32 PENGUJIAN Escherichia coli PADA BEBERAPA JENIS IKAN PELAGIS
DENGAN METODE ANGKA PALING MEMUNGKINKAN (APM)
TUGAS AKHIR
SAIRA 1422030346
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PENGOLAHAN HASIL PERIKANAN JURUSAN TEKNOLOGI PENGOLAHAN HASIL PERIKANAN POLITEKNIK PERTANIAN NEGERI PANGKAJENE DAN KEPULAUAN
2017
i HALAMAN PENGESAHAN
PENGUJIAN Escherichia coli PADA BEBERAPA JENIS IKAN PELAGIS DENGAN METODE ANGKA PALING MEMUNGKINKAN (APM)
TUGAS AKHIR
SAIRA 14 22 030 346
Sebagai Salah Satu Syarat Untuk Menyelesaikan Studi Pada Politehnik Pertanian Negeri Pangkajene dan Kepulauan
Telah diperiksa dan disetujui oleh pembimbing :
ii HALAMAN PERSETUJUAN PENGUJI
Nama Mahasiswa : Saira
Nim : 14 22 030 346
Jurusan : Teknologi Pengolahan Hasil Perikanan
Judul Tugas Akhir : PENGUJIAN Escherichia coli PADA BEBERAPA JENIS IKAN PELAGIS DENGAN METODE ANGKA PALING MEMUNGKINKAN (APM)
Telah Diperiksa dan Disetujui Oleh:
Tim Penguji
• Zulfitryani DM, SP., MP
• Ir. Mursida, M.Si
• Nur Fitriani, S.PT., M.Si
• Ir. Imran Muhtar, M.Si
iii RINGKASAN
SAIRA 14 22 030 346. PENGUJIAN Escherichia coli PADA BEBERAPA
JENIS IKAN PELAGIS DENGAN METODE ANGKA PALING
MEMUNGKINKAN (APM). (Di bimbing oleh Zulfitriany DM dan Mursida).
Produksi ikan segar yang cukup tinggi membutuhkan tehnologi penanganan yang baik karena ikan yang baik mudah mengalami proses pembusukan. Penangana ikan segar saat ini kurang baik dari segi keamanannya termasuk terhadap proses terhadap prosee penanganan ikan setelah rogor mortis terutama jika ditinjau dari aspek sanitasi dan higienis.
Prinsip dari beberapa spesies ikan laut dan melakukan pengujian angka pertumbuhan Escherichia coli yang ditandai oleh terbentuknua gas dalam tabung durham setelah diinkubasi pada suhu 450C selama 24-48 jam dilanjutka uji biokimia dirujik pada tabel APM (Angka Paling Memungkinkan). Dalam proses pengujian ada beberapa tahap analisis yang mencakup uji pendugaan, uji penegas, uji morfologi, dan uji biokimia
Penyusunan tugas akhir ini menggunakan metode pratek langsung dan hasil wawancara dengan pihak yang terkait di Stasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas 1 Palu-Sulawesi Tengah yang dimulai pada tanggal 5 februari 2016 sampai dengan 5 mei 2016
Tujuan penulisan tugas akhir ini untuk melakukan pengujian escherichia coli. Hasil pengujian Escherichia coli dari 3 (tiga) sampel ikan air laut dimana masih memenuhi standar uji yaitu layang, tuna produk segar dan produk akhir.
iv KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulisan panjatkan kehadiran ALLAH SWT, sang maha agung yang telah memberi setitik ilmu-Nya serta nikmat yang tak terhingga sehingga penulis diberikan ruang dan waktu menyelesaikan tugas akhir ini.
Shalawat serta salam senantiasa tercurah kepada baginda nabi Muhammad SAW, atas contoh teladannya sehingga penulis dapat menyesesaikan tugas akhir dengan judul “PENGUJIAN Escherichia coli PADA BEBERAPA JENIS IKAN PELAGIS DENGAN METODE ANGKA PALING MEMUNGKINKAN (APM)” dengan baik.
Penulisan tugas akhir ini merupakan salah satu syarat terakhir dalam proses pendidikan dari perguruan tinggi, guna meraih gelar Ahli Madya Perikanan (Amd.Pi) pada program studi Teknologi Pengolahan hasil perikanan, politeknik Pertanian Negeri pangkep. Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya buat kedua orang tua: ayahanda Dahlan dan Ibunda Mardina yang senantiasa memberi dukungan secara materi, semangat, moril dan doa selama penulis memulai pendidikan hingga selesai.
Dengan selesainya tugas akhir ini penulis banyak mendapat bimbingan dan dukungan dari berbagai pihak. Karenanya penulis ingin mengucapkan rasa terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya.
1. Bapak Dr. Ir. H. Darmawan, MP. Selaku direktur Politeknik Pertanian Negeri Pangkep yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan di kampus Politeknik Pertanian Negeri Pangkep.
v 2. Ibu Ir. Nurlaeli Fattah, M.Si selaku ketua jurusan Teknologi Pengolahan Hasil
Perikanan.
3. Terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada ibu Zulfitriany DM., SP., MP selaku pembimbing I dan bapak Ir.
Mursida, M.Si selaku pembimbing II, yang banyak mengarahkan dalam penulisan tugas akhir ini.
4. Terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada bapak Khoirul Makmun, S.Pi., M.M selaku Kepala Stasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamana Hasil Perikanan Kelas 1 Palu (SKIPMHP), Sulawesi tengah.
5. Terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada ibu Sukmawati Gaffar, S,ST, Pi., M.Si selaku Seksi Teknologi Pengolahan dan Pengujian Mutu hasil perikanan (SBKIPMHP) Palu, Sulawesi tengah.
6. Terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada selaku pembimbing lapangan memberi bimbingan dan arahan dalam melaksanakan pengalaman Kerja Praktek Mahasiswa (PKPM) di UPTD.
Balai Pembinaan dan pengujian Mutu hasil perikanan (BPPMHP) Makassar, Sulawesi selatan.
7. Terima kasih penulis sampaikan kepada kelima saudara dan saudari, Syarif, Muh. Syawal, Mardalia, Salmia, Muskira, dan Mardia yang selama ini mendukung selama kuliah.
vi 8. Terima kasih kepada teman-teman sesama mahasiswa yang melaksanakan Pengalaman Kerja Praktek Mahasiswa (PKPM) di SKIPMHP. Stasiun karantina ikan pengendalian Mutu Hasil Perikanan kelas 1 palu, Sulawesi tengah.
9. Rekan-rekan mahasiswa angkatan XXVII dijurusan Teknologi Pengolahan Hasil Perikanan yang telah memberikan bantuan motivasi dan saran selama penyusunan tugas akhir ini.
Penulis juga menyadari bahwa tulisan ini masih jauh dari kesempurnaan, oleh karena itu, saran dan kritikan yang bersifat membangun dari pembaca sangat penulis harapkan untuk perbaikan tugas akhir ini. Semoga tulisan ini dapat bermanfaat untuk semua pihak terutama bagi penulis dan mendapat berkah dari Allah SWT, Amin.
Pangkep, Agustus 2017
Penulis
vii DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN PENGESAHAN ... i
LEMBARAN PENGESAHAN ... ii
RINGKASAN ... iii
KATA PENGANTAR ... iv
DAFTAR ISI ... vii
DAFTAR TABEL ... x
DAFTAR GAMBAR ... xi
DAFTAR LAMPIRAN ... xii
I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Tujuan dan Kegunaan ... 3
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Escherichia coli ... 4
2.2 Klasifikasi Escherichia coli ... 4
2.3 Karakteristik Morfologi Escherichia coli ... 4
2.4 Manfaat dan bahaya Escherichia coli ... 5
2.5 Uji Escherichia coli ... 6
2.5.1 Pengujian kualitatif ... 7
2.5.2 Pengujian kuantitatif ... 8
2.6 Metode APM (Angka Paling Memungkinkan) ... 8
2.7 Ikan Layang dan Tuna ... 9
viii III. METIDOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat ... 11
3.2 Metode Pengambilan Data ... 11
3.3 Alat dan Bahan ... 12
3.4 Prosedur kerja ... 14
3.4.1 Sanitasi dan sterilisasi ... 14
3.4.2 Sterilisasi Alat dan Bahan ... 15
3.4.3 Pembuatan Media.. ... 17
3.4.4 Preparasi/Pengambilan Sampel ... 22
3.5 Tahap Pengujian Mikrobiologi. ... 23
3.5.1 Uji Pendugaan Coliform. ... 23
3.5.2 Uji Pendugaan Presuntive ... 23
3.5.3 Uji Pendugaan Escherichia coli ... 24
3.5.4 Uji Penegasan Escherichia coli ... 25
3.5.5 Uji Morfologi ... 26
3.5.6 Uji Biokimia ... 27
3.5.7 Uji Indol ... 28
3.5.8 Uji Voges Proskauer(VP) ... 28
3.5.9 Uji Methyl Red(MR) ... 29
3.5.10 Uji Sitrat ... 30
IV. HASIL PEMBAHASAN 4.1 Hasil ... 32
4.2 Pembahasan ... 33
ix V. KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan ... 38 5.2 Saran ... 38 DAFTAR PUSTAKA ... 39
x DAFTAR TABEL
Nomor Halaman
Teks
1. Batas maksimum cemaran mikroga dalam pangan ... 6
2. Reaksi IMVIC pada uji Escherichia coli ... 7
3. Identifikasi Escherichia coli pada beberapa sampel ikan ... 32
4. Uji biokimia pada Escherichia coli yang terduga ... 33
xi DAFTAR GAMBAR
Nomor Halaman
Teks
1. Escherichia Coli ... 5
2. Media Bufferfiend’s Phosphate Buffer ... 17
3. Media Lauryil Triptose Broth ... 18
4. Media Ec Broth ... 18
5. Media Levin’s Eosin Metil Blu Agar ... 19
6. Media Plate Count Agar ... 20
7. Media Simons Citrate Agar ... 20
8. Media Mr-Vp ... 21
9. Media Tryptone Broth ... 22
10. Hasil Inokulasi Uji Penduga ... 23
11. Uji Penduga Coliform ... 24
12. Hasil Uji Penduga Escherichia Coli ... 25
13. Koloni Positif Pada Media L-Emba ... 25
14. Hasil Uji Morfologi ... 27
15. Escherichia Coli Positif dan Negatif Pada Media TB ... 28
16. Escherichia Coli Positif dan Negatif Pada Media VP ... 29
17. Escherichia Coli Positif dan Negatif Pada Media MR ... 30
18. Escherichia Coli Positif dan Negatif Pada Media SCA ... 31
xii DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Halaman Teks
1. Peralatan serta fungsinya dalam pengujian Escherichia coli ... 41 2. Indek APM dengan tingkat kepercayaan 95% ... 45
1
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Potensi perikanan laut indonesia yang terdiri dari potensi perikanan pelagis dan perikanan demersal tersebar pada hampir semua bagian perairan laut indonesia. Ikan laut merupakan salah satu spesies ikan yang hidup di dalam air laut. Ikan laut berbeda sekali dengan air tawar yang biasanya hidup pada kadar garam yang relatif lebih rendah dari kadar garam yang berada pada cairan tubuhnya, ikan laut sangat pintar dalam menyesuaikan diri dalam lingkungannya di mana pada tempat atau air yang tinggi kadar airnyadibandingkan kadar garam yang terdapat pada tubuhnya. Dengan kata lain ikan laut memiliki kadar garam yang rendah di bandingkan dengan kadar garam yang terdapat pada lingkungannya sendiri.
Sumberdaya ikan air laut di indonesia dikelompokkan mejadi sumberdaya ikan pelagis sumberdaya ikan pelagis penyebarannya terutama perairan dekat pantai, saat terjadi proses kenaikan massa air laut (upwelling) karena makanan utamanya adalah plankton. sumberdaya ini daya dapat membentuk biomassa yang sangat besar sehingga merupakan salah satu sumberdaya perikanan yang cukup melimpah di perairan indonesia.
Umumnya ikan dan prodak perikanan merupakan bahan pangan yang mudah rusak (perishable food) karena mengandung protein dan air cukup tinggi, oleh karena itu perlakuan benar pada ikan setelah ikan tertangkap sangat penting peranannya. Perlakuan tersebut dapat dilakukan dengan penurunan suhu seperti pendinginan dan pembekuan untuk mencegah kemunduran mutu ikan. Dibeberapa
2 negara maju ikan dikenal sebagai suatu komoditi yang populer karena memiliki rasa yang enak dan bagus untuk kesehatan. Ikan merupakan sumber asam lemak Omega3 terutama untuk jenis seperti tuna, tongkol, kembung dan kemuru.
Menurut Murniyati dan Sunarman (2000) berpendapat bahwa untuk mempertahankan mutu ikan segar yang dikomsumsi harus mendapatkan penanganan secara benar, ikan harus diperhatikan sebagai bahan makanan lain.
Kesegaran ikan merupakan hal yang sangat penting dalam menetukan keseluruhan mutu dari pada suatu produk perikanan. mutu kesegaran dapat mencakup rupa atau kenampakan, rasa, bau dan juga tekstur yang secara sadar ataupun tidak sadar dinilai dari pembeli atau pengguna dari prodak tersebut.
Nuarisma dan Fatmawati (2012), menjelaskan bahwa ada tuiga faktor yang mempengaruhi mutu ikan segar yaitu cara penangkapan, faktor biologis dan pengaruh selama penanganan.
Pengujian mutu kesegaran ikan penting untuk meningkatkan tingkat komsumsi ikan (konsumsi protein) masyarakat indonesia. ikan yang dikomsumsi harus dalam keadaan segar. penanganan yang baik oleh para nelayan dan pedangan dipasaran dapat mutu ikan tetap segar sehimgga protein serta kandungan Omega3 tidak rusak akibat aktifitas mikroorganisme. jika penanganannya kurang tepat, protein yang terkandung dalam ikan akan dimanfaatkan oleh mikroorganisme untuk berkembang biak dan menjadikan kualitas ikan menurun. Ikan merupakan komoditas yang rentang terhadap kerusakan fisik, kimia dan mikrobiologi. Kerusakan ini terutama diakibatkan oleh buruknya penanganan terhadap ikan baik penanganan saat penangkapan, distribusi
3 dan penjualan. Selain itu, terdapat faktor internal dari ikan itu sendiri yang menyebabkan ikan mudah rusak (Walbaum, 2003).
Menurut Oscar dkk, (2009), beberapa bakteri seperti Salmonella sp, Shigella, Escherichia coli, Enterococci, dan Clostridium sering mengkontaminasi
ikan segar. Umumnya makanan-makanan yang menjadi sumber infeksi dan keracunan oleh bakter adalah makanan berasam rendah seperti daging, telur, ikan dan prodak olahannya.
Metode APM adalah metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan medium cair dalam tabung reaksi yang pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statistik. Tabung positif ditunjukan oleh adanya pertumbuhan bakteri dan gas.
1.2 Tujuan dan Kegunaan
Tujuan penulisan tugas akhir ini adalah melakukan pengujian Escherichia Coli terhadap ikan air laut (layang dan tuna) dengan metide APM.
Kegunaan penulisan tugas akhir ini adalah menambah wawasan dan keterampilan dalam melakukan pengujian Escherichia Coli terhada ikan air laut (layang dan tuna) dengan metode APM.
4
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Escherichia coli
Escherichia coli adalah salah jenis spesies utama bakteri gram negetif.
Pada umumnya bakteri-bakteri yang ditemukan oleh Therdor Escherichia coli ini, dapat menyebabkan masalah bagi kesehatan bagi manusia seperti diare, muntaber dan masalah pencernaan lainnya. Oleh karena itu ikan dapat menjadi sumber atau perantara berbagai penyakit seperti tipus, disentri, dan kolera. Bakteri- bakteri yang dapat menyebabkan penyakit tersebut adalah Salmonella typhosa, Shigella dysenteriae, dan vibrio koma. (Widiyanti dan Ristanti)
2.2 Klasifikasi Escherichia coli
Klasifikasi E.coli menurut Songerdan Post (2005) adalah sebagai berikut:
Kongdom : Bakteria Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Family : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia
Spesies : Escherichia coli
2.3 Karakteristik Morfologi Escherichia coli
Bakteri E.coli merupakan spesies dengan habitat alami dalam saluran pencernaan manusia maupun hewan. Escherichia coli pertama kali diisolasi oleh Thedor Escherich dari tinja seorang anak kecil pada tahun 1885. Bakteri ini berbentuk batang, berukuran 0,4-0,7 x 1,0-3,0 µm,termasuk gram negatif, dapat
5 hidup seliter maupun berkelompok, umumnya motil, tidak membentuk spora, serta fakultatif anaerob. (Carter & Wise 2004)
Gambar 1.Escherichia coli 2.4 Manfaat dan Bahaya Escherichia coli
Bakteri Escherichia coli berfungsi untuk menekan pertumbuhan bakteri jahat, dia juga membantu dalam proses pencernaan termasuk pembusukan sisa-sisa makanan dalam usus besar. Fungsi utama yang lain dari Escherichia coli membantu memproduksi vitamin K melalui proses pembusukan sisa makanan.
Vitamin K berfungsi untuk pembekuan darah misalnya saat terjadi pendarahan seperti pada luka/mimisan vitamin K bisa membantu menghentikannya.
Dalam jumlah yang berlebihan dapat mengakibatkan diare, dan bila bakteri ini menjalar kesistem/organ tubuh yang lain dapat menginfeksi. Seperti pada saluran kencing, jika bakteri Escherichia coli sampai masuk kesaluran kencing dapat mengakibatkan infeksi saluran kemih/kencing (Jawests, 2005).
6 Tabel 1. Batas maksimum cemaran mikroga dalam pangan.
HASIL PERIKANAN
Ikan Segar ALT (30 C, 72 jam) 5 ×105 koloni / gram
APM Escherichia coli < 3/g
Salmonella sp negatif / 25 g
Vibrio cholera negatif / 25 g Vibrio Parahaemolyticus negatif / 25 g Molusca, crustaceae dan
ekinodermata segar
ALT (30 C, 72 jam) 5 ×105 koloni / gram
APM Escherichia coli < 3/g
Salmonella sp negatif / 25 g
Vibrio Cholerae negatif / 25 g
Vibrio Parahaemolyticus negatif / 25 g
sumber: SNI 7388-2009
2.5 Pengujian Bakteri Escherichia coli
Pengujian merupakan suatu kegiata dimana suatu sistem atau komponen dijalankan dalam kondisi tertentu, yang mana hasilnya diamati atau direkam untuk kemudian dilakukan evaluasi.
Prinsip uji Escherichia coli yaitu pertumbuhan Escherichia coli yang ditandai oleh terbentuknya gas di dalam tabung durham setelah diinkubasikan dalam pembenihan yang cocok pada suhu 450C selama 24-48 jam, yang diikuti oleh uji biokimia dan selanjutnya dimasukkan kedalam tabel APM. Selain itu prinsip yang lain dalam pengujian Escherichia coli ini adalah menumbuhkan bakteri dalam suatu media cair dan perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif setelah diinkubasi pada suhu dan waktu yang tertentu. Dalam
7 prosedur pengujian terdapat beberapa tahap analisa yang mencakup uji penduga, uji penegasan, uji morfologi, uji biokimia, uji produksi gas dan laktosa.
(Rismayanti 2011).
Prinsip pengujian deteksi Escherichia coli menurut metode analisis Mikrobiologi (BPOM, 2008) yaitu pertumbuhan koloni Escherichia coli pada media lempeng selektif dan dilanjutkan dengan konfirmasi melalui uji biokimia.
pada pengujian deteksi Escherichia coli LEMB (Levine’s Eosyn Methylen Blue) sebagai media lempeng selektif. Koloni spesifik yang tumbuh (koloni hijau metalik dengan titik hitam ditengahnya) selanjutnya dilakukan uji biokimia untuk identifikasi Escherichia coli. Pernyataan hasil dari uji deteksi Escherichia coli yang merupakan bakteri gram negatif berbentuk batang pendek dan pada reaksi IMVIC memberi hasil yang dapat dilihat pada tabel berikut:
Tabel 2. Reaksi IMVIC pada uji Escherichia coli.
Jumlah Media Adanya Pertumbuhan
Indol Positif
Metil red Positif
Voges Proskour Negatif
Cirtate Negatif
Sumber : BPOM, (2008) 2.5.1 Pengujian Kuantitatif
Uji kuantitatif mikroba dalam prduk pangan akan berfungsi sebagai acuan batasan mutu dan daya tahan (daya simpan) produk yang telah dihasilkan. Jika ditemukan mikroba yang telah melebihi standar, maka dapat dipastikan produk tersebut tidak akan bertahan lama. Hal tersebut dikarenakan pertumbuhan mikroba yang akan merusak produk. Ada beberapa cara untuk mengukur atau menghitung
8 mikroba yaitu dengan perhitungan jumlah sel, perhitungan massa sel secara lansung dan pendugaan massa sel secara tak langsung. Perhitungan jumlah sel dapat dilakukan dengan 3 metode yaitu dengan hitung mikroskopik, MPN (Most Probably Number), dan hitung cawan (Fardiaz 1989)
2.5.2 Pengujian kualitatif
Uji kualitatif pada suatu produk pangan atau bahan pangan lebih mengarah pada pengecekan untuk melihat tingkat keamanan suatu produk untuk dapat dikomsumsi oleh masyarakat. Pengecekan uji kualitatif diarahkan untuk mengecek mikroba-mikroba yang dapat berakibat pada manusia setelah mengkomsumsi makanan tersebut. Uji kualitatif yaitu metode analisis yang merespon berupa presense atau absence (ada atau tidak ada ) yang dideteksi baik secara langsung maupun tidak langsung, terhadap sejumlah sampel. Perhitungan langsung terhadap sampel yaitu salah satunya dengan alat bantu mikroskop, sedangkan perhitungan tidak lansung yaitu dengan beberapa metode perhitungan seperti MPN (Most Probably Number) dan SPC (Standard Plate Count).
2.6 Metode APM (Angka Paling Memungkinkan)
Metode APM adalah metode untuk menghitung jumlah mikroba dengan menggunakan tabung reaksi pada umumnya setiap pengenceran menggunakan 3 atau 5 seri tabung dan perhitungan yang dilakukan merupakan tahap pendekatan secara statistik. Tabung positif ditunjukan oleh adanya pertumbuhan bakteri dan gas.
Metode APM biasanya dilakukan untuk menjumlah mikroba dalam contoh berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat.
9 Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui beberapa macam uji seperti uji kuantitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisa dengan metode APM), uji penguat, dan uji pelengkap. Nilai APM ini diperoleh dengan anggapan sebagai berikut:
1. Bakteri dalam contoh menyebar secara random
2. Bakteri dalam contoh tidak berkelompok atau cluster, tetapi saling terpisah 3. Organisme yang terdapat dalam contoh dapat tumbuh dalam medium
selama inkubasi
4. Kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan, seperti media dan waktu inkubasi Metode APM digunakan untuk menduga organisme dalam jumlah sedikit (kurang dari 100/g) terutama susu, air dan makanan yang mempunyai. Kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh cukup untuk memberikan hasil yang singnifikan dan umumnya terdapat dalam tabel APM, sedangkan kombinasi yang tidak mungkin diabaikan. Tabel APM mempunyai tingkat kepercayaan 95%. Jika kombinasi tabung-tabung positif yang diperoleh tidak termasuk dalam tabel APM maka contoh asli harus dilakukan pengujian kembali. Dan jika ini tidak dapat dilakukan, maka anlis harus membandingkan dengan tabel APM yang lain untuk menghitung nilai APM berdasarka hasil yang diperoleh.
2.7 Ikan Layang dan Tuna
Ikan tuna merupakan jenis ikan pelagis yang banyak ditangkap di perairan indonesia. penyebaran ikan tuna di kawasan berat indonesia terutama terdapat di samudera hindia.
10 Ikan layang merupakan ikan yang mempunyai kemampuan bergerak dengan cepat di air laut. Tingginya kecepatan tersebut dapat dicapai karena bentuk tubuhnya seperti cerutu dan pempunyai sisik yang halus. Ikan layang dalam keadaan segar seluruh tubuhnya berwarnah merah jambu dan pada bagian belakan tutup insang terdapat totol hitam dan termasuk ikan perenang cepat yang hidup berkelompok dilaut yang jernih dan bersalinitasi tinggi.
11
III. METODOLOGI
3.1 Waktu dan Tempat
Penulis tugas akhir ini berdasarkan Pengalaman Kerja Praktek Mahasiswa (PKPM) semester genap tahun ajaran 2016/2017, Pelaksanaan Pengalaman kerja praktek mahasiswa (PKPM) ini berlangsung selama 3 bulan dilaksanakan di Laboratorium Bakteri Stasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu Kelas 1 Palu (SKIPM) Sulawesi Tengah.
3.2 Metode Pengambilan Data
Cara pengambilan data yang digunakan dalam laporan tugas akhir meliputi data primer dan data sekunder.
1. Data Primer
Adalah data-data yang diambil langsung, diperoleh dari sumbernya dengan menggunakan cara :
• Pengamatan data
Pengamatan data untuk pengumpulan data dengan melihat obyek-obyek yang diteliti secara langsung, misalnya data diperoleh secara benar dan nyata.
• Wawancara
Wawancara dilakukan atau digunakan untuk mengumpulkan data dengan mengajukan pertanyaan secara langsung pada narasumber sehingga didapatkan jawaban yang lengkap.
• Eksperimen
Metode ini dilakukan dengan cara melakukan percobaan dan pemeriksaan terhadap sampel yang dianalisis.
12
• Partisipasif
Metode ini dilakukan dengan cara melaksanakan proses pengujian setiap tahap dengan ketelitian dan pemahaman yang baik.
2. Data Sekunder
Data sekunder adalah data yang diperoleh dari orang lain atau sumber sekunder dan telah tersusun dalam bentuk dokumen. Data ini diperoleh dari materi kulia, studi literature dan instansi yang terkait sebagai bahan perbandingan
3.3 Alat dan Bahan
Semua alat dan media yang digunakan untuk pengujian Escherichia coli harus dalam keadaan steril. Adapun sampel yang diuji dalam pengujian ini yaitu hasil perikanan (Layang, Tuna loin prodak segar dan Tuna loin Prodak akhir).
3.3.1Alat
Alat pembuatan media
• Autoclave
• Erlemeyer
• Gelas ukur
• Timbangan analiti
• Spatula
• Stirer
• Hot plate stirer
• Laminari air flow
• Tabung reaksi
• Tabung durham
13
• Rak tabung
• Magnetic sturer
Alat yang digunakan untuk proses uji E. Coli (Escherihia Coli)
• Laminari air flow
• Pipet folume 1 ml
• Bunsen
• Tabung reaksi
• Waterbath suhu 450c
• Rak tabung
• Gelas ukur
• Inkubator suhu 42.40c
• vortex 3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan dalam pembuatan media
• Aquades digunakan sebagai pelarut
• Butterfild’s Phosphate Butter
• Laury Triptose Broth(LTB)
• EC Broth
• Levine’s –Eosin Methylen Blu Agar
• Plate Count Agar
• Simons Citrate Agar
• Methyl Red-Voges Proukauver
• Tryptone Broth
14
• Kasa/Kapas
• Aluminum-foil Media dan pereaksi
• Butterfild’s Phosphate Butter (BPB)
• Laury Triptose Broth(LTB)
• EC Broth
• Levine’s –Eosin Methylen Blu Agar
• Plate Count Agar (PCA)
• Simons Citrate Agar (SCA)
• Methyl Red-Voges Proukauver (MR-VP)
• Tryptone Broth (TB)
• Pereaksi kovacs
• Indikator MR
• Pereaksi VP 3.4 Prosedur kerja
3.4.1 Sanitasi dan Sterilisasi (fumigasi) Ruang Pengujian
Sanitasi dilakukan hampir setiap hari sebelum melakukan pengujian baik dari pekerja maupun peralatan. Sterilisasi ruangan dilakukan satu kali dalam tiga bulan, untuk memastikan ruangan tetap dalam keadaan steril sehingga tidak mengganggu pada saat pengujian berlangsung dan baktri yang diinginkan tumbuh tampa tidak terpengaruh oleh bakteri lain yang ada di sekitaran ruangan. Bahan dan alat digunakan dalam sterilisasi ruangan yaitu: Bahan fomalin (formaldehyde), pottasium fermanganat dan aluminium foil. Alat baki, timbagan
15 analitik,dan gelas ukur adapun perbandingan bahan yang digunakan formalin 80ml, pottasium fermanganat 0,2gr dan aluminium foil dipotong persegi sampai permukaan baki tertutupi. Setelah semua masing-masing bahan siap dan telah ditimbang 80ml formalin dan pottasium 0,2gr untuk di setiap ruagan semua pintu dan jendela atau fentilasi didalam ruang pengujian ditutup dengan menggunakan lakban kecuali pintu utama karena kita harus menuangkan formalin ke baki yang berisi pottasum fermangenat sebagai prosedur sterilisasai ruangan (fumigasi) setelah semua penuangan selesai disetiap ruangan pintu utama ditutup dengan menggunakan lakban. Waktu yang digunakan untuk fumigasi yaitu 48 jam.
Adapun sterilisasi dengan menggunakan lampu UV yang disediakan tidak hanya dalam laminary air flow tetapi di setiap ruang pengujian yang di pasang dibagian dataran langit-langit dan akan di hidupka setelah ruangan telah dibersihkan dengan cara manual agar sterilisasinya sempurna atau memuaskan dalam hal steril. Hal ini disesuikan dangan pernyataan (Cappuccino, 1983) jika sterilisasi berlangsung secara sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten dari kehidupan mikroba, akan diluluhkan.
3.4.2 Sterilisasi Alat dan Bahan
Sterilisasi kering dilakukan dengan menggunakan oven, sterilisasi dengan cara ini diterapkan pada benda atau alat yang tahan terhadap suhu tinggi seperti cawan petri, tabung reaksi, tabung durham, gelas ukur, erlemeyer dll. Sebelum alat tersebut di oven di lakukan sterilisasi basah dengan cara dipanaskan dengan suhu tinggi dan menggunakan panci yang berisi air sebanyak mungkin sampai alat yang disterilkan didalam panci tersebut terendam setelah 2jam pemanasan tersebut
16 di lakukan pencucian dengan mengguna deterjen dan di bilas dengan menggunakan air bersih, setelah bersih dan kering alat sudah bisa di masukkan kedalam oven sebelum di oven semua alat di bungkus dengan kertas. Hal ini sesuai dengan pernyataan Hadioetomo (1985) bahwa bahan-bahan yang disterilkan harus dilindungi dengan cara membungkus, menyumbat dan mentaruhnya dalam suatu wadah tertutup untuk mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari oven. Ditambahkan oleh Dwijoseputro (1994) bahwa alat-alat dari gelas di masukkan ke dalam oven selama 2-3 jam dalam temperatur 1600- 1700c, hal ini bergantung pada banyak sedikitnya muatan yang dimasukkan ke dalam oven. Setelah disterilkan, alat-alat tersebut di kedalam lemari steril dan dikeluarkan sewaktu di gunakan.
Sterilisasi basah dilakukan dengan autoclave. Metode ini digunakan untuk mensterilkan media, aquades dan alat-alat yang terbuat dari plastik dimasukkan kedalam autoclave dan suhu yang digunakan suhu 1210c dengan tekanan atm selama 15 menit. Hal ini sesuai dengan pendapat Hadioetomo (1985) bahwa sterilisasi basah digunakan dalam autoclave atau strelisator uap dan tekanan 1 atm pada suhu 1210c selama 15 menit.Ditambahkan pula oleh dwidjoseputro selama 15-20 menit. Perhitungan waktu 15 menit di mulai semenjak termometer pada autoclave menunjuk 1210c, penutup autoclave dapat dibuka setelah termometer menunjukkan angka nol, dan tekanan autoclave sudah turun hingga 0 atm.
17 3.4.3 Pembuatan Media
Ada beberapa media yang di gunakan dalam proses pertumbuhan bakteri Escherihia Coli yaitu:
1. BPB (Butterfiend's Phosphate Buffer) Pembuatan media Butterfiend's Phosphate Buffer (BPB) menggunakan
bahan KH2PO4 dan aquades. Larutkan KH2PO4 sebanyak yang diiginkan kedalam aquades yang telah disiapkan sebagai sebagai (pelarut). Ukur PH (7.2).
Tambahkan aquades hingga volume larutan menjadi 1 liter (Laritan Stok). simpan dalam refrigerator. Untuk membuat larutan blangko: Ambil 1,25 ml larutan stok dan tambahkan aquades hingga volume 1 liter. Selanjutnya masukkan 9 ml ke dalam tabung-tabung reaksi dan sterilkan menggunakan autoclave selama 15 menit pada suhu 1210c dan tekanan 1 atm.
Gambar 2. Media Bufferfiend’s Phosphate Buffer 2. LTB (Lauryi Triptose Broth)
Pembuatan media lauryi triptose broth(LTB) menggunakan bahan lauryi triptose broth dan aquades. Larutkan LTB sebanyak yang ingin di buat dengan menggunakan aquades yang telah disiapkan sebagai( pelarut), distribusikan kedalam tabung-tabung reaksi yang telah berisi tabung durham lanjutkan dengan
18 sterilisasi p ada suhu 1210c selama 15 menit, tekana 1 atm. pH akhir media 6,8±0,2.
Gambar 3. Media Laurryi Triptose Broth 4. EC Broth (agar)
Pembuatan media ec broth menggunakan media Ec broth dan aquades.
Larutkan ec broth sebanyak yang ingin dibuat dengan menggunakan aquades yang telah disiapkan sebagai (pelarut),distribusikan ke dalam tabung-tabung yang telah berisi tabung durham, selanjutnya sterilisasi pada suhu 1210c, selama 15 menit dengan tekanan 1 atm, pH akhir media 6,7-7,1.
Gambar 4. Media EC Broth 5. L-EMBA (Levine's- Eosin Metil Blu Agar)
Pembuatan media levine's eosin metil blu agar menggunakan bahan levines- eosin metil blu agar dan aquades. Larutkan L-EMBA sebanyak yang ingin dibuat
19 dengan menggunakan aquades yang telah disiapkan sebagai (pelarut), panaskan sampai mendidih larut dengan menggunakan Hot Plate Stirer, selanjutnya disterilkan pada suhu 1210c selama 15 menit dengan tekanan 1 atm diukur pH akhir media 7,0±,2. Biarkan media dingin dengan suhu (±600c), tuang kedalam cawan petri steril.
Gambar 5. Media Levin’s-Esin Metil Blu Agar 6. PCA (Plate Count Agar)
Pembuatan media plate count agar menggunakan bahan plate count agar dan aquades. Larutkan PCA sebanyak yang ingin di buat dengan menggunakan aquades yang telah disiapkan sebagai pelarut (pelarut), panaskan sampai mendidih hingga bahan larut, selanjutnya sterilisasi pada suhu 1210c selama 15 menit dengan tekana 1 atm, diukur pH akhir 7,0±2, dan tuang kedalam cawan petri steril.
20 Gambar 6. Media Plate Count Agar
7. SCA (Simons Citrate Agar)
Pembuatan media simons citrate agar menggunakan bahan Simons citrate agar CA dan aquades. Larutkan SCA sebanyak yang ingin di buat dengan menggunakan aquades yang telah disiapkan sebagai pelarut, panaskan sampai mendidih, sterilisasi pada suhu 1210c selama 15 menit dengan tekanan atm, pH akhir media 6,5-6,7.
Gambar 7. Media Simons Citrate Agar
21 8. MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer)
Pembuatan media methyl red-voges proskuer menggunakan bahan Methyl Red-Vorges Proskuer dan aquasdes. Larutkan MR-VP sebanyak yang ingin dibuat dengan menggunakan aquades yang telah disiapkan sebagai pelarut (pelarut), panaskan sampai mendidih hingga bahan larut.Tuang kedalam tabung reaksi yang steril. Sterilkan media pada suhu 1210c selama 15 menit dengan tekana 1 atm, pH akhir media 6,8-7,0.
Gambar 8. Media MR-VP 9. TB (Tryptone Broth)
Pembutan media trytone broth menggunakan bahan tryptone broth dan aquades. Larutkan TB sebanyak yang ingin di buat dengan menggunakan aquades yang telah disiapkan sebagai (pelarut), panaskan sampai mendidih hingga larut.
Tuang kedalam tabung reaksi yang steril, selanjutnya disterilkan pada suhu 1210c selama 15 menit dengan tekana 1 atm, pH akhir pada media 7,3±0,2.
22 Gambar 9. Media Tryptone Broth
Untuk pembuatan media LTB, EC Broth, L-EMBA, PCA, SCA, TB, dan MR-VP tersebut memiliki rumus yang sama yaitu:
Media =
Konsetrasi bahan tertera pada label kemasan/botol× aquades 1000
Sedangkan media BPB memiliki rumus yang berbeda yaitu:
Reaksi =
Konsetrasi bahan tertera pada label kemasan/botol × aquades 500
3.4.4 Preparasi/pengambilan Sampel
Setiap sampel yang diambil masing-masing ditimbang 25g setelah di timbang dilakukan pengecilan ukuran atau dihaluskan dengan menggunakan lumpang porselin, setelah halus dimasukkan kedalam gelas ukur yang berisi Butterfiend’s Phospate Buffer (BPB) sebanyak 225ml kemudian homogenkan selama 2 menit dan pada gelas ukur sudah masuk perhitungan 101.
23 3.5. Tahap Pengujian Escherichia coli
3.5.1 Uji Pendugaan Coliform
Siapkan pengenceran 10-2 dengan cara melarutkan 1ml larutan 10-1 kedalam 9 ml dan 10-2 ambil 1ml larutan pengenceran bufferfield’s posphate buffer. Lakukan pengenceran selanjutnya sesuai dengan pendugaa, pada setiap
pengenceran di lakukan pegocoka/penghomgen minimal 25 kali. Ambil 1ml dari tabung 10-1 dengan menggunakan pipet steril ke dalam lauryl tryptone broth (LTB) yang berisi tabung durham. Media laktosebroth juga dapat digunakan.
Inkubasi tabung-tabung tersebut pada suhu 350c ± 0,50c. Perhatikan gas yang terbentuk setelah dilakukan penyimpana selama 24-48 jm. Tabung-tabung positif ditandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung durham lanjutkan uji
“penegasan koliform” pada tabung-tabung positif. SNI 2332. 1:2015.
Gambar 10. Hasil Inokulasi Uji Penduga Coliform 3.5.2 Uji Pendugaan Coliform (Presumptive Coliform)
Inokulasi tabung-tabung LTB yang positif ke tabung yang berisi tabung durham dengan menggunakan tabung ose yang steril. Simpan tabung yang telah diinokulasi kedalam inkubasi pada suhu 350c selama 48 jam setelah penyimpanan
24 tabung diamati, tabung yang positif di tandai dengan kekeruhan dan gas dalam tabung Durham. Tentukan angka paling memungkinkan (APM) untuk koliform berdasarkan jumlah tabung yang positif dengan angka paling memungkinkan (APM). Nyatakan angka koliform sebagai “APM/g” untuk produk perikanan selain shellfish. SNI 2332. 1: 2015.
Gambar 11. Uji pendugaan coliform
3.5.3 Uji Pendugaan Escherihia Coli (faecal coliform, presumptive E.coli) Inokulasikan dari setiap tabung LTB yang positif ke tabung-tabung EC Broth yang berisi tabung Durham dengan menggunakan jarum ose yang steril.
Inkubasi ke dalam waterbath sirkulasi selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45,50c ± 0,20c. Waterbath harus dalam keadaan selalu bersih air didalamnya harus lebih tinggi dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi. Periksa tabung EC broth yang telah disimpan selama 48 jam, jika terjadi keruh pada tabung dan gas terbentuk dalam tabung Durham maka hasil tersebut merupakan positif. Tentukan nilai angka paling memungkinkan (APM) berdasarkan jumlah tabung EC broth yang positif dengan menggunakan angka paling memungkinkan (APM).
25
Gambar 12. Hasil uji pendugaan Escherichia coli 3.5.4 Uji Penegasan Escherihia Coli (comfirmed E.coli)
Dari tabung tabung EC brot yang positif dengan menggunakan jarum ose gores ke L-EMBA agar. Ingkubasi selama 18-24 jam pada suhu 350c ± 0,50c.
Amati hasil pertumbuhan pada cawan yang berisi media dan ciri khas (typical) E.coli positif pada L-EMBA yaitu hitam pada bagian tengah,datar dan dengan atau tanpa hijau metalik. Ambil sampai 5 koloni (typical) E.coli dari masing- masing cawan L-EMBA dan gores ke media agar miring PCA plate count agar dengan menggunakan jarum ose Ingkubasi selama 24 jam dan lakukan pengujian selanjutnya.
Gambar 13. Koloni positif pada media L-EMBA
26 3.5.5 Uji Morfologi
Uji morfologi menggunakan mikroskop dengan melakukan pewarnaan gram dari setiap kolono E.coli terduga. Pewarnaan bertujuan untuk membedakan kelompok bakteri gram positif dan negatif. Adapun cara kerja atau prosedur kerja dalam pewarnaan gram sebagai berikut:
1. Siapkan kaca objek atau kaca pereparat yang sudah disterilkan dengan menggunakan aquades yang steril.
2. Ambil kul tur murni bakteri dari PCA dan dioleskan atau dibuat tiga titik diatas kaca objek yang telah ditetesi aquades steril untuk pengenceran atau meratakan bakteri hingga kering diatas kaca objek untuk mempermudah mmelihat sel bentuk bakteri pda mikroskop.
3. Selanjutnya ditetesi kristal violet/ungu sampai semua olesan tertutupi lalu didiamkan selama 1 menit.
4. Setelah 1 menit dilakukan pencucian dengan air mengalir sampai cristal violet larut, keringkan dengan cara diagin-aginkan sampai kering.
5. Setelah kering ditambahkan lagi larutan iodium sampai permukaan bakteri tertutupi dan didiamkan selama 1 menit, setelah 1 menit cuci dengan air mengalir dan keringkan, selanjutnya tambahkan asam alkohol/ etanol 95%
selama 30 detik hingga warna ungu hilang dan cuci denag air megalir, keringkan dengan cara diangin-aginkan.
6. Bubuhkan larutan safranin selamat 1 menit dan cuci kembali dengan menggunakan air mengalir.
27 7. Kaca objek di amati dibawah mikroskop dengan menggunakan lensa okuler 10× obyektif 100×. Jika penampakan sel berwarna ungu maka bakteri bersifat gram positif, tetapi jika berwarna merah bersifat gram negatif.
Gambar 14. Hasil uji morfologi
3.5.6 Uji Biokimia
Uji biokimia dilakukan untuk melihat keberadaan Escherichia coli pada empat sampel ikan (Layang, Tuna loin segar, dan Tuna loin prodak akhir) yang berasal dari air laut dengan mengambil setiap hasil positif dari L-EMBA dan hasil positi dari Levine’s Eosin Methylen Blue agar hanya ada dua sampel yaitu ikan Tongkol dan Bandeng sedangkan pada sampel Tuna loin tidak dilakukan uji lanjutan karena memiliki hasil yang negatif atau tidak tumbuh pada media L- EMBA, uji lanjut pada hasil yang positif dilakukan uji kesempurnaannya menggunakan empat macam pengujian yaitu: uji Indol, Methy Red, Voges Proskauer dan Sitrat. Hasil uji biokimia dapat dilihat pada Tabel 3 uji Biokimia pada bakteri Escherichia coli yang terduga.
28 3.5.7 Uji Indol
Uji ini bertujuan untuk mendeteksi kemampuan mikroba mendegradasi asam amino triptofa. Escherichia coli menghasilkan enzim triptofanase yang mengkatalisasi gugus indol dari triptofan. Untuk melihat adanya indol digunakan reagen kovaks yang memberikan reaksi warna merah reaksi positif sedangkan reaksi negatif terbentuk warna kuning.SNI 2332. 1:2015.
Adapun prosedur kerja dalam pemgujian indol yaitu:
1. Ambil bakteri biakan pada Plate Count Agar(PCA) dengan menggunakan jarum ose yang steril.
2. Diinokulasikan pada tryptone broth, inkubasi pada suhu 350c selama 24 jam.
3. Setelah 24 jam biakan tersebut ditambahkan kovaks indol sebanyak 0,2- 0,3ml, dimana larutan kovaks ini digunakan untuk melihat kehadiran indol yang ditandai terbentuk cicin merah pada lapisan atas media.
Gambar 15. Ecsherichia coli positif dan negatif pada media TB 3.5.8 Uji Voges Proskauer (VP)
Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri menfermentasikan glukosa dalam menghasil asetilkarbinol.
29 Adapun prosedur kerja Voges Proskuer (VP) sebagai berikut:
1. Ambil biakan dari plate count agar (PCA) dengan menggunakan jarum ose yang steril inokulasikan ke media methyl red-voges proskauer (MR-VP).
2. Inkubasi pada suhu 350c selama 24 jam, setelah di lakukan penyimpanan biakan dari MR-VP yang tumbuh dipindahkan kedalam tabung reaksi yang steril sebanyak 1ml dan tambahkan 0,6ml larutan alpha neptol dan 0,2ml KOH 40%.
3. Setelah menambahan di dikocok dan dibiarka selama 2 jam.
4. Apabila terjadi perubahan warna setelah didiamkan berwarna merah mudah Eosin sampai merah delima maka reaksi tersebut positif dan jika tidak terjadi perubahan warna berarti negatif. SNI 2332. 1:2015.
Gambar 16. Escherichia coli positif dan negatif pada media VP 3.5.9 Uji Methyl Red (MR)
Uji methyl red bertujuan untuk menentukan adanya fermentasi asam campuran.
30 Adapun prosedur kerja methyl red (MR) sebagai berikut:
1. Ambil tabung reaksi yang berisi biakan 5ml dan untuk mengetahui positif dan negatif harus ditambahkan 5 tetes methyl red kedalam tabung reaksi MR
2. Setelah penambahan kocok selama beberapa menit jika mengalami perubahan warna merah dan negatif jika warna kuning. SNI 2332. 1:2015.
Gambar 17. Ecsherichia coli positif dan negatif pada media MR
3.5.10 Uji Sitrat
Dalam proses uji sitrat ambil biakan dari PCA dengan menggunakan jarun ose yang steril lalu gores di permukaan media Simmons Citrate Agar SCA di inkubasi selama 96 jam. Setelah di lakukan penyimpanan amati perubahan warna pada medium SCA jika perubahan warna biru maka positif. Uji ini bertujuan melihat apakan bakteri dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbon dalam media.
31 Gambar 18. Escherichia coli positf dan negatif pada media SCA
Diagram Alir Pengujian Bakteri Escherichia coli
Sampel
Uji Penegasan Caliform (Presumptive Coliform)
Uji Penegasan Caliform (Colifirmed Coliform)
Uji Pendugaan Escherichia Coli (Presumptive Escherichia Coli)
Uji Penegasan Escherichia Coli (Colifirmed Escherichia Coli)
Uji Morfologi
Uji Biokimia (Limvic)
Uji indol Uji voges
proskauer Uji methyl Uji sitrat
