam metano1:asetonitril (1:l) pada panjang gelombang 450 nm = 2600 (Parker, 1992)A = nilai absorbansi karotenoid minuman emulsi minyak sawit FP = faktor pengenceran pada saat pengukuran absorbansi V = volume yang diukur absorbansinya = 3000 L1
42
(4) Kadar Beta Karoten, Metode HPLC (Packer, 1992)
Pada analisa kadar P-karoten, sampel yang telah dievaporasi san~pai kering sebagai hasil analisa kandungan total karoten dilamtkan dalam 3 rnl fase mobil HPLC. Lamtan disaring dengan menggunakan syringe filter apparatus dan siap untuk disuntikkan ke dalam kolom HPLC.
Persiauan Standar O-karoten Metode Packer. 1992
Kristal P-karoten dad. SIGMA ditimbang dalarn tabung reaksi bertutup
. .
alumunium foil secara ke~elumhan, dilamtkan dengan sempurna dalam 2 ml klorofom grade HPLC, kemudian diencerkan dengan 6 ml metanol grade HPLC.
Selanjutnya diarnbil 0,5 ml dan diencerkan 10 kali dengan metano1:acetonitril (1:l) Lamtan encer ini diukur absorbansinya pada panjang gelombang 450 nm dengan blanko metano1:acetonitril (1:l) meng,makan spektrofotometer.
Konsentrasi P-karoten dalam lamtan encer tersebut dapat dihitung berdasarkan nilai E'" I cm, yaitu absorbansi dari 1% larutan P-karoten atau sebesar
10 mg/ml atau 10 pg/pl pada panjang gelombang 450 nm menggunakan kuvet berdiarneter 1 cm sebagai berikut:
gonsentrasi larutan standar konsentrasi P-karoten semu
- -
2600 absorbansi pada 450 nm
Nilai 2600 adalah nilai E'",
,
,
untuk 1% larutan P-karoten pada panjang gelombang 450 nm.(1) Total Mikroba, Metode Total Plate Count (TPC) (Fardiaz, 1987)
Terhadap sampel ernulsi dibuat tiga seri pengenceran yang sesuai dengan rnenggunakan larutan NaCl O,85%, lalu dari tiap pengenceran diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalarn cawan petri. Ke dalam cawan dituang sebanyak 15-20 rnl agar cair steril PCA yang telah disterilisasi dan didinginkan sarnpai suhu 47-50°C. Setelah agar padat, diinkubasi pada suhu 37'C selama 3 hari. Jumlah koloni mikroba pada tiap cawan dihitung. Cawan yang dipilih adalah cawan yang mengandung koloni antara 30 dan 300.
Hasil analisa rnetode TPC dilaporkan dengan menggunakan standar yang disebut standard plate count (SPC).
Perhitungan total mikroba:
SPC (Koloni per gram sarnpel) = Jumlah koloni
x
FP Keterangan: FP = faktor pengenceranPenguiian O r ~ a n o l e ~ t i k , Uji Hedonik (Soekarto, 1985)
Dalam uji ini, paneIis dirninta rnengungkapkan tanggapan pribadinya tentang kesukaan atau sebaliknya ketidaksukaan terhadap produk yang disajikan, di samping itu para panelis juga mengemukakan tingkat kesukadketidaksukaan. Contoh uji hedonik disajikan secara acak dan dalam memberikan penilaian panelis tidak boleh menslang-ulang atau n~enlbanding-bandingkan contoh yang disajikan. Penilaian terhadap uji ini hams dilakukan secara spontan. Pengujian ini meliputi kesukaan panelis terhadap rasa, wama, aroma, kekentalan/viskositas, dan penampakan keselumhan. Tingkat kesukaan panelis dinyatakan dalam skala
44
hedonik dan untuk keperluan analisa statistik skala hedonik tersebut ditransfom~asikan ke dalam skala numerik. Bentuk form penilaian d.apat dilihat pada lampiran 11. Skala numerik yang digunakan memiliki rentang skala 1-7.
Skala hedonik Sangat suka Suka
Agak suka Netral
Agak tidak suka Tidak suka Sangat tidak suka
Skala numerik 1 2 3 4 5
