IDENTIFIKASI GEN CHDZ DAN CHDW BERBASIS BULU PADA BURUNG PARKIT (Melopsittacus undulatus ) UNTUK MENENTUKAN JENIS KELAMIN DENGAN METODE PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Repository - UNAIR REPOSITORY

(1)

SKRIPSI

IDENTIFIKASI GEN CHDZ DAN CHDW BERBASIS

BULU PADA BURUNG PARKIT (

Melopsittacus

undulatus

) UNTUK MENENTUKAN JENIS

KELAMIN DENGAN METODE PCR

(

POLYMERASE CHAIN REACTION)

Oleh

NIM 060911255 YUSTISIANTI FITRIANI

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA

2014

Skripsi _{IDENTIFIKASI GEN CHDZ DAN CHDW}

BERBASIS BULU PADA BURUNG PARKIT (Melopsittacus undulatus )

(2)

IDENTIFIKASI GEN CHDZ DAN CHDW BERBASIS BULU PADA BURUNG PARKIT (Melopsittacus undulatus ) UNTUK

MENENTUKAN JENIS KELAMIN DENGAN METODE PCR (POLYMERASE CHAIN

REACTION)

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan

pada

Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga

oleh

NIM 060911255 YUSTISIANTI FITRIANI

Menyetujui Komisi Pembimbing,

Pembimbing Utama

(Prof. Dr. Fedik A. Rantam, drh.)

Pembimbing Serta

(3)

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa dalam skripsi berjudul :

IDENTIFIKASI GEN CHDZ DAN CHDW BERBASIS BULU PADA BURUNG PARKIT (Melopsittacus undulatus ) UNTUK

MENENTUKAN JENIS KELAMIN DENGAN METODE PCR (POLYMERASE CHAIN

REACTION)

tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan sepanjang pengetahuan saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Surabaya, 13 Februari 2014

NIM. 060911255 Yustisianti Fitriani

(4)

Telah dinilai pada Seminar Hasil Penelitian Tanggal : 3 Februari 2014

KOMISI PENILAI SEMINAR HASIL PENELITIAN

Ketua : Dr. Suwarno, drh., M. Si.

Sekretaris : Dr. Eduardus Bimo Aksono, drh., Mkes. Anggota : Dr. Mustofa Helmi Efendi. DTAPH., drh. Pembimbing Utama : Prof. Dr. Fedik. A. Rantam., drh.

(5)

Telah diuji pada

Tanggal : 13 Februari 2014

KOMISI PENGUJI SKRIPSI

Ketua : Dr. Suwarno, drh., M. Si.

Anggota : Dr. Eduardus Bimo Aksono, drh., Mkes Dr. Mustofa Helmi Efendi. DTAPH., drh. Prof. Dr. Fedik. A. Rantam., drh.

Dr. Abdul Samik, drh., M.Si.

Surabaya, 13 Februari 2014 Fakultas Kedokteran Hewan

Universitas Airlangga Dekan,

NIP. 19531216197806200 Prof. Hj. Romziah Sidik, drh., Ph.D.

(6)

CHDZ AND CHDW GENE IDENTIFICATION BASED ON PARAKEET (Melopsittacus undulatus) FEATHERS TO DETERMINE SEX BY PCR

(POLYMERASE CHAIN REACTION) METHOD

Yustisianti Fitriani

ABSTRACT

Sex Identification in parakeet (Melopsittacus undulatus) is very important to help conservation and breeding efforts in order to preserve and increased the population of parakeets. Especially in monomorphic bird, that was difficult to distinguish between male and female. Molecular-based technology approach with PCR (Polymerase Chain Reaction) method can be applied to amplify intron length that can be distinguish between CHD-W and CHD-Z and allowed to distinguish gender by using P2 and P8 primers, this method can be used to determine the sex of the parakeet appropriately and accurately using feather samples. This research was conducted in two ages five months parakeets, using three to four feathers that have been extracted and amplified by PCR (Polymerase Chain Reaction), and read using 1% agarose gel electrophoresis, the male appeared one band, and female appeared two bands. gender verification has been done by performing surgery on each bird to saw the morphology of the reproductive organs, the result of reproductive organ morphology and electrophoresis showed that the parakeet was a male with one band, which appeared on the result of electrophoresis, ranged from 300-400 base pairs.

(7)

UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillah, Puji syukur kehadirat Allah SWT atas nikmat, rahmat, dan karunia yang telah dilimpahkan sehingga penulis dapat melaksanakan penelitian dan menyelesaikan skripsi dengan judul Identifikasi Gen CHDZ Dan CHDW Berbasis Bulu Pada Burung Parkit (Melopsittacus undulatus ) Untuk

Menentukan Jenis Kelamin Dengan Metode PCR (Polymerase Chain

Reactian).

Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih kepada :

Prof. Hj. Romziah Sidik, drh., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya.

Prof. Dr. Fedik. A. Rantam., drh. dan Dr. Abdul Samik, drh., M.Si. selaku dosen pembimbing utama dan dosen pembimbing serta atas saran dan bimbingan yang diberikan dalam penyusunan skripsi ini.

Dr. Suwarno, drh., M. Si. selaku ketua penguji, Dr. Eduardus Bimo Aksono, drh., Mkes. selaku sekretaris penguji dan Dr. Mustofa Helmi Efendi, DTAPH., drh. selaku anggota penguji atas dukungan serta saran-saran yang telah diberikan.

Prof. Hj. Romziah Sidik, drh., Ph.D. selaku dosen wali atas bimbingan dan nasihat yang diberikan selama menempuh pendidikan di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya.

(8)

Seluruh dosen dan staf karyawan Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya atas wawasan keilmuan selama mengikuti pendidikan di Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Surabaya.

Seluruh staf Institute Tropical Disease terutama mbak dinar, mbak rury, dan mbak aldis terima kasih atas bantuannya dalam pelaksanaan penelitian.

Kedua orang tua yaitu ayahanda tercinta Sarmadan Achmad Losoh dan ibunda tercinta Yeni Anisah yang telah memberikan nasihat, motivasi, doa dan dukungan baik secara materil maupun spiritual dalam penyusunan skripsi ini.

Kepada kakak tersayang Evaluasi Rohmawati. Kepada keluarga tercinta Marsiam, Siti Zaenab, Sadadul, Matenur, Matlikan, Ahmad fatah berserta adik-adik tersayang Nala Anfa’ul Albab, Mahfiyatul Fitriah, Muhammad Ikhwanul Irham, dan Abdul Munif Al-Mubarok yang selalu memberikan semangat, dorongan, pengorbanan dan doa selama menempuh pendidikan.

Nasihul Umam mas tersayang dan tercinta yang selalu setia mendampingi, untuk segala perhatian, hiburan, bantuan, dorongan semangat, nasehat, kesabaran dan doa selama menempuh pendidikan.

(9)

Kedokteran Hewan angkatan 2009 atas doa, semangat dan dukungan yang telah diberikan.

Kepada semua pihak yang tidak bisa disebutkan satu persatu tetapi sudah membantu dalam penyusunan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa tulisan ini masih jauh dari sempurna, untuk itu penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun dari semua pihak. Semoga hasil yang dituangkan dalam skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak yang membutuhkan.

Surabaya, Februari 2014

Penulis

(10)

DAFTAR ISI

2.1 Burung Parkit (Melopsittacus undulatus) ... 6

2.1.1 Taksonomi ... 6

2.1.2 Karakteristik Anatomi dan Fisiologi ... 6

(11)

3.4 Alat Penelitian ... 19

3.5 Prosedur Penelitian ... 20

3.5.1 Pembedahan ... 20

3.5.2 Ekstraksi DNA ... 20

3.5.3 Polymerase Chain Reaction ... 21

3.5.4 Elektroforesis ... 22

3.5.5 Diagram Alir Prosedur Penelitian ... 23

BAB 4 HASIL PENELITIAN ... 24

BAB 5 PEMBAHASAN ... 28

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN... 33

6.1 Kesimpulan ... 33

6.2 Saran ... 33

RINGKASAN ... 34

DAFTAR PUSTAKA ... 36

LAMPIRAN ... 41

(12)

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

(13)

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman 2.1 Burung Parkit (Melopsittacus undulatus) ... 7 2.2 Struktur Bulu ... 8 2.3 Tahap-tahap Pelipatgandaan DNA ... 13 2.4 Reaksi gen CHD-Z dan CHD-W dengan pembacaan

menggunakan elektroforesis gel agarose 1% ... 14 2.5 Hasil Sekuensing gen CHDW dan CHDZ pada

burung puyuh ... 17

3.1 Bulu burung parkit ... 19 3.1 Diagram Alir Prosedur Penelitian ... 23 4.1 Reaksi gen CHD-Z dan CHD-W dengan pembacaan

menggunakan elektroforesis gel agarose 1% ... 25 4.3 Testis burung parkit setelah dilakukan pembedahan ... 26 4.4 Perbedaan warna care untuk menentukan jenis kelamin pada

Burung parkit ... 27

(14)

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

(15)

DAFTAR SINGKATAN DAN ARTI LAMBANG

dNTPs = Deoxynucleotide triphosphates dATP = deoksiadenosin trifosfat

dCTP = deoksisitidin trifosfat dGTP = deoksiguanosin trifosfat dTTP = deoksitimidin trifosfat

MgCL2 = Magnesium Clorida

μM = Mikromolar

AL = Aqueous Lysis buffer (untuk melisiskan sel)

AW = Aqueous Washing buffer (untuk memurnikan DNA yang terkumpul)

AE = Aqueous Elution buffer (untuk melarutkan kembali DNA yang sudah terkumpul dalam filter)

(16)

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang masalah

Burung parkit biasanya dijumpai dapat dijumpai di pasar-pasar burung sekarang ini. Sesungguhnya burung parkit merupakan hasil penjinakan jenis parkit liar di Australia. Proses penjinakan sudah lama terjadi. Ketika Kapten Cook mendarat pertama kali di benua Australia, jenis burung ini mulai digambarkan secara ilmiah (Widodo, 2002). Pada tahun 1794, Shaw, penulis Zoologi of New Holland, member nama parkit dengan sebutan Melopsittacus undulatus.

Melopsittacus berasal dari kata melos (Yunani) yang berarti nyanyian dan psittacus yang merupakan sebutan dari kerabat betet, sedangkan undulates (Latin)

berarti bercorak gelombang. Corak gelombang ini mungkin berkaitan dengan warna bulu parkit yang bermacam-macam (Widodo, 2002).

(17)

Secara umum, determinasi jenis kelamin pada Aves cukup sulit sebelum dewasa. Namun, pada jenis-jenis monomorfik hal ini sulit dilakukan meskipun telah melewati masa pubertas. Beberapa jenis Aves seperti ayam, kalkun, itik, angsa, burung hantu dan burung paruh bengkok sulit untuk diidentifikasi jenis kelaminnya secara morfologis (Griffiths dan Tiwari, 1995; Griffiths et al., 1998).

Burung mempunyai banyak spesies yang sulit dibedakan berdasarkan karakteristik eksternal. Membedakan antara kedua jenis kelamin dalam berbagai kelompok taksonomi tidak semudah seperti pada manusia. Beberapa cara yang dapat digunakan untuk membedakan jenis kelamin pada burung monomorfik ini diantaranya adalah pengamatan laparoskopi atau melalui pembedahan (laparoskopi), dan analisis DNA dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) (Griffiths, 2000).

Polymerase Chain Reaction (PCR) pertama kali ditemukan oleh Kary

Mullis pada tahun 1986. Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah satu teknik yang dipakai untuk melipatgandakan asam nukleat (DNA atau RNA) secara in vitro dengan enzimatis di dalam suatu mesin pengubah yang dikenal dengan

Thermocycle. Proses pelipatgandaan ini terjadi melalui tiga tahapan yaitu denaturai, annealing dan ekstensi (Rantam, 2007). Teknik PCR memerlukan suatu DNA cetakan (templat DNA) yang nantinya akan diperbanyak secara in vitro. DNA cetakan didapatkan dari hasil ekstraksi dan purifikasi suatu sel, jaringan atau organ. Sebagian besar DNA pada sel hewan terdapat di dalam inti. Sebagian yang lain terdapat di organel seperti di mitokondria. Ekstraksi dan purifikasi DNA pada prinsipnya adalah suatu cara atau metoda untuk memisahkan DNA total dari

(18)

komponen sel lainnya (Sulandari dan Zein 2003). Setiap sel atau jaringan yang memiliki DNA memungkinkan untuk dilakukan ekstraksi DNA, akan tetapi, kualitas dan jumlah DNA yang diperoleh dapat bervariasi tergantung asal jaringan, metode penyimpanan, dan cara ekstraksi. Ekstraksi DNA dari fosil, specimen museum, sampel forensik, rambut atau bulu (calamus) dan feses biasanya lebih sulit dilakukan (Taberlet et al. 1996).

Penanda yang digunakan selama ini adalah kromosom seks berupa kromosom W pada burung betina (ZW) yang tidak dimiliki oleh pejantan (ZZ). Gen penanda pertama yang ditemukan adalah CHD (chromo-helicase-DNAbinding) yang terletak di kromosom W pada aves (Griffiths dkk., 1998).

Hasil amplifikasi PCR dengan metode molecular sexing berdasarkan gen penanda CHD akan menunjukkan jenis kelamin sampel berdasarkan jumlah pita yang terbentuk. Hal ini karena gen CHD-W dan CHD-Z pada betina akan teramplifikasi menjadi dua sekuen, sedangkan dua gen CHD-Z pada jantan akan menghasilkan satu sekuen saja (Quintana dkk., 2008).

(19)

Elektroforesis merupakan suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isolektrik). Pergerakan molekul didalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia molekul (Pratiwi, 2001). Elektroforesis menggunakan gel agarose dapat menghasilkan satu band pada burung dengan jenis kelamin jantan dan pada betina menghasilkan dua band (Griffiths et al., 1998; Fridolffson and Ellegren, 1999).

Seluruh teknik molekuler untuk identifikasi jenis kelamin pada burung dibutuhkan sampel DNA. DNA sekarang dapat diperoleh dari bulu (calamus) (Smith et al. 1991; Ellegren 1992). Identifikasi jenis kelamin melalui bulu (calamus) dapat digunakan sebagai sexing jaringan. DNA ekstraksi dengan mengguanakan bulu (calamus) dapat mengurangi stres pada burung dan menghindari kehilangan darah yang berlebihan (Cerit dan Avanus 2006). Penggunaan sampel bulu (calamus) sebagai identifikasi jenis kelamin pada burung telah berhasil dibuktikan dalam studi molekuler seks rasio (Questiau et al. 2000).

Seks dapat diidentifikasi dengan : (1) pengamatan perilaku,(2) kehadiran mengerami patch, (3) perbedaan sifat morfometrik (4) pemeriksaan dari gonad dengan laparotomi atau laparoskopi, dan (5) pemeriksaan kromosom seks. Dua metode pertama dapat secara umum diterapkan hanya selama musim berkembang biak, dan analisis sifat morfometrik mungkin ambigu. Pemeriksaann dari gonad mungkin sulit dilakukan di burung dewasa di luar musim kawin karena ukuran tubuh kecil mereka (Prus dan Schmutz 1987).

(20)

1.2. Perumusan masalah

Berdasarkan latar belakang diatas,maka perumusan masalah adalah:

Apakah bulu (calamus) yang diuji dengan PCR dapat digunakan untuk mengidentifikasi gen CHDZ dan CHDW dalam menentukan jenis kelamin pada burung parkit ?

1.3. Tujuan penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa sampel bulu (calamus) dari burung parkit dapat digunakan untuk mengidentifikasi gen CHDZ dan CHDW dalam menentukan jenis kelamin dengan teknik PCR.

1.4. Manfaat penelitian

(21)

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Burung Parkit

Anggota burung berparuh bengkok terbagi atas 6 suku, 82 marga dan 316

jenis. Diantara kelompok burung-burung berparuh bengkok, parkit termasuk yang

sangat popul er ka rena bulunya yang b erwarna-warni da n s ifatnya yang m uda

beradaptasi dengan alam lingkungan sekitarnya (Widodo. 2002).

2.1.1 Taksonomi

Susunan kl asifikasi bur ung pa rkit be rdasarkan Checlist of Bird of the

World yang dikutip oleh Widodo (2002) adalah sebagai berikut.

Filum : Chordata

Spesies : Melopsittacus undulatus

2.1.2 Karakteristik Anatomi dan Fisologi

Menurut F orshaw ( 1986), pa njang bur ung p arkit r ata-rata ad alah 18 cm

dengan be rat ba dan antara 26-29 gram. Lebih l anjut di nyatakan , da ri 8 burung

parkit j antan di ketahui panjang s ayapnya a ntara 93 -100 m m, e kor 91 -103 m m,

(22)

clumen (paruh bagian atas) 9-10 mm, dan tarsus 13-15 mm. Untuk yang betina,

dari 9 parkit betina diketahui memiliki panjang sayap antara 93-104 mm, ekor

88-99 m m, c lumen 9 -11 m m, da n t arsus 14 -15 m m ( Widodo, 2002) . Pada bur ung

parkit denyut jantung adalah 7 ka li lebih cepat dari pada manusia. Burung parkit

memiliki dua jari kaki menghadap ke depan dan dua jari menghadap ke belakang.

Berbeda dengan unggas lain memiliki tiga jari kaki menghadap ke depan dan satu

jari menghadap ke belakang seperti pada gambar 2.1 (Lafeber Company, 2011).

Gambar 2.1 Burung Parkit (Melopsittacus undulatus)

2.1.3 Karakreistik Bulu

Bulu (calamus) burung mempunyai prospek menjadi sumber DNA karena

pada pa ngkal bulu (calamus) ba nyak m engandung sel e pitel. Bulu (calamus)

merupakan s truktur khu sus K elas A ves. Secara g enetik bulu (calamus) diduga

berasal dari epidermal, sedangkan secara embriologis bermula dari papila dermal.

Bulu terdiri da ri poros ut ama y ang disebut Shaft (tangkai), Calamus (tangkai

(23)

bulu yang t idak be rongga didalamnya me miliki s umsum da n jaringan), Vane

(bendera yang t ersusun atas barbae yang merupakan cabang-cabang l ateral da ri

rachis) (Hickman et al., 1984), seperti yang terlihat pada Gambar 2.2.

Gambar 2.2 Struktur bulu

(Sumber : http://www lifestyle.kompasiana.com)

2.1.4 Habitat

Biasanya bur ung p arkit m enempati ha bitat hutan E ucalypus yang

berbatasan de ngan anak s ungai,padang rerumputan,semak b elukar yang ke ring,

dan daerah padang terbuka. Umumnya mereka berkelompok dalam jumlah kecil,

dimanapun bur ung t ersebut t inggal. Meraka hi dup be rpindah-pindah,

menyesuaikan persediaan air da n biji r erumputan sebagai s umber m akananya

(Widodo, 2002).

(24)

2.1.5 Kromosom Seks Pada Burung

Kromosom seks Z dan W pada b urung berkembang s ecara b erbeda

dibandingkan kromosom mamalia X dan Y (Ellegren et al, 2001). Burung betina

bersifat heterogamet dan membawa s alinan Z dan W tapi pada j antan bersifat

homogamet dan membawa 2 eksemplar jenis kelamin kromosom Z (Handley et

al, 2005) . Identifikasi seks pa da burung yang pa ling pe nting adalah bagaimana

peranan 2 jenis kromosom seks tersebut. Hingga saat ini masih belum cukup jelas,

namun jika karakteristik betina dikembangkan oleh W sebagai kromosom betina

maka karakteristik jantan ditentukan oleh kromosom Z. Meskipun khusus betina,

kromosom W memiliki struktur yang mirip dengan kromosom mamalia Y pada

jantan, kecuali ukurannya y ang lebih ke cil, da n jumlah heterochromatin yang

lebih s edikit. (Cerit da n A vanus, 2007). Gen CHD-W pa da b etina s angat uni k,

dimana kr omosom s eks pa da be tina be rsifat heterogametic ( Ellegren, 1996 ;

Griffiths et al., 1996), sedangkan gen CHD-Z dapat ditemukan pada kedua jenis

kelamin (Griffiths and Korn, 1997; Fridolfsson and Ellegren, 1999).

2.2 Teknik Sexing

Teknik s exing yang di lakukan unt uk m engidentifikasi j enis ke lamin p ada

burung m onomorfik s ecara non m olekuler (konvensional) yaitu: laparoskopi,

(25)

2.2.1 Laparoskopi

Laparoskopi d apat m elihat ka rakteristik s aluran r eproduksi da n ha silnya

dapat di lihat l angsung. Gonad bur ung d ewasa adalah m udah di visualisasikan

dibandingkan de ngan a nakan. S eorang ahli da pat da pat m engidentifikasi je nis

kelamin anakan juga. Melihat organ seks menggunakan laparoskop atau otoskope,

diperlukan sayatan kecil disisi kiri tubuh burung. Pada anakan betina, indung telur

sering t idak di temukan. K elemahan ut ama da ri l aparoskopi a dalah di butuhkan

anastesi dan resiko cedera pada organ vital. Pra pemeriksaan bisa berbahaya dan

bahkan dapat membuat burung mati (Swengel, 1996).

2.2.2 Karyotyping

Sumber unt uk i solasi kr omosom da n pe nentuan karyotipe da pat di peroleh

dari kul tur s el yang um um, yang be rasal da ri bul u atau darah karena s ebagian

besar kromosom spesies burung adalah mikrokromosom, sulit untuk menghitung

mikrokromosom i ni secara a kurat. K arena be rukuran b esar kr omosom Z da pat

dibedakan d ari kr omosom W yang l ebih k ecil ( Archawaranon, 2004) . S eorang

cytogenetics berpengalaman dapat memperoleh hasil yang akurat. Kerugian utama

dari analisis kromosom adalah prosedur yang memakan waktu (christidis, 1985).

Metode i ni t idak da pat diterapkan unt uk bur ung unt a, ka rena r endah pe rbedaan

dari kromosom Z dan W (Malago et al, 2002).

(26)

2.2.3 Vent Sexing

Vent sexing merupakan metode yang di populerkan pa da t ahun 1930 -an

oleh professor j epang, K iyoshi Masui. Vent sexers yang t elah di latih di sekolah

Chick Sexing, dapat dengan mudah mendapatkan keakuratan sebesar 95% dalam

sexing. Metode i ni be rdasarkan dengan memegang D OC atau unggas yang l ain

posisi di balik ke bawah de ngan s atu t angan da n m emeriksa a rea vent (kloaka)

untuk m elihat a danya a tau t idak a danya r udimenter da ri or gan j antan.

Bagaimanapun seseorang yang bukan ahlinya mempelajari dasar dari metode ini

dapat m enghasilkan k eakuratan t idak l ebih d ari 60 -70%, m eskipun s eseorang

yang ahli juga dapat salah dalam mengidentifikasi (Bramwell, 2003)

2.2.4 Steroid Sexing

Metode i ni be rdasarkan pa da l evel es trogen/testosterone di da lam f eses

burung. Feses burung betina memiliki rasio yang lebih tinggi dibandingkan yang

jantan. Pada teknik ini feses yang masih segar sangat diperlukan sebagai sampel

tes ini . Hasil te rbaik d apat t ercapai ha nya da ri burung de wasa s elama musim

kawin (Swengel, 1996).

2.3 Teknik Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction merupakan t eknik yang d apat di terapkan

kegunaannya di segala bi dang bi ologi, yang m emungkinkan da lam pe njelasan

rangkaian DNA spesifik dari target DNA yang tidak dapat terdeteksi (Erlich 1989,

(27)

dan pada s etiap s iklus t erjadi duplikasi j umlah target D NA unt ai ganda. U ntai

ganda template DNA dipisahkan de ngan de naturasi t ermal da n ke mudian

didinginkan hi ngga m encapai s uatu s uhu t ertentu unt uk m emberi w aktu pa da

primer m enempel p ada (anneal primers) pa da d aerah t ertentu dari t arget DN A.

Polymerase D NA di gunakan unt uk m emperpanjang pr imer ( extend orimers)

dengan adanya dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dan dTTP) dan buffer yang sesuai.

Umumnya ke adaan i ni de lakukan ant ara 20 -40 s iklus. T arget D NA yang

diinginkan (short ”targe” product) aka n meningkat s ecara eks ponensial s etelah

siklus keempat dan DNA non-target (long product) akan meningkat secara linier

(Newton dan Graham, 1994).

Metode i ni m enggunakan pa sangan p rimer be rdasarkan va riasi ukur an

intron unt uk m embedakan a ntara pr otein chromo-helicase DNA-binding (CHD),

CHD-Z dan CHD-W (Han dkk., 2009).

2.3.1 Prinsip Kerja PCR

Tahap de naturasi di lakukan pa da s uhu sekitar 9 2ºC untuk menguraikan

rantai ganda m enjadi rantai t unggal. Kemudian di lanjutkan de ngan t ahap

annealing dengan suhu sekitar 37º - 65º C. Pada proses ini primer menempel pada

daerah spesifik DNA template. Proses ekstensi dilakukan pada suhu 72ºC yang

dimaksudkan unt uk pe nambahan e nzim Tag DNA polymerase sehingga pr imer

akan di sambung d engan nukl eotid dN TP da n t erbentuk r antai nukl eotida yang

lebih panjang seperti pada gambar 2.2 (Suwarno, 2007).

(28)

Gambar 2.3 Tahap-Tahap Pelipatgandaan DNA (Sumber: Erlich, 1991).

Penelitian sebelumnya telah dilakukan pada dua ekor burung kenari dan dua

ekor bur ung gelatik J awa unt uk m engidentifikasi j enis ke lamin m enggunakan

sampel bulu dengan metode PCR dengan menggunakan primer P8 dan P2 yang

selanjutnya dielektroforesis dengan gel agarosa 1%. Hasil dari elektroforesis pada

dua ekor burung kenari dan burung gelatik Jawa menunjukkan dua fragmen DNA

yang b erarti be rjenis ke lamin betina s eperti pa da Gambar 2.4 (Ariani., 2013;

(29)

Gambar 2.4 Reaksi ge n CHD-W da n CHD-Z de ngan pembacaan

menggunakan elektroforesis gel agarose 1%. Keterangan: M= Marker; C (-) = K ontrol ne gatif; K 1 = K enari satu: K 2 = Kenari dua ; G 1= G elatik Satu, G2= G elatik Dua (Ariani., 2013; Minardi., 2013).

2.3.2 Manfaat dan Keunggulan Teknik PCR

Polymerase Chain Reaction memiliki ke unggulan yang cukup ba nyak

karena k esederhanaan teknis da n waktu yang di tawarkan serta d apat di terapkan

kegunaanya di segala bi dang bi ologi, yang m emungkinkan da lam pe njelasan

rangkaian DNA spesifik dari target DNA yang tidak dapat terdeteksi (Erlich 1989,

Innis e t a l, 1990) . Dengan m enggunakan m etode P CR ini lebih f leksibel da n

dapat be kerja h anya d engan m enggunakan s atu bul u be rkualitas, di bandingkan

(30)

menggunakan t eknik m olekuler hi bridisasi be rlabel unt uk m emeriksa DNA

genom dengan memeriksa kromosom W spesifik atau mengidentifikasi keturunan

multigen dengan kelompok spesifik kromosom W (Griffiths and Holland, 1990;

Quinn et al., 1990; D vorak et al., 1992; Griffiths, 1992; M illar et al., 1992;

Graves et al., 1993; Longmire et al., 1993). Metode molekuler ini sangat lambat

dan melelahkan karena m emerlukan jumah DNA yang r elatif be sar s erta

kebanyakan melibatkan penggunaan radioisotope.

2.4 Sekuensing Nukleotida CHDZ Dan CHDW

Sekuensing nukleotida m erupakan t eknik yang di gunakan unt uk

menentukan ur utan nu kleotida s ecara l angsung da ri s uatu f regmen D NA

(handajani, 2003) . S ekuensi D NA a kan m enghasilkan s ekuens D NA yang

digambarkan s ebagai ur utan a bjad l ambing nu kleotida pe nyusun D NA yaitu

AGTC (Riyadi, 2010).

Sekuensing pada penelitian yang pernah dilakukan dari burung bangau putih

(Ciconia boyciana) untuk membedakan jenis kelamin yang mengidentifikasi gen

CHDZ dan CHDW de ngan m enggunakan pr imer P 8 dan P 2. Hasil s ekuensing

pada bur ung ba ngau put ih m enunjukan ba hwa ge n C HD-W be rukuran 3 83 bp

yang ada pada burung betina, sedangkan gen CHD-Z pada burung bangau putih

berukuran 376 bp yang ada pada burung jantan seperti dibawah ini (Han el al,

(31)

Cb -W CTCCCAAGGA TGAGAAACTG TGCAAAACAG GTATCTCTGG GTTTTGACCA ACTAACTTCA 60 Cb -Z CTCCCAAGGA TGAGAAACTG TGCAAAACAG GTGTCTCTTT GCTTTGACTG ACT---TGTA 57

Cb -W ATTTTGTTGT TCTTGTTGTT TGTTTGTTTT TTCGTTGCTG TTGTTTTGGC TTGTACTTTT 120 Cb -Z CTTTTATG-- --TTGCTGTT GGTTTACTTT GTTGGGGGGG TTTTTTGGGT TTTGGGTTCG 113

Cb -W GGGTTGTGTG GTTTTCGCGC GTGGCGCCCC CCCCATTTTT GACAGGCTAG ATAACACATT 180 Cb -Z TGGTTTTTTT TTTTCCTTCC TTTTCTGAAC CCATGTTTTT GACAGGCTAG GTAAAACTTC 173

Cb -W AATAAAATGT TTTAGTCACA TAGCTTTGAA CTACTTAATC TGAAATTCCA GATCAGCTTT 240 Cb -Z CCTTATGTTT GTTAATCATG TAGCTTTGAA CTACTTACTC TGAAATTCCA AATCAGCTTT 233

Cb -W AATGGAAGGG AAGGGAAACG CAGTAGGAGC AGAAGATATT CTGGATCTGA TAGTGACTCC 300 Cb -Z AATGGAAGTG AAGGGAGGGG CAGTAGGAGC AAAAAATACT CTGGATCTGA TAGTGACTCC 293

Cb -W ATCTCAGAAA GAAAACGACC AAAAAAACGT GGACGACCAC GAACTATTCC TCGAGAAAAT 360 Cb -Z ATCTCAAAAA GAAAACGGCC AAAAAAACGT GGAAAACCAC AAACGATTCC TCGAGAAAAT 353

Cb -W ATTAAAGGAT TTAGCGATGC AGA 383 Cb -Z ATTAAAGGAT TTAGCGATGC AAA 376

Keterangan: H asil s ekuensing da ri gen C HD-Z dan C HD-W pada bur ung bangau putih Cb: (Ciconia boyciana) (Han el al, 2009).

Penelitian i dentifikasi j enis ke lamin de ngan m etode P CR de ngan

menggunakan primer P2 dan P8 pada Burung puyuh umum (Coturnix c. coturnix)

dan puyuh Jepang (Coturnix c. japonica). Burung puyuh umum dan burung puyuh

Jepang menunjukkan bahwa gen CHD-W berukuran 379 bp pada burung betina,

Sedangkan gen C HD-Z pada bur ung pu yuh um um berukuran 385 bp yang a da

pada burung jantan seperti gambar dibawah ini (Morinha et al., 2011).

(32)

Gambar 2.5 Hasil Sekuensing gen CHDW dan CHDZ pada burung puyuh

umum (Coturnix c. coturnix) dan burung puyuh J epang

(33)

BAB 3

MATERI DAN METODE PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Penelitian i ni m erupakan j enis pe nelitian eksploratif l aboratorik unt uk

mengidentifikasi jenis kelamin dengan teknik Polymerase Chain reaction berbasis

Gen CHDz dan CHDw dengan menggunakan sampel bulu (calamus )dari burung

parkit.

3.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian PCR dilakukan di L embaga P enyakit T ropis U niversitas

Airlangga, da n di laksanakan pa da bul an M aret-April 2013 . Penelitian

pembedahaan morfologi dilakukan di Departemen Anatomi Veteriner Universitas

Airlangga dan dilaksanakan pada bulan Maret 2013.

3.3 Bahan Penelitian

3.3.1 Sampel Penelitian

Penelitian ini menggunakan 25 m g (3-4 calamuses) bagian apeks dari bulu

burung parkit berumur 5 bul an yang di beli da ri t oko bur ung di D esa

Sambogunung Kecamatan Dukun Kabupaten Gresik.

(34)

Gambar 3.1 Bulu burung parkit yang digunakan sebagai sampel dalam penelitian

(Dokumen pribadi).

3.3.2 Bahan yang digunakan dalam penelitian

Bahan unt uk i solasi D NA a dalah D Neasy® Tissue K it C at no. 69 504

Qiagen Germany meliputi: 180 μl lysis buffer ATL, 200 μl buf fer AL dan 20 μl

10 mg/ml proteinase K, 200 μl ethanol, 500 μl buffer AW1, 500 μl buffer AW2,

200 μl buffer AE; gel agarose 1%, ethidium bromide, TBE, loading dye,12,5 μl

super master mix (Taq polymerase, DNTPs, PCR reaction buffer, Gel loading

buffer), dan 3 μl DW (Destile Water), 100 bp DNA lot no. 00066905, primer P2

dan P8, ketamin 0,2 ml.

3.4 Alat Penelitian

Alat pe nelitian yang di perlukan meliputi : tip s 1000 μl, t ips 100 μl,

microcentrifuge tube 10 μl dan 100 μl, m ikropipet eppendorf 10 μl, 100 μl da n

1000 μl, M esin P CR, Electrophoresis apparatus, Gel- documentation, s tavolt,

(35)

colection tube, scalpel, g unting be dah, pi nset, microcentrifuge, spin down,

Transiluminator UV, dry bath.

3.5 Prosedur Penelitian

3.5.1 Pembedahan

Pembedahan dilakukan untuk m elihat m orfologi alat reproduksi seks pa da

burung parkit sebagai data pendukung metode yang dikembangkan. pembedahan

dilakukan de ngan m embius t erlebih da hulu bur ung parkit dengan m enggunakan

ketamin 0,2 ml s ecara intramuscular untuk m empermudah pr oses pe mbedahan,

setelah burung t ersebut sudah lemas m aka s egera d ilakukan pembedahan.

Bulu-bulu yang a da di s ekitar a bdomen bur ung di bersihkan a gar t idak m engotori

bagian-bagian o rgan yang a kan di amati. B agian a bdomen bur ung di lakukan

sayatan be rbentuk “ Y” terbalik de ngan m enggunakan s calpel. R ongga thorak

dibuka dengan menggunakan gunting, lalu dicari organ seks pada burung tersebut

yang l etaknya di ba gian c ranial ginjal da n t erletak di antara r ongga t horak da n

rongga abdomen pada garis punggung.

3.5.2 Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA dilakukan dengan memotong kecil-kecil bagian apeks bulu

(calamus) burung parkit sebanyak 25 m g dimasukkan ke dalam microcentrifuge

tube kemudian ditambahkan 180 µl lysis buffer ATL (Aqueous Tissue Lysis), dan

20 µl pr oteinase K di campur de ngan m enggunakan vor tex s upaya t idak a da

jaringan yang menempel pada dinding tube dan inkubasi pada suhu 55 ºC sampai

(36)

jaringan t ersebut l isis s epenuhnya. S etelah j aringan l isis s epenuhnya divortex

selama 15 detik dan ditambahkan 200 µl buffer AL ke dalam sampel dan divortex

kembali. Penambahan 200 µl ethanol (96-100%) kemudian dicampur sepenuhnya

dengan m enggunakan vortex da n e ndapan putih a kan t erbentuk s etelah

penambahan bu ffer A L da n e thanol. C ampuran l arutan t adi di pipet k e da lam

collection tube untuk difilter kemudian disentrifuse dengan kecepatan 8000 rpm

selama 1 m enit. Langkah selanjutnya larutan tersebut dipindahkan menggunakan

pipet ke da lam collection tube yang ba ru da n 5 00 µ l buf fer A W1 di berikan ke

dalamnya dan disetrifuse selama 1 menit dengan kecepatan 8000 r pm kemudian

larutan yang t ertampung pa da collection tube dibuang da n b ahan D NA yang

tertahan pada alat filter dipindahkan ke collection tube yang baru lagi selanjutnya

500 µl buffer AW2 ditambahkan dan disentrifuse dengan kecepatan 14.000 rpm

selama 3 menit, langkah ini dilakukan untuk meyakinkan tidak ada residu ethanol

yang t erbawa s elama pr oses pe murnian kemudian bahan D NA t ersebut

dipindahkan kembali ke microcentrifuge tube dan ditambahkan 200 µl buffer AE

kemudian diinkubasi pa da t emperatur 70 ºC s elama 10 m enit da n di sentrifuse

selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm (Lane et al., 2004).

3.5.3 Polymerase Chain Reaction

Reaksi PCR pada penelitian ini menggunakan rancangan primer yang telah

dibuat yaitu : P8 (5’-CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3’) dan P2 (5’-TCTGCAT

CGCTAAATCCTTT-3’). Proses amplifikasi di gunakan : 20 μl tot al vol ume

(37)

buffer, Gel loading buffer) , 1 μl ma sing-masing pr imer, 3 μl DW (Destile

Water), dan 2,5 μl sampel DNA. Kondisi amplifikasi PCR terdiri dari tahap

pre-denaturasi 94 o_{C selama 5 menit, 30 siklus terdiri dari denaturasi 94}o_{C selama 1}

menit 30 de tik, annealing 50o_{C s elama 1 menit, dan}_extension₇₂o_{C selama 45}

detik, dan tahap akhir extension 72 oC selama 5 menit (Sefc et al., 2003; Leeton et

al., 1993; Malago et al., 2002).

3.5.4 Elektroforesis

Hasil P CR di viualisasi de ngan gel a garosa 1% yang t erbuat d ari 40 ml

larutan TBE dan 0,4 g bubuk agarosa serta 4 μl ethidium bromide (Sefc et al.,

2003; Leeton et al., 1993; Malago et al., 2002). Sampel DNA dicampur dengan

loading dye untuk mengetahui seberapa jauh sampel DNA melewati gel agarosa.

Loading dye membuat sampel D NA m enjadi b erat da n tenggelam pa da da sar

sumur g el. Marker yang di gunakan dalam p enelitian ini a dalah 100 bp DNA

ladder lot no. 00066905. B urung dengan kelamin jantan akan menunjukkan satu

band dan pa da be tina akan m enunjukkan dua band (Griffiths et al., 1998;

Fridolffson and Ellegren 1999) . Elektroforesis digunakan de ngan t ujuan unt uk

mengetahui ukuran suatu partikel DNA, RNA, dan protein (Klud and Cummings,

1994).

(38)

3.5.5. Diagram Alir Prosedur Penelitian

Jantan Betina

Gambar 3.2 Diagram Alir Pelaksanaan Penelitian

Konfirmasi

PCR

CHDZ CHDW

2 Band 1 band

Elektroforesis

Sampel bulu Burung parkit

Pembedahan Melihat warna care

Ekstraksi DNA

(39)

BAB IV HASIL PENELITIAN

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan selama bulan maret – april 2013

dari dua burung parkit berumur 5 bulan yang telah di PCR menggunakan sampel bulu

(calamus). H asil pe ngamatan unt uk pe nentuan j enis ke lamin be rdasarkan m etode

PCR yang t elah dibandingkan dengan pengamatan secara em piris da n anatomois

diperoleh hasil seperti tertera pada Tabel 4.1 sebagai berikut :

4.1 Tabel Hasil Pengamatan Jenis Kelamin

Sampel Empiris Anatomis PCR Hasil

J B J B J B

K- (DW) - - - - - - Negatif

P1 + - + - + - Jantan

P2 - + + - + - Jantan

Keterangan : K- (DW) = Kontrol Negatif Destile Water; P 1= Parkit K esatu; P2 =

Parkit Kedua; J = Jantan; B = Betina

Penentuan jenis kelamin pada burung parkit yang telah diakui oleh peternak dan

penjual dengan membedakannya secara empiris terutama melihat warna care masih

diragukan b ahkan t erkadang s alah, k arena s eletah di buktikan de ngan m etode P CR

yang dilakukan dengan menggunakan primer P8 dan P2, serta dilihat hasilnya melalui

proses elektroforesis ternyata lebih tepat dan akurat yang sebelumnya telah didukung

(40)

dengan p engamatan s ecara anatomis s ehingga s udah t idak p erlu di ragukan bahwa

metode PCR dapat untuk menentukan jenis kelamin pada burung parkit. Gambar 4.1

berikut adalah reaksi dari gen CHD-Z dan CHD-W dengan pembacaan menggunakan

elektroforesis gel agarose 1%.

Gambar 4.1. Reaksi gen CHD-Z dan CHD-W dengan pembacaan menggunakan

elektroforesis.Keterangan: M = Marker; C(-) = Kontrol negatif; P1 = Parkit kesatu; P2 = Parkit kedua.

Kontrol negatif pada penelitian ini menggunakan Destile Water dan pada hasil

elektroforesis t idak m enghasilkan ba nd, h al i ni menunjukan s elama pr oses e kstrasi

(41)

Proses PCR ini menggunakan sampel bulu (calamus) burung parkit P1 dan P2

yang di ambil s ebelum d ilakukan pe mbedahan . Sampel bul u (calamus) yang telah

dikumpulkan di lakukan ekstraksi unt uk m emurnikan D NA. B ulu (calamus) bur ung

terdapat sumber DNA karena pada panggal bulu (calamus) menggandung banyak sel

epitel seperti yang terlihat pada Gambar 3.1.

Penentuan secara an atomis yang t elah di lakukan yaitu de ngan pe mbedahan

pada r ongga a bdomen unt uk m elihat g onad bur ung pa rkit. H asil pe mbedahan

menunjukan bahwa P1 dan P2 berjenis kelamin jantan karena ditemukan testis pada

kedua burung. Hasil pembedahan ini tidak sesuai dengan pernyataan yang dikatakan

oleh penjual dan peternak bahwa P1 berjenis kelamin jantan dan P2 berjenis kelamin

betina. G ambar 4.2 berikut ada lah hasil pembedahan unt uk m elihat m orfologi a lat

reproduksi burung parkit.

Gambar 4.2 Testis burung parkit setelah dilakukan pembedahan (Dokumen pribadi).

Keterangan: P1(Parkit kesatu) = be rdasarkan k arakteristik m orfologi luarnya yang d iyakini be rjenis kl amin jantan; P2 (Parkit kedua) = berdasarkan ka rakteristik m orfologi l uarnya yang di yakini be rjenis kelamin betina.

P1 _P2

(42)

Menurut Tabel 4.1 diatas dapat di lihat bahwa penentuan j enis kelamin secara

empiris yang di amati d ari w arna care (tonjolan da ging di sekitar l ubang hi dung)

menunjukan ba hwa P 1 berjenis ke lamin j antan karena care berwarna b iru dan P2

berjenis kelamin betina karena warna care berwarna putih. Hasil pengamatan secara

empiris ini dipercaya oleh peternak burung parkit seperti pada gambar Gambar 4.3.

Gambar 4.3 Perbedaan warna care untuk menentukan jenis kelamin pada burung

parkit. P1 (Parkit satu diyakini berjenis kelamin jantan karena warna care berwarna biru), P2 (Parkit dua diyakini berjenis kelamin betina karena warna care berwarna putih) (Dokumen pribadi).

Hasil da ri P CR de ngan m enggunakan pr imer P8 da n P 2 s erta s ampel bul u

(calamus) burung parkit yang dilihat dari data elektroforesis dengan gelagarose 1%

telah di ketahui ba hwa ke dua bur ung t ersebut be rjenis ke lamin j antan ka rena

keduanya ditandai dengan satu band yang berada pada ukuran antara 300 bp sampai

400 bp dengan menggunakan marker 100 bp DNA ladder lot no. 00066905 (Gambar

4.1).

P2

(43)

BAB 5 PEMBAHASAN

Penentuan jenis kelamin pada aves dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu secara non molekuler dan secara molekuler. Penentuan jenis kelamin secara non molekuler diantaranya yaitu autosexing, vent sexing, karyotyping, steroid sexing pada feses dan laparoskopi. Penentuan jenis kelamin secara molekuler umumnya menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan penanda genetik khusus jenis kelamin (Cerit dan Avanus, 2007).

Burung parkit yang digunakan sebagai penelitian yang sebelumnya telah diyakini oleh penjual dan peternak burung secara empiris berjenis kelamin jantan dan betina yang diambil bulunya pada masing-masing burung untuk dijadikan sampel dalam proses polymerase chain reaction.

Poymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu reaksi in vitro untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer. Primer yang berada sebelum daerah target disebut sebagai primer forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Enzim yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA baru dikenal sebagai enzim polymerase. Mencetak rangkaian tersebut dalam teknik PCR, diperlukan juga

dNTPs (deoxynucleoside triphosphat) yang mencakup dATP (nukleotida berbasa

(44)

Adenine), dCTP (Cytosine), dGTP (Guanine) dan dTTP (Tymine) (Muladno, 2002).

Sebelum melakukan proses PCR terlebih dahulu dilakukan ekstrasi DNA. Ekstrasi DNA pada penelitian ini menggunakan bulu untuk mendapatkan DNA. Bulu burung mempunyai prospek sebagai sumber DNA karena pada pangkal bulu (calamus) mengandung sel epitel.

Bulu (calamus) secara alami dapat terlepas dari bagian kulitnya sendiri pada saat musimnya yang biasanya disebut mabung atau molting dan tidak melukai burung tersebut. Hal ini dapat dimanfaatkan dalam memperoleh DNA. Bulu (calamus) dapat diperoleh secara langsung (pada saat mabung) maupun tak langsung (dicabut) dengan tingkat resiko kecil pada burung tersebut. (Harrap & Woods 1964).

(45)

Teknik PCR dengan menggunakan primer spesifik untuk penentuan jenis kelamin telah diketahui dapat digunakan sebagai penentu jenis kelamin burung monomorfik (Ellegren, 1996). Salah satu penenda molekuler atau primer sexing yang sering dipakai pada burung yaitu P2 dan P8 yang didesain oleh Griffiths. Primer P2 merupakan reverse, sedangkan P8 merupakan primer forward yang digunakan untuk mengetahui jenis kelamin pada umumnya. Urutan basa terdiri dari P8 yaitu CTCCCAAGGATGAGRAAYTG-3’) sedangkan P2 yaitu (5’-TCTGCATCGCTAA ATCC TTT-3’). P8 dan P2 menempel pada gen CHD pada kromosom Z dan W. Penggunaan primer sexing P8 dan P2 hampir bersifat universal pada burung untuk menentukan jenis kelaminnya dan merupakan cara yang efektif untuk membedakan burung jantan dari burung betina. Ukuran basa pita DNA yang dihasilkan dari PCR berkisar antara 300 bp sampai 400 bp dan terdapat variasi ukuran pada setiap spesies (Griffiths et al.1998).

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik untuk menggandakan

jumlah molekul DNA secara in vitro. Proses ini berjalan dengan bantuan enzim polimerase dan primer. Primer merupakan oligonukleotida spesifik pada DNA template yang berukuran pendek, yaitu sekitar 18-24 pasang basa. Primer akan menempel pada DNA cetakan di tempat spesifik. Enzim polimerase merupakan enzim yang dapat mencetak urutan DNA baru. Hasil PCR dapat langsung divisualisasikan dengan elektroforesis atau dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut (Williams, 2005). PCR diaplikasikan dalam diagnosis dan dalam deteksi gen tertentu (baik yang menguntungkan maupun yang membahayakan) pada ternak domestik (Nicholas, 2004).

(46)

Hasil dari proses PCR pada penelitian ini dapat dilihat setelah dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel agarose 1% menunjukan bahwa kedua burung tersebut berjenis kelamin jantan yang ditandai dengan munculnya satu fregman DNA.

Elektroforesis gel agarosa merupakan metode fisik yang paling banyak dipergunakan pada bidang biologi molekuler. Teknik tersebut memisahkan dan memurnikan fragmen DNA. Prinsip dasar elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan muatan listriknya. Muatan listrik positif akan menarik muatan negatif dan menolak sesama muatan positif. Sebaliknya, muatan negatif akan menarik muatan positif dan menolak semua muatan negatif. Dua elektroda, masing-masing bermuatan positif dan negatif dihubungkan dengan sumber tegangan tinggi. Pergerakan molekul didalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia molekul (Pratiwi, 2001).

(47)

Berdasarkan hasil penelitian ini, elektroforesis yang diperoleh tidak sesuai dengan hasil secara empiris namun dapat diperkuat dengan hasil anatomis yang dilakukan melalui proses pembedahan untuk melihat gonad pada kedua burung parkit yang hasilnya telah ditemukan testis pada keduanya. Hal ini menunjukan bahwa penentuan jenis kelamin dengan metode PCR dapat dipercaya keakuratannya.

Penelitian yang sama telah dilakukan pada dua ekor burung kenari dan dua ekor burung gelatik Jawa. Awalnya dua ekor burung kenari dan burung gelatik Jawa telah diketahui secara empiris berjenis kelamin jantan dan betina. Pembedahan dilakukan pada burung kenari dan burung gelatik Jawa untuk mendukung hasil PCR yang menunjukkan bahwa dua ekor burung kenari dan dua ekor burung gelatik Jawa berjenis kelamin betina karena setelah dibedah ditemukan ovarium pada keempat ekor burung tersebut, hal ini tidak sesuai dengan pendapat penjual dan peternak burung. Proses selanjutnya dilakukan PCR pada dua ekor burung kenari dan dua ekor burung gelatik Jawa dengan menggunakan primer P8 dan P2 yang telah dibaca pada elektroforesis dengan gel agarose 1 % yang hasilnya menujukkan dua band artinya dua ekor burung kenari dan dua ekor burung gelatik Jawa berjenis kelamin betina, seperti pada Gambar 2.4 (Ariani., 2013; Minardi., 2013).

(48)

BAB 6 KESIMPULAN DAN SARAN

6.1. Kesimpulan :

Kesimpulan dari penelitian ini adalah pemeriksaan gen CHDZ dan CHDW menggunakan sampel bulu (calamus) dengan metode PCR ternyata dapat digunakan untuk mengidentifikasi jenis kelamin dengan hasil yang akurat pada burung parkit (melopsittacus undulatus).

6.2. Saran :

(49)

RINGKASAN

Yustisianti Fitrian. Penelitian dengan judul “ IDENTIFIKASI GEN CHDZ

DAN CHDW BERBASIS BULU PADA BURUNG PARKIT (Melopsittacus

undulatus) UNTUK MENENTUKAN JENIS KELAMIN DENGAN METODE

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)” dibawah Prof. Dr. Fedik A. Rantam, drh selaku pembimbing utama dan Dr. Abdul Samik, drh., M.Si selaku pembimbing serta. Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa sampel bulu dari burung parkit dapat mengidentifikasi gen CHDZ dan CHDW dalam menentukan jenis kelamin dengan teknik polymerase chain reaction.

Jenis kelamin merupakan informasi yang penting dalam budidaya unggas dan penangkaran burung. Penentuan jenis kelamin pada sebagian burung sulit dilakukan karena memiliki ciri-ciri fenotipik yang sangat mirip antara jantan dan betina, bahkan setelah mencapai dewasa kelamin (monomorfik). Hal ini menjadi suatu permasalahan bagi para breeder karena mereka belum yakin dengan jenis kelamin burung yang mereka identifikasi. Penentuan jenis kelamin secara molekuler merupakan suatu solusi efektif bagi para breeder karena dapat dilakukan untuk burung yang sulit dibedakan jenis kelaminnya terutama pada burung monomorfis yang dapat dideteksi dari DNA sehingga hasilnya lebih akurat. Teknik dalam membedakan jenis kelamin pada aves telah berkembang sangat pesat salah satunya adalah dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR).

(50)

PCR merupakan suatu teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro

Penelitian ini menggunakan dua ekor burung parkit yang sudah diketahui jantan dan betina dilihat secara empiris menurut pendapat penjual dan peternak burung. Sampel penelitian ini diperoleh dari bulu (calamus) yang kemudian diekstraksi untuk mendapatkan DNA total. Sampel bulu (calamus) diekstraksi dengan menggunakan kit Cat no. 69504 Qiagen Germany yang dielektroforesis pada gel agarose 1%. Elektroforesis menggunakan gel agarose dapat menghasilkan satu band pada burung dengan jenis kelamin jantan dan pada betina menghasilkan dua band (Griffiths et al., 1998; Fridolffson and Ellegren 1999). Pembedahan dilakukan sebelum dilakukan proses PCR untuk memastikan jenis kelamin burung parkit.

pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Proses PCR memerlukan sekurang-kurangnya dua macam primer yakni primer forward dan primer reverse (Suwarno, 2005). Banyak primer yang telah didesain untuk mengenali ukuran intron yang berbeda pada gen CHD. Namun primer yang paling sering digunakan untuk mengidentifikasi jenis kelamin pada aves yaitu P2 dan P8 (Griffiths et al., 1998).

(51)

DAFTAR PUSTAKA

Archawaranon M. 2004. R apid S exing H ill M ynah Gracula R eligiosa by S ex Chromosomes. Biotechnology3: 160-164.

Ariani, I. B.2013.Penentuan J enis K elamin B urung K enari ( Serinus C anaria) Menggunakan ba han B ulu D engan M etode P CR ( Polimerase Chain Reaction) [Skripsi] Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga.

Bramwell R. K. 2003. Sexing Chicks in The Backyard Flock. Avian Advice 5: 45.

Cerit H. and Avanus. 2007. S ex I dentification in A vian S pecies U sing D NA Typing Methods. World’s Poultry Science Journal, Vol. 63.

Cerit H. and K. Avanus. 2006. Sex Identification in Avian Species Using DNA Typing Methods. World's Poultry Science Journal,63, pp 91100.

Christidis L. 1985. a R apid P rocedure f or O btaining C hromosome P reparations From Birds. Auk 102: 892 - 893.

Dvorak J., J. L. Halverson, P. Gulick, K. A. Rauen, U. K. Abbott, B. J. Kelly, and F. T . S hultz. 1992. c DNA C loning of a Z- and W -linket G ene i n ga l-linaceous Bird. J. Hered. 83: 22-25.

Ellegren H. 1996: First gene on t he avian W chromosome (CHD) provides a tag for universal sexing of non-ratite birds. Proceedings of the Royal Society of London B 263:1635–1641.

Ellegren H. and Carmichael A. : M ultiple and Independent C essation of Recombination Between A vian Sex Chromosomes. G enetics, 2001; 1 58: 325-331.

Ellegren H. 1992. Polymerase-chain-reaction (PCR) Analysis of Microsatellites-a New Approach to Studies of Genetic Relationships in Birds. The Auk 109: 886-895.

Erlich H. A. 1991. B asic M ethodelogi: In P CR T echnologi. P rinciples a nd Application for DNA Amplification. Stockton Press.1-5.

Erlich H. A. 1989. PCR Technology: Principles a nd A pplications f or D NA

Amplifications. Stockton P ress, N ew Y ork, London, T okyo, M elbourne, Hong Kong.

Fatchiyah. 2006. Gel Elektroforesis. L aboratorium Sentral Biologi Molekuler & Seluler. Universitas Brawijaya, Malang.

(52)

Forshaw, J . M . 1989. P arrots of t he W orld. Tird E dn. Lansdowne Editions, Sydney, Australia.

Fridolfsson A. K . a nd H. E llegren. 1999. A s imple a nd uni versal m ethod f or molecular sexing of non-ratite birds. J. Avi. Bio. 30: 116-121.

Graves J., J. Ortega Ruano and P. J. B. Slater. 1993. S ex Ratio of Chicks in The Shag Phalacrocorax ar-istotelis Determinaned by a Female-specific Band in DNA Fingerprinting. Ibis 135: 470-472.

Griffiths, R ., a nd P .W.H. H olland. 1990. A no vel a vian W c hromosome D NA repeat s equence in the L esser B lack-backed G ull ( Larus fuscus). Chromosoma (Berl.) 99: 243-250.

Griffiths R. a nd R . K orn. 1997. A C HD1 gene is Z chromosome l inked i n t he chicken Gallus domesticus. Gene.197: 225-229.

Griffiths, R., S. Daan and C. Dijkstra. 1996. Sex identification in birds using two CHD g enes. P roceedings of t he R oyal S ociety of London B 263: 1251 -1256.

Griffiths R., M.C. Double, K. Orr and R.G.J. Dawson : A DNA Test to Sex Most Birds. Mol. Ecol., 1998; 7: 1071-1075.

Griffiths R. and B. Tiwari : Sex of The Last Wild Spix’s Macaw. Nature, 1995; 375: 454.

Griffits R. 2000. Sex Identification Using DNA Markers. In : Molecular Methods in Ecology (BACKER A. J., Ed.), pp. 295.321, Blackwell Science, London.

Griffiths R. 1992. S ex-biased Mortality in The Lesser Black-backet Gull (Larus fuscus) During The Nestling Stage.Ibis 134: 237-244.

Han J. I., J Hye. H. Kim., S. Kim., S. R. Park., and K. J. Na. 2009. A simple and improved DNA test for avian sex determination. The Auk 126(4):779-783.

Handajani, R . 2003. D NA S equencing. Kursus B iologi M olekuler. G ramik F K Unair, Surabaya 7 Juni 2003: 1-12.

Handley R., E. Barbara and Agren. 2005. V ariation i n T richome D ensity a nd Resistance A gainst S pecialist Insect H erbivore i n Natural Populations of Arabidopssis thaliana. J.Econ. Entomol. 30 (3): 284-292.

(53)

Hickman Jr. C. P., L. S. Roberts and F. M. Hickman 1984. Integrated Principles of Zoology S event E dition. T oronto: T imes M irror/Mosby C ollege Publishing.

Innis M. A. and D. H. Gelfand, 1990. in PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications. Academic Press Inc., San Diego, New York, London, Sydney, Tokyo, Toronto. Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. (eds.), pp. 3–12.

Kahn N. W., J . J ohn and T. Q uinn. 1998. C hromosome-specific int ron size differences i n t he A vian C HD gene p rovide an e fficient m ethod for s ex identification in birds. The Auk.115: 1074 -1078.

Klug W. S . and M . R . C ummings. 1994. C oncepts of G enetics. 4th_Edition.

Prentice Hall. Engle Wood Cliffs. Pp. xvi + 779.

Lafeber Company. The Parakeet. LafeberCares Web site. Available at :

16, 2011.

Lane T. and Valencia. 2004. DNeasy Tissue Handbook.USA: Qiagen. Inc. Animal Tissue. 18-20.

Leeton P., L. Christidis and M. Westerman. : Feathers from museum bird skins: a good source of DNA for phylogenetic studies. The Condor, 1993; 95: 465-466.

Longmire J. L. M., Maltbie R.W., Pavelka L. M., Smith S. M., Witte O. A., Ryder D. L., Ellsworth and R. J. Baker. 1993. Gender Identification in Birds Using Microsatellite DNA Fingerprint Analysis. Auk 110: 378-381.

Malago Jr. W., M. F. Heitor., Jr. E. Matheucci., A. Medaglia and F. Hendrique-Silva. 2002. L arge S cale S ex T yping of O striches U sing D NA E xtracted from Feathers. BMC Biotechnology2: 19.

Millar C. D., D. M. Lambert., A. R. Bellamy., P. M. Stapleton and E. C. Young. 1992. Sex-specific Restriction Fragment and Sex Ratios Revealet by DNA Fringerprinting in The Brown Skua. J. Hered. 83: 350-355.

Minardi, D . A .2013.Penentuan J enis K elamin B urung G elatik J awa ( Padda oryzivora) M enggunakan B ulu ( calamus)Dengan T eknik P CR ( Polimerase Chain Reaction) [Skripsi] Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga.

(54)

Muladno. 2002. Teknik Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation. Bogor.

Morinha F., Carvalho M., Ferro A., Guedes-Pinto H., Rodrigues R. and Bastos E.

2011 M olecular s exing a nd a nalysis of CHD1-Z and CHD1-W sequence

variations i n w ild c ommon qua il (Coturnix c. coturnix) and domesticated

Japanese quail (Coturnix c. japonica). J. Genet.90, e39–e43.

Newton C. R. and A. Graham. 1994. PCR. UK: Bios Scientific Publishe.

Nicholas, F . W. 2004. P engantar k e G enetika Veteriner. T erjemahan: M uladno. Pustaka Wirausaha Muda, Bogor.

Pratiwi R. 2001. Mengenal M etode E lektroforesis. Oseana. Volume X XVI. Nomer 1: 25-31.

Prus S. E. and S.M. Schmutz S. M. 1987. C omparative Efficiency and Accuracy of Surgical and Cytogenetic Sexing in Psittacines. Avian Dis. 31: 420.4.

Questiau., N . Escaravage., M . C. Eybert and P . Taberlet. 2000. Nestling S ex Ratios in a Population o f B luethroats Luscinia S vecica Inferned from AFLP™ Analysis, Journal of Avian Biology 31: 8-14.

Quinn T.W., F. Cooke and B. N. White. 1990. Molecular Sexing of Geese Using A Cloned Z to the W Chromosome. Auk, 107: 199-202.

Quintana, F., C. L. Gabriela and S. Gustavo. 2008. A Cheap and Quick Method for DNA-based Sexing of Birds. Waterbirds 31 (3) :485-488.

Rantam F. A. 2007. Dasar-Dasar Polymerase Chain Reaction. Workshop Aplikasi PCR di Bidang Kesehatan dan Kedokteran.FKH Unair. Surabaya.

Riyadi, W., 2010. P arameter Penting D esain P rimer. tanggal 08 Februari 2014].

Sambrook J., EF. Fritch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual Vol 1-3 second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold

Spring Harbor.

(55)

Smith E. F. G., P. Arctander., J. Fjeldsa and O. G. Amir.1991. a New Species of Shrike (Laniidae: Laniarius) from Somalia, verified by DNA Sequence Data from The Only Known Individual. Ibis 133: 227-235.

Sulandari S . a nd M. S. A. Z ein. 2003. P anduan P raktis Laboratorium D NA. Bidang Zoologi, Puslit Biologi, LIPI.

Suwarno. 2005. D isertasi: K arakterisasi Molekuler P rotein Serta G en Penyandi Nucleuprotein dan Glycoprotein Virus R abies da ri B eberapa D aerah Geografik di Indonesia. Program Doktor Ilmu Kedokteran. Program Pasca Sarjana. Universitas Airlangga. Surabaya.

Suwarno. 2007. Isolasi R NA/DNA unt uk T ujuan Identifikasi F ragment/Full Genom Organisme dengan Polymerase Chain Reaction.Workshop Aplikasi PCR di Bidang Kesehatan dan Kedokteran.FKH Unair.Surabaya.

Swengel S. R. (1996) Special Techniques, C: Sex Determination In: Cranes: Their Biology, H usbandry, and C onservation; E llis, D .H.; G ee, G.F.; M irande, C.M. E ds.; N ational Biological S ervice/International C rane F oundation: United States of America, pp223-231.

Taberlet et a l. 1996. R eliable G enotyping o f Samples wi th Very Low DNA Quantities Using PCR. Nuc Acids Res 24: 3189–3194.

Viljoen G . J ., L . H . Nel and J. R . C rowther. 2005. M olecular D iagnostic P CR Handbook. Springer, Dordrecht, Netherland.

Widodo W. 2002. Parkit. Jakarta: Penebar Swadaya.

Williams J. L. 2005. T he us e of M arker-assisted Selection in Animal B reeding and Biotechnology. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 24 (1): 379-391.

The Parakeet. LafeberCares Web site. Accessed February 5, 2014.

(56)

L A M P I R A N

Lampiran 1. Bahan Penelitian

Bulu (calamus) yang digunakan sebagai sampel DNA

Proteinase K (A) berfungsi untuk

jaringan yang akan diekstraksi

memotong-motong atau memutus ikatan peptida dari protein-protein sel, Buffer ATL (B) untuk melisiskan

Buffer AW1 (A) dan AW2 (B) digunakan untuk membersihkan dari residu ethanol selama proses pemurnian

calamus

B A

(57)

Ethanol yang digunakan pada proses ekstraksi

Super Master Mix yang terdiri dari Taq polymerase, DNTPs, PCR reaction buffer, Gel loading buffer

Primer yang digunakan untuk proses PCR yaitu primer P2 dan P8

(58)

Ethidium Bromide sebagai pewarna fluorescent yang digunakan untuk pewarnaan asam nukleat

Bubuk agarosa digunakan untuk proses elektroforesis

(59)

Lampiran 2. Alat Penelitian

Microcentrifuge tube eppendorf sebagai penampung DNA pada saat dilakukan isolasi

Collection tube eppendorf tabung yang ada filternya dan digunakan untuk menyaring DNA

Tips (A), dan Mikropipet eppendorf (B) yang digunakan untuk memindahkan secara akurat suatu larutan dalam ukuran yang kecil

A B

(60)

Vortex (A) dan Spin down (B) untuk homogenisasi pada saat melakukan isolasi DNA

Microcentrifuge (A) dan stavolt (B) digunakan untuk homogenisasi DNA dengan kecepatan yang tinggi.

A B

(61)

Dry bath Lab stuff yang digunakan untuk inkubasi sampel DNA

Mesin PCR Bio Rad yang digunakan dalam penelitian

Alat elektroforesis

(62)