Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah [Piper crocatum Ruiz & Pav] terhadap kultur sel raji - USD Repository

(1)

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)

TERHADAP KULTUR SEL RAJI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Eva Dwi Kusumaningtyas NIM : 048114147

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2008

(2)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Eva Dwi Kusumaningtyas NIM : 048114147

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2008

(3)

PERSETUJUAN PEMBIMBING

Yang diajukan oleh :

Eva Dwi Kusumaningtyas

NIM : 048114147

telah disetujui oleh

(4)

Pengesahan Skripsi Berjudul

Oleh :

NIM : 048114147

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 28 Juni 2008

(5)

HALAMAN PERSEMBAHAN

Aku menanti datangnya pagi

Dan aku temui

Aku menanti bergantinya hari

Dan aku temui

Aku menanti musim berganti

Dan aku temui

Aku mencari hati

Dan aku dapati

Tiada kata yang bisa terucap selain terimakasih

Dan tiada hal yang dapat kuingat selain

KASIH

Skripsi Ini kupersembahkan Untuk :

Papa dan Mamaku tercinta....

Kakakku

terkasih....

Saudara

dan

teman

–

temanku....

Almamaterku...

(6)

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma :

Nama : Eva Dwi Kusumaningtyas

Nomor Mahasiswa : 048114147

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Raji”

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 18 Juli 2008

Yang menyatakan

( Eva Dwi Kusumaningtyas )

(7)

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas semua

rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan

penulisan skripsi yang berjudul “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Raji.” Skripsi ini disusun dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Sarjana Farmasi (S.Farm).

Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak terlepas dari

bantuan dan dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan

terimakasih kepada :

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma.

2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing atas

kesediaannya dalam memberikan arahan, dukungan dan masukan dalam

penelitian dan penulisan skripsi ini.

3. Drs. Mulyono., Apt. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan

masukan kepada penulis.

4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah banyak

memberikan masukan kepada penulis.

5. Ibu Tri Yuliani dan segenap karyawan LPPT Universitas Gadjah Mada yang

telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian.

(8)

6. Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., dan Romo Sunu yang telah membantu

penyelesaian skripsi ini.

7. Papa dan Mamaku tercinta, Kakakku Petra, Mbak Dwi, dek Pasha, Andreas

Bob Dwi Putra dan segenap keluarga besar atas semua dukungan, kasih

sayang dan semangat yang diberikan.

8. Anggota team sirih merah : Ririt, Meri, Siska dan Nur, terimakasih untuk

kerjasama dan bantuannya, serta suka dan duka dalam masa ‘penantian’.

9. Rike, Bu Novi dan temen – temen GTY, Mbak Darti sekeluarga, Bapak

Narkoyo sekeluarga yang selalu memberikan dukungan.

10.Teman - teman kosku Yanti, Dewi, Ayu, Wulan, teman – teman kelas C dan

praktikum golongan F, Vina, Syamsi, Mas Adi, Robert, Finza, Budiaji, Maria,

Siska, Evi, Dhita, Mas Ary, Yusak, Hendrat, Kornel untuk pengertian dan

dukungan yang diberikan serta persahabatan kita.

11.Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang terdapat dalam

penelitian dan penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu penulis mengharapkan

kritik dan saran yang menyempurnakan. Semoga penulisan skripsi ini dapat

memberikan manfaat bagi semua pihak serta mendukung perkembangan ilmu

pengetahuan.

Yogyakarta, Mei 2008

Penulis

(9)

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak

memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam

kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 10 Mei 2008 Penulis

(10)

INTISARI

Di Indonesia, kanker merupakan salah satu penyakit yang masih berpotensi tinggi dalam menyebabkan kematian. Secara empiris, tanaman sirih merah (Piper crocatum) telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat antikanker. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi efek sitotoksik dan nilai LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola satu arah. Ekstrak etanolik daun sirih merah dibuat dalam delapan konsentrasi yaitu 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah dilakukan dengan metode direct counting. Perolehan hasil perhitungan merupakan persen kematian sel yang kemudian dilakukan analisis statistik menggunakan Anova satu arah dan analisis probit untuk menentukan nilai LC50.

Melalui uji sitotoksisitas yang dilakukan dapat diketahui bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel Raji, dengan nilai LC50 395,5 µg/ml.

Kata kunci : sitotoksisitas, ekstrak etanolik, daun sirih merah, LC50, sel Raji

(11)

ABSTRACT

In Indonesia, cancer is a kind of the disease that might cause death. Empiricaly, Piper crocatum Ruiz & Pav has been used for cancer treatment. The objective of this research is to identify the cytotoxicity potential and the LC50 of

ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav against Raji Cell Culture.

This research was pure experimental with one way completely randomized design. Ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav was made on eight concentration, that were 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750 and 2000 µg/ml. The cytotoxicity test have been done with the direct counting method. Cytotoxicity of ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav were analyzed with one way Anova and the LC50 value were analyzed with probit statistic.

The result showed that the extract of Piper crocatum Ruiz & Pav have cytotoxicity effect on Raji cell culture with LC50 value of 395.5 µg/ml.

Keyword : cytotoxicity, ethanolic extract, Piper crocatum Ruiz & Pav, LC50, Raji cell culture

(12)

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL ... i

HALAMAN JUDUL... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

PENGESAHAN SKRIPSI ... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN... ...v

PRAKATA... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... viii

INTISARI... ix

ABSTRACT...x

DAFTAR ISI... xi

DAFTAR TABEL...xv

DAFTAR GAMBAR ... xvi

DAFTAR LAMPIRAN... xviii

BAB I PENGANTAR ...1

A. Latar Belakang ...1

1. Perumusan Masalah...2

2. Keaslian karya ...3

3. Manfaat penelitian ...3

B. Tujuan Penelitian ...3

1. Tujuan umum...3

2. Tujuan khusus...3

(13)

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...4

A. Sirih Merah... ... 4

1. Keterangan Botani ...4

2. Deskripsi Tanaman ...4

3. Kandungan Kimia...4

4. Khasiat dan Kegunaan ...5

B. Teknik Penyarian…………... 5

C. Kanker ...7

1. Tinjauan Umum ...7

2. Limfoma ...10

D. Kultur Sel ...10

E. Sitotoksisitas ...11

F. Landasan Teori...12

G. Hipotesis...13

BAB III METODOLOGI PENELITIAN...14

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...14

B. Variabel dan Definisi Operasional ...14

a. Variabel ...14

1. Variabel bebas...14

2. Variabel tergantung...14

3. Variabel pengacau terkendali...14

(14)

C. Alat dan Bahan...15

1. Alat ...15

2. Bahan ...15

D. Tata Cara Penelitian ...16

1. Determinasi tanaman ...16

2. Pengumpulan daun sirih merah ...16

3. Pembuatan serbuk daun sirih merah ...16

4. Sterilisasi alat...17

5. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah ...17

6. Pembuatan larutan uji ...17

7. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh ...18

a. Pembuatan medium pencuci ...18

b. Pembuatan medium penumbuh ...18

8. Preparasi kultur sel Raji...18

a. Propagasi sel raji...18

b. Panen sel raji...19

9. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah dengan menggunakan metode direct counting...19

E. Analisis Hasil ...20

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...21

A. Determinasi Tanaman ...21

(15)

C. Pembuatan serbuk daun sirih merah ...22

D. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ...22

E. Sterilisasi Alat ...24

F. Pembuatan Medium Pencuci dan Penumbuh...24

G. Preparasi Kultur Sel Raji...25

H. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah...26

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN...33

A. Kesimpulan ...33

B. Saran...33

DAFTAR PUSTAKA ...34

LAMPIRAN...37

(16)

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Pelarut dan tingkat kepolaran...7

Tabel II. Hasil perhitungan sel raji secara direct counting pada perlakuan

masing-masing konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah setelah

inkubasi 24 jam ...27

Tabel III. Persentase kematian sel raji dan harga probit setelah pemberian ekstrak

etanolik daun sirih merah setelah inkubasi 24 jam ...29

Tabel IV. Harga probit sesuai dengan prosentasenya ...42

Tabel V. Nilai koefisien korelasi pada level signifikansi 5% dan 1% ...50

(17)

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Sel Raji pada kontrol dan sel Raji dengan pemberian ekstrak etanolik

daun sirih merah 2000 µg/ml, pada bilik haemocytometer di bawah

mikroskop dengan perbesaran 100x...26

Gambar 2. Sel raji yang mati seluruhnya pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 2000 µg/ml; sel raji pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 250 µg/ml, pada perbesaran 100x ...27

Gambar 3. Kontrol pada perbesaran 100x, tidak terdapat kematian sel raji ...28

Gambar 4. Grafik pengaruh konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap persentase kematian sel Raji ...28

Gambar 5. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan I ...30

Gambar 6. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan II...31

Gambar 7. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan III ...31

Gambar 8. Tanaman Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)...38

Gambar 9. 96 well Plate dan conical steril...38

Gambar 10. Kultur sel raji dalam flask ...38

Gambar 11. Laminar air flow...39

Gambar 12. Haemocytometer dan cell counter...39

Gambar 13. Inverted microscope...39

(18)

Gambar 14. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1750 µg/ml...40

(19)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil determinasi ...7

Lampiran 2. Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian ...38

Lampiran 3. Sel raji dengan pemberian ekstrak setelah inkubasi 24 jam ...40

Lampiran 4. Tabel probit...42

Lampiran 5. Perhitungan LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel raji ...43

Lampiran 6. Perhitungan nilai korelasi LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji pada taraf kepercayaan 95%...50

Lampiran 7. Tes distribusi normal Kolmogorov-Smirnov...51

Lampiran 8. Analisis statistik Anova satu arah...51

(20)

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang

Kanker merupakan salah satu penyakit yang berpotensi tinggi dalam

menyebabkan kematian dan bertanggung jawab atas satu dari setiap lima

kematian. Di Indonesia, kanker menempati peringkat keenam setelah penyakit

jantung dan jumlah pasien kanker mengalami peningkatan setiap tahun (Adamo,

2006). Pengobatan terhadap kanker dapat dilakukan dengan cara pembedahan,

kemoterapi dan radioterapi. Alternatif lain yang digunakan oleh sebagian

penderita kanker adalah melalui ramuan tradisional dari tanaman. Pengembangan

dan pemanfaatan bahan alam terutama tanaman telah berlangsung lama di

Indonesia yang kaya akan tumbuh – tumbuhan (Dalimartha, 2006). Masyarakat

dengan latar belakang budaya dan etniknya, lazim menggunakan obat tradisional

dengan memanfaatkan bahan alam tersebut yang disebut dengan jamu. Namun

penggunaan tanaman sebagai obat biasanya masih terbatas secara tradisional dan

turun temurun berdasarkan pengalaman.

Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mempunyai bentuk

yang menarik dan dapat berfungsi sebagai antikejang, antiseptik, analgetik,

antiketombe, antidiabetes, pelindung hati, antidiare, mempertahankan kekebalan

tubuh dan penghilang bengkak serta berbagai macam radang, dan yang paling

menarik adalah pemakaian empiris ekstrak yang diklaim dapat menyembuhkan

penyakit kanker payudara dan kanker rahim (Sudewo, 2005). Pemanfaatan daun

(21)

sirih merah sebagai obat kanker telah diakui secara empiris, baik digunakan secara

tunggal maupun dikombinasikan dengan tanaman lain dalam berbagai bentuk

seperti rebusan dan kapsul. Akan tetapi, secara ilmiah belum terdapat bukti yang

mendukung mengenai kebenaran aktivitas tanaman sirih merah sebagai obat

antikanker.

Mengacu pada klaim khasiat bahwa ekstrak daun sirih merah tersebut

dapat mengobati penyakit kanker payudara dan kanker rahim, maka perlu

dilakukan penelitian mengenai potensi ekstrak daun sirih merah terhadap penyakit

kanker yang lain. Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan

gambaran mengenai potensi efek sitotoksik ekstrak etanolik daun sirih merah

terhadap kultur sel kanker limfoma.

1. Perumusan Masalah

Uji sitotoksisitas dapat dilakukan secara in vitro dengan menggunakan

suatu kultur sel. Kultur sel Raji merupakan kultur sel kanker yang diturunkan dari

penyakit Limfoma Burkitt. Berdasarkan latar belakang dari penelitian maka

timbul beberapa permasalahan, yaitu :

a. Apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap

kultur sel Raji ?

b. Berapakah nilai LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel

(22)

2. Keaslian Karya

Sejauh ini, penulis belum menemukan adanya penelitian mengenai uji

sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav)

terhadap kultur sel Raji di Universitas Sanata Dharma dan Universitas Gadjah

Mada Yogyakarta.

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan dan memperkaya

informasi mengenai daya sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

terhadap kultur sel Raji.

b. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan suatu alternatif untuk

pengobatan kanker dengan memanfaatkan bahan alam.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik dari

ekstrak etanolik daun sirih merah.

2. Tujuan Khusus

a. Untuk mengetahui potensi sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

terhadap kultur sel Raji.

b. Untuk mengetahui nilai LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur

(23)

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Sirih Merah

1. Keterangan Botani

Tanaman sirih merah termasuk ke dalam famili Piperaceae dan genus

Piper, memiliki nama spesies Piper crocatum Ruiz & Pav, serta sinonim dengan

Piperornatum N.E.Br (Anonim, 2007a).

2. Deskripsi Tanaman

Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau.

Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya

bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata dan

permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15

sampai dengan 20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak warna putih keabu

– abuan. Bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir,

berasa sangat pahit dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan

jarak buku 5 – 10 cm, di setiap buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).

3. Kandungan Kimia

Dari hasil penelitian berupa uji tabung dan uji kromatografi lapis tipis

diketahui daun sirih merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, senyawa

polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

(24)

4. Khasiat dan Kegunaan

Dalam penggunaan secara empiris ekstrak daun sirih merah pada

pemakaian tunggal atau dikombinasikan dengan tanaman obat lainnya mampu

mengobati penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tubuh

tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukemia,

TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi

dan asam urat (Sudewo, 2005).

B. Teknik Penyarian

Ekstraksi atau penyarian adalah kegiatan penarikan kandungan kimia

yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan

pelarut air. Hal – hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan ekstrak meliputi

pembuatan serbuk simplisia dan klasifikasinya, cairan penyari, pemekatan,

pengeringan ekstrak dan rendemen (Anonim, 2000).

Ekstrak merupakan sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi

zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang

sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau

serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah

ditetapkan (Anonim,1995). Pada ekstrak tumbuhan (umumnya konsentrasi

etanolnya berbeda – beda) jika bahan pengekstrasinya sebagian atau seluruhnya

diuapkan, maka diperoleh ekstrak, yang dikelompokkan menurut sifat – sifatnya

menjadi :

a. Ekstrak encer (extractum tenue). Merupakan ekstrak dengan konsistensi yang

(25)

b. Ekstrak kental (extractum spissum). Ekstrak ini liat dalam keadaan dingin dan

tidak dapat dituang. Kandungan airnya berjumlah sampai 30%. Jika

kandungan air terlalu tinggi maka dapat menyebabkan suatu instabilitas bahan

(tumbuhnya bakteri).

c. Ekstrak kering (extractum siccum). Memiliki konsistensi kering dan mudah

digosokkan. Melalui penguapan cairan pengekstraksi dan pengeringan

terbentuk suatu produk, biasanya menunjukkan kandungan lembab tidak lebih

dari 5%.

d. Ekstrak cair (extractum fluidum). Diartikan sebagai suatu sediaan cair

simplisia yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet atau

sebagai pelarut dan pengawet (Voigt, 1994; Anonim, 1995)

Pengetahuan mengenai kandungan senyawa aktif yang terkandung dalam

simplisia akan mempermudah pemilihan cairan penyari dan cara ekstraksi yang

tepat (Anonim, 2000). Pemilihan cairan penyari harus meliputi beberapa kriteria,

antara lain adalah murah dan mudah diperoleh, stabil secara kimia fisika, selektif

yaitu hanya menarik zat berkhasiat yang dikehendaki, tidak mempengaruhi zat

berkhasiat dan diperbolehkan oleh peraturan. Cairan penyari yang digunakan

dapat berupa air, etanol, etanol – air atau pelarut lain. Oleh karena banyak bahan

tumbuhan larut air atau larut alkohol, maka air atau etanol lebih disukai

penggunaannya sebagai cairan pengekstraksi (Voigt, 1994). Bila cairan penyari

digunakan air, maka untuk mencegah timbulnya kapang ditambahkan bahan

(26)

Tabel I. Pelarut dan Tingkat Kepolaran

Pelarut Tingkat Kepolaran

Air 10,2

DMSO 7,2

Etanol 4,3

Etil Asetat 4,4

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan

dengan cara merendam serbuk simplisia ke dalam cairan penyari. Metode ini

digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah

larut dalam cairan penyari. Kerusakan senyawa yang tidak tahan panas dapat

dihindari dengan metode ini (Anonim, 1986).

C. Kanker

1. Tinjauan Umum

Proliferasi sel terjadi melalui suatu rangkaian proses. Siklus dari sel

sendiri terdiri dari fase mitosis dan interfase. Pada proses interfase tersebut sel

akan mengalami fase G-1 yang merupakan permulaan dari replikasi asam

deoksiribonukleat (DNA). Kemudian melalui fase S yaitu pembentukan DNA

baru, jumlah kromosom akan berlipat dua dan terjadi persiapan ke tahapan

selanjutnya. Fase G-2 merupakan fase pertumbuhan, kromosom yang terbentuk

(27)

Kanker adalah suatu penyakit dimana terjadi pertumbuhan sel – sel

jaringan tubuh yang tidak normal, cepat dan tidak terkendali. Dalam keadaan

normal, sel hanya akan membelah jika tubuh membutuhkannya seperti mengganti

sel rusak dan mati. Sebaliknya, sel kanker akan terus membelah diri meskipun

tidak dibutuhkan, terlepas dari pengendalian pertumbuhan dan tidak lagi menuruti

hukum – hukum pembiakan (Dalimarta, 2006). Sifat dari sel kanker adalah

mempunyai kemampuan untuk bermigrasi dari tempatnya tumbuh ke jaringan di

dekatnya (invasif) dan membentuk massa pada daerah baru di dalam tubuh

(metastasis). Kanker terdiri dari sel ganas, menjadi lebih agresif dari waktu ke

waktu dan menjadi letal apabila jaringan atau organ yang diperlukannya untuk

bertahan hidup mengalami gangguan (Sofyan, 2000).

Penyebab dari kanker dapat berupa inveksi virus maupun faktor – faktor

yang menginduksi penyakit oleh perubahan gen –gen secara mutasi. Mutasi

merupakan perubahan yang terjadi pada gen atau pada kromosom. Beberapa buah

mutasi mungkin dibutuhkan untuk mengubah sel normal menjadi sel kanker.

Mutasi-mutasi tersebut sering diakibatkan agen kimia maupun fisik yang disebut

karsinogen. Mutasi dapat terjadi secara spontan (diperoleh) ataupun diwariskan

(mutasi germline). Bila sel kehilangan kemampuan untuk melakukan apoptosis

(misalnya karena mutasi), atau bila inisiatif untuk melakukan apoptosis dihambat

(oleh virus), sel yang rusak dapat terus membelah tanpa terbatas, yang akhirnya

menjadi kanker. Apoptosis dapat terjadi misalnya ketika sel mengalami kerusakan

(28)

berasal dari sel itu sendiri, dari jaringan yang mengelilinginya, atau dari sel yang

berasal dari sistem imun (Anonim, 2007b).

Terjadinya kanker disebut pula dengan karsinogenesis. Dalam prosesnya

dibagi menjadi beberapa tahapan berupa :

a. Tahap inisiasi, sebagai tahap awal yang mengakibatkan terjadinya perubahan

genetik sehingga menyebabkan abnormalitas proliferasi sel tunggal. Pada

perubahan ini seringkali disebabkan karena mutasi atau pengaruh zat – zat

yang bersifat karsinogen.

b. Tahap promosi, sel tumbuh sangat pesat yang pada akhirnya menjadi tumor

benigna.

c. Tahap progresi, neoplasma akan berkembang menjadi bersifat ganas, biasanya

diikuti invasi sel tumor ke dalam jaringan setempat dan dapat terjadi proses

metastasis.

d. Tahap metastasis akan mengakibatkan penyebaran sel neoplastik dari tempat

tumor utama menuju tempat yang lebih jauh (Schneider, 1997).

Sel kanker dikenal oleh tubuh sebagai bahan asing, sehingga mekanisme

imunologi tubuh akan bereaksi secara humoral maupun seluler. Tubuh

mempunyai kemampuan immunosurveillance terhadap semua sel kanker maupun

sel yang bermutasi untuk mencegah perkembangan sel kanker tersebut, namun

terkadang terjadi immunological escape yaitu sel kanker luput dari pengawasan

sistem imun, sehingga terjadilah kanker. Penderita kanker sendiri juga mengalami

supresi imun, tetapi kanker juga mempengaruhi sistem imun itu sendiri (Nafrialdi,

(29)

2. Limfoma

Limfoma adalah kanker yang berasal dari jaringan limfoid mencakup

sistem limfatik dan imunitas tubuh. Kelainan umum yang sering menyertai adalah

pembesaran kelenjar limfe dan terdapat kelainan sumsum tulang. Dalam praktek

yang dimaksud dengan limfoma adalah LH (Limfoma Hodgkin) dan LNH

(Limfoma Non Hodgkin). Pada LNH disebabkan oleh rangsangan imunologik

yang menimbulkan proliferasi jaringan limfoid yang tidak terkendali (Tambunan,

2003).

D. Kultur Sel

Kultur sel merupakan keadaan dimana sel prokariotik maupun eukariotik

berada dalam kondisi yang terkontrol. Sedangkan kultur primer adalah sel yang

diisolasi dari suatu jaringan maupun organ aslinya kemudian ditumbuhkan dalam

kultur media secara invitro dan dikondisikan sama seperti pada saat sel masih

berada dalam jaringan aslinya (Freshney, 2000). Pemeriksaan kultur ini dapat

dilakukan dengan pengamatan morfologi sel, warna medium dan kepadatan sel

(Wolf, 2006). Pemindahan sel ke dalam flask baru dengan medium yang baru

disebut dengan subkultur (Freshney, 2000).

Sel Raji merupakan continous cell line yang berasal dari sel β – limfoma

manusia. Dikenalkan pada tahun 1964 yang diturunkan dari penyakit Limfoma

Burkitt yang diderita oleh seorang anak laki – laki berusia 11 tahun. Penyakit ini

dihubungkan dengan infeksi oleh virus Epstein Barr yaitu virus DNA yang

menimbulkan ploriferasi pada sel – sel β normal. Protein virus ini menginaktivasi

(30)

mengalami pembelahan secara berkelanjutan (King, 2000). Bentuk morfologi dari

sel Raji berupa sel tunggal berbentuk lingkaran yang terkadang dalam bentuk

berkelompok. Sifat yang dimiliki sel raji adalah tidak melekat pada dinding atau

dasar sumuran namun melayang di dalam cairan media (Anonim, 2007c).

E. Sitotoksisitas

Sitotoksisitas dapat didefinisikan sebagai sifat beracun suatu senyawa

terhadap sel hidup. Uji sitotoksisitas dapat dilakukan secara invitro menggunakan

kultur sel di dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik maupun

bahan – bahan kimia yang lain (Freshney, 1986).

Penggunaan haemocytometer sangat umum dan sering dipakai dalam

penghitungan sel karena efisien dan akurat. Suatu chamber hitung yang kaku

berbentuk kotak dan memiliki kedalaman 0,1 mm digunakan sebagai media bantu

dalam penghitungan sel. Pada saat chamber telah terisi dengan suspensi sel, dapat

dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dan sel dihitung pada sejumlah bilik

yang dipilih pada haemocytometer. Dari perhitungan yang dilakukan, dapat

ditentukan jumlah sel per ml dari suspensi sel tersebut. Untuk mengetahui sel

yang hidup maupun yang mati dapat digunakan zat penanda seperti trypan blue.

Pada metode ini perlu diperhatikan pada saat pengisian suspensi sel ke dalam

chamber pada haemocytometer agar tidak terjadi gelembung yang dapat

menyebabkan terjadinya kesalahan dalam perhitungan sel. Kondisi lain yang

menentukan keakuratan dalam perhitungan sel adalah kebersihan bilik hitung

yang digunakan dan ketepatan dalam pengisian suspensi sel ke dalam chamber

(31)

F. Landasan Teori

Efek flavonoid terhadap macam – macam organisme sangat banyak

macamnya, hal ini mengakibatkan tumbuhan yang mengandung flavonoid banyak

dipakai dalam pengobatan tradisional. Flavonoid telah menunjukkan perannya

sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik, dan aktivitas vasodilatator.

Potensi antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk mencegah kerusakan

oksidatif pada pengendalian sejumlah penyakit (Miller, 1999). Selain itu juga

diketahui bahwa terdapat senyawa flavonoid mampu menghambat DNA

polimerase Tiga senyawa flavonoid alam telah diisolasi menggunakan etil asetat,

yang berasal dari fraksinasi S. feruginosa, yaitu kuersetin, kuersetrin, dan flavonol

glikosida 4-O-asetil kuersetrin memiliki daya sitotoksik pada kultur jaringan

kanker glioblastoma manusia (Miller, 1999).

Pada umumnya alkaloid merupakan senyawa yang tidak berwarna,

kelarutannya sangat bervariasi tergantung struktur dan bentuknya dalam

tumbuhan (Roberts, 1998). Beberapa alkaloid telah diketahui memiliki aktivitas

antikanker melalui interaksi dengan target seperti RNA polimerase dan DNA

topoisomerase (Sukardiman, 2003). Senyawa alkaloid yang terkandung di dalam

tanaman seperti senyawa vinkristin dan vinblastin dapat menghambat RNA

polimerase, vinblastin berperan dalam penghambatan pembelahan sel yaitu pada

tahap metafase. Ekstraksi dari senyawa alkaloid dalam tanaman dapat dilakukan

dengan menggunakan pelarut etanol atau etil asetat melalui metode ekstraksi yang

(32)

G. Hipotesis

Ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap

(33)

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan penelitian

Penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel Raji ini termasuk penelitian

eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel

a. Variabel Bebas

Konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yaitu 250; 500; 750; 1000;

1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml.

b. Variabel Tergantung

Persentase kematian sel Raji.

c. Variabel Pengacau Terkendali

i. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan

dengan memanen daun sirih merah pada tempat dan waktu yang sama.

ii. Medium tumbuh sel Raji dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI

1640-serum.

2. Definisi Operasional

a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih

merah terhadap kultur sel Raji.

(34)

b. LC50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu

membunuh atau dapat menyebabkan kematian sejumlah 50% sel uji (sel Raji)

dan dinyatakan dalam µg/ml.

c. Ekstrak etanolik daun sirih merah adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara

mengekstraksi daun sirih merah secara maserasi dengan penyari etanol 70%.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat - alat gelas,

timbangan analitik (Mettler Toledo), alumunium foil, tabung conical (Nunc),

autoklaf, tissue culture flask (Nunc), swing rotor centrifuge, inkubator

(inco 2 memmert), mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter

(togoshiseiki), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), inverted

microscope (Olympus IMT-2), mikroskop (Olympus), haemocytometer (Neubauer

Improved), tissue, glove, masker, waterbath, yellow tip, blue tip, effendorf,

blender, oven, ayakan.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :

a. Daun sirih merah

b. Kultur sel Raji yang diambil dari stok Laboratorium Penelitian dan Pengujian

Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

c. Etanol 70% (bahan penyari daun sirih merah)

(35)

e. Trypanblue

f. Aquabidest

g. Media pencuci: RPMI 1640 (Gibco), natrium bikarbonat, Hepes

h. Media penumbuh: RPMI 1640 (Gibco), FBS (Foetal Bovine Serum)

10%(Gibco), Penisilin Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco).

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Tanaman

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih

merah yang telah dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas

Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta menggunakan acuan baku Backer

dan Brink (1965).

2. Pengumpulan Daun Sirih Merah

Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian diambil dari daerah

Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Propinsi Jawa

Tengah.

3. Pembuatan Serbuk Daun Sirih Merah

Daun sirih merah segar dicuci menggunakan air mengalir dan ditiriskan

sehingga sisa air menghilang. Untuk proses pengeringan digunakan oven pada

suhu 60 – 70 °C. Hasil pengeringan diserbuk menggunakan blender dan diayak

dengan pengayak 0,75 mm. Serbuk yang diperoleh disimpan dalam botol

(36)

4. Sterilisasi Alat

Alat – alat yang akan digunakan dicuci bersih menggunakan deterjen,

dibilas menggunakan air mengalir dan dikeringkan. Masing – masing dibungkus

menggunakan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit

pada suhu 121°C dengan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005).

5. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

Serbuk kering daun sirih merah ditimbang sebanyak 100 gram kemudian

dimaserasi menggunakan 700 ml larutan penyari etanol 70%. Kemudian ditutup

dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari. Setelah 24 jam sari

diserkai, disaring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah

cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari

sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung

dari cahaya, rendaman harus dikocok berulang-ulang (kira-kira 3x sehari). Setelah

2 hari maserat disaring dengan kertas saring kemudian ditampung. Maserat yang

terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65oC dibantu

dengan kipas angin hingga diperoleh ekstrak kental.

6. Pembuatan larutan uji

Ekstrak etanolik daun sirih merah ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan

dengan DMSO dan diaduk sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak

induk dengan konsentrasi 100 mg/ml. Dari sediaan ekstrak induk tersebut, dibuat

sediaan uji, dengan konsentrasi sebesar 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000

(37)

7. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh a. Pembuatan medium pencuci

RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml,

ditambahkan 2,3 gram natrium bikarbonat dan 2 gram Hepes, diencerkan sampai

diperoleh volume 100 ml, pH dibuat 7,2 dan larutan disterilkan dengan

menggunakan filter berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada

suhu 4 °C (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

b. Pembuatan medium penumbuh (RPMI 1640-serum)

Dibuat suatu campuran antara 10 ml FBS (Foetal Bovine Serum), 2 ml

penisilin – streptomisin dan 0,5 ml fungison, ditambahkan RPMI 1640 sehingga

diperoleh volume 100 ml. Larutan disterilkan dengan menggunakan filter

berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4 °C

(Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

8. Preparasi Kultur Sel Raji a. Propagasi Sel Raji

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam

penangas air 37°C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul

dibuka dan sel Raji dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium

RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang,

diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan.

Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci

ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium

(38)

sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan

diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37°C dengan aliran 5% CO2 dari

udara. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga

konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.

b. Panen Sel Raji

Setelah jumlah sel cukup, media diganti dengan RPMI 1640 baru

sebanyak 5 ml kemudian sel diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel

dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai

volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan

dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel

kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah

sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3,0x104/100 µl.

9. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah dengan Menggunakan Metode Direct Counting

Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel Raji dengan

kepadatan 3,0x104/100 µl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well

plate kemudian diberikan 100 µl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar

250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml pada masing – masing

sumuran. Sebagai kontrol, digunakan 200 μl suspensi sel dalam media penumbuh.

Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C, dalam

inkubator dengan aliran CO2 5% dari udara. Pada akhir masa inkubasi, tiap

(39)

dimasukkan dalam haemocytometer, diletakkan di bawah mikroskop kemudian

dihitung jumlah sel hidup dan mati menggunakan cell counter.

E. Analisis Hasil

Prosentase kematian sel hasil perlakuan dihitung menggunakan rumus

sebagai berikut : % Kematian sel = 100%

A ×

Β − Α

Keterangan : A = Jumlah sel hidup pada sumuran kontrol media

B = Jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan

Distribusi data diuji menggunakan Kolmogorov-Smirnov. Untuk mengetahui

perbedaan antara kontrol dan perlakuan digunakan one-way Anova dengan taraf

(40)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Tujuan dari determinasi ini adalah untuk memberikan kepastian terhadap

kebenaran tanaman yang hendak diuji yaitu sirih merah, sehingga menghindari

kekeliruan penggunaan bahan dengan tanaman lain. Determinasi dilakukan di

Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta menggunakan acuan baku Backer dan Brink (1965). Hasil yang

didapatkan dari determinasi menyatakan kebenaran tanaman yang digunakan

dalam penelitian ini adalah sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).

B. Pengumpulan Daun Sirih Merah

Pada penelitian ini digunakan daun sirih merah yang diambil dari daerah

Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Propinsi Jawa

Tengah, pada bulan September 2007. Pemanenan dilakukan pada tanaman di

tempat dan waktu yang sama, hal ini dimaksudkan untuk penyeragaman

kandungan kimia atau meminimalkan variasi kandungan kimia. Daun sirih merah

dipilih pada keadaan tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda yaitu pada tanaman

yang berumur 4 bulan dan daunnya berumur 1 bulan, dengan tujuan mendapatkan

kandungan senyawa yang optimal. Untuk menjaga kualitas daun yang dipakai

maka dipilih daun yang tebal, segar dan berwarna terang kemudian dicuci di

bawah air mengalir untuk memastikan daun sirih merah bersih dari kotoran seperti

debu dan serangga yang menempel.

(41)

C. Pembuatan Serbuk Daun Sirih Merah

Hasil pencucian daun sirih merah kemudian ditiriskan dan dikeringkan

menggunakan oven pada suhu 60 – 70 °C sehingga kadar air yang terkandung

dalam simplisia berkurang, dengan demikian reaksi enzimatis dan tumbuhnya

mikroorganisme dapat diminimalkan. Dipilih pengeringan menggunaan oven

karena memiliki keuntungan dibandingkan dengan pengeringan menggunakan

sinar matahari yaitu tidak tergantung cuaca serta suhu yang digunakan dapat

ditentukan selain itu waktu yang dibutuhkan relatif lebih singkat. Penyerbukan

dilakukan untuk memperkecil ukuran partikel dari daun sirih merah. Dalam

bentuk serbuk, luas permukaan partikel yang dapat kontak langsung dengan cairan

penyari menjadi lebih besar sehingga kandungan kimia yang terkandung dapat

tersari secara maksimal. Untuk memperoleh derajat halus yang optimal digunakan

ayakan 0,75 mm. Derajat halus perlu diperhatikan karena jika digunakan nomor

mesh yang terlalu besar ukuran serbuk yang dihasilkan akan semakin kecil dan

cenderung menggumpal sehingga cairan penyari akan sulit untuk masuk diantara

serbuk, sedangkan nomor mesh yang terlalu kecil akan menghasilkan ukuran

serbuk yang besar dan memperkecil luas permukaan partikel yang akan kontak

dengan cairan penyari.

D. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

Dalam pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah, pada penelitian ini

digunakan etanol sebagai cairan penyari. Pemilihan etanol sebagai cairan penyari

didasarkan pada kandungan senyawa di dalam daun sirih merah yaitu flavonoid,

(42)

Keuntungan lain dari penggunaan etanol adalah mikroorganisme sulit tumbuh

sehingga terjadinya kontaminasi dapat dicegah selain itu panas yang diperlukan

pada proses pemekatan ekstrak lebih sedikit.

Maserasi dipilih sebagai metode pembuatan ekstrak daun sirih merah

karena prosesnya yang sederhana sehingga mudah dilakukan dan cepat. Pada

proses ekstraksi dengan metode maserasi tidak digunakan panas, hal ini sangat

menguntungkan karena dapat menghindari penguapan minyak atsiri dan

kerusakan senyawa tidak tahan panas yang terkandung pada daun sirih merah.

Untuk menghindari penguapan baik senyawa yang mudah menguap seperti

minyak atsiri maupun cairan penyari maka digunakan bejana tertutup. Keadaan

tertutup juga dimaksudkan agar tidak terjadi kontaminasi dari luar serta

pencegahan reaksi oksidasi karena ekstrak mengalami kontak dengan oksigen

yang terkandung di udara.

Pada saat terjadi kontak antara cairan penyari dan serbuk simplisia maka

cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif

di dalam sel dan di luar sel sehingga larutan yang terpekat akan didesak keluar.

Proses maserasi dihentikan pada saat terjadi keseimbangan konsentrasi antara

larutan di luar sel dan di dalam sel. Proses pengocokan selama maserasi

dimaksudkan agar cairan penyari dapat masuk pada bagian dalam serbuk simplisia

(43)

E. Sterilisasi Alat

Proses diawali dengan pencucian menggunakan deterjen dan dibilas di

bawah air mengalir agar pengotor dan kontaminan (sebagai contoh adalah debu

dan sisa – sisa bahan kimia) yang menempel pada alat – alat yang akan digunakan

dalam penelitian dapat dihilangkan sehingga tidak mengganggu proses dan hasil

penelitian. Sterilisasi dilakukan menggunakan autoklaf dengan prinsip penetrasi

uap air panas ke dalam sel mikroorganisme. Keadaan ini mengakibatkan

terjadinya koagulasi dan denaturasi protein mikroorganisme yang pada akhirnya

mengakibatkan kematian mikroorganisme. Metode ini menguntungkan karena

proses sterilisasi yang dilakukan relatif cepat, mempunyai daya tembus dan

menghasilkan kelembapan yang tinggi.

F. Pembuatan Medium Pencuci dan Penumbuh

Medium pencuci yang digunakan dalam penelitian ini adalah RPMI 1640

yang kemudian ditambahkan bahan buffer yaitu natrium bikarbonat dan hepes.

Untuk medium penumbuh sel Raji digunakan complete medium atau disebut

dengan RPMI 1640 – serum. Komposisi dari medium ini antara lain FBS (Foetal

Bovine Serum) yang merupakan serum berisi kandungan nutrisi yang diperlukan

dalam pertumbuhan sel, penisilin – streptomisin sebagai antibiotik berfungsi

mencegah tumbuhnya bakteri dan fungison sebagai antifungi untuk mencegah

pertumbuhan jamur. Bentuk sterilisasi yang dilakukan pada pembuatan medium

pencuci dan medium penumbuh adalah filtrasi dengan menggunakan suatu

membran filter berdiameter 0,22 μm. Penggunaan diameter pori membran yang

(44)

mungkin mengkontaminasi selama proses pembuatan medium berlangsung.

Dengan suatu sistem yang terkendali maka pertumbuhan sel dapat dikontrol

sehingga permasalahan seperti kematian sel dan kontaminasi dapat dihindari.

G. Preparasi Kultur Sel Raji

Proses preparasi meliputi propagasi dan pemanenan sel Raji. Propagasi

dilakukan dengan mengambil sel Raji dari tangki nitrogen cair dalam keadaan

beku sehingga tidak merubah kondisi sel dari bentuk aslinya. Sesaat setelah

pencairan, ampul disemprot dengan etanol sehingga kontaminasi dari luar dapat

dicegah. Pencucian sel dilakukan dengan memindahkan sel Raji ke dalam medium

RPMI kemudian disentrifugasi, proses ini dilakukan berulang untuk

menyesuaikan sel Raji terhadap medium penumbuh. Sel Raji ditumbuhkan dengan

medium penumbuh dalam inkubator pada suhu 37 °C untuk mengkondisikan

seperti keadaan sel di dalam tubuh manusia.

Pemanenan sel Raji dilakukan pada saat keadaan konfluen tercapai, yaitu

kondisi dimana populasi sel menempati seluruh atau hampir seluruh permukaan

medium penumbuh. Untuk memastikan keadaan sel maka dilakukan pengamatan

di bawah mikroskop inversi terhadap sel Raji yang telah diresuspensi. Dari hasil

pengamatan sel menggunakan mikroskop inversi menunjukkan penampakan

morfologi sel Raji berupa sel berbentuk lingkaran, terdapat sel yang tunggal

maupun menggerombol, tidak melekat pada dinding flask dan melayang pada

medium penumbuh. Sel Raji kemudian ditempatkan dalam medium RPMI yang

baru dan diresuspensikan menggunakan pipet pasteur sehingga sel terlepas antara

(45)

pemisahan antar sel dan memperoleh pelet sel yang terpisah dari medium. Pelet

sel yang diperoleh disuspensikan kedalam medium penumbuh untuk selanjutnya

dihitung konsentrasi sel pada suspensi menggunakan haemocytometer.

H. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

Pengujian sitotoksisitas dalam penelitian ini tidak menggunakan metode

MTT karena ekstrak etanolik daun sirih merah berwarna coklat tua yang ikut

memberikan serapan sehingga dapat mempengaruhi hasil pengukuran absorbansi

menggunakan ELISA reader. Metode uji sitotoksisitas yang dipilih adalah

menggunakan metode direct counting yaitu perhitungan sel secara langsung di

bawah mikroskop dengan menggunakan bantuan haemocytometer. Sebagai

penanda untuk membedakan sel yang hidup dan sel yang mati digunakan trypan

blue. Zat penanda ini hanya dapat menembus masuk membran sel yang mati

karena pada sel yang telah mati membran sel akan kehilangan integritasnya

sehingga dapat ditembus dan sel berwarna biru tua. Pada saat suspensi sel

diberikan trypan blue, sel yang hidup akan tetap kecil, bulat dan bersinar hal ini

dikarenakan sel yang hidup masih terdapat sitoplasma secara utuh.

i

ii

Gambar 1. Sel Raji yang hidup pada kontrol (i) dan sel Raji yang mati dengan pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah konsentrasi 2000 µg/ml (ii) setelah pemberian trypanblue,

(46)

Dibuat berbagai konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah untuk melihat

respon yang diberikan terhadap kematian sel uji. Pada penelitian ini digunakan

delapan seri konsentrasi ekstrak yaitu 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 dan

2000 µg/ml. Metode direct counting memiliki subyektifitas tinggi oleh karenanya

perhitungan sel dilakukan dengan penetapan sebanyak tiga kali.

Tabel II. Hasil Perhitungan Sel Raji Secara Direct Counting pada perlakuan masing – masing konsentrasi ekstrak etanolik

daun sirih merah setelah inkubasi 24 jam

Penetapan

Kultur sel Raji yang hidup berbentuk hampir bulat sempurna dan

bersinar. Sedangkan pada kultur sel Raji yang mati tampak kusam.

i

ii

Gambar 2. Sel raji yang mati seluruhnya pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 2000 µg/ml (a) ; sel raji hidup (i) dan mati (ii) pada pemberian ekstrak

(47)

Kontrol yang digunakan berupa sel Raji dalam medium penumbuh tanpa

diberikan perlakuan. Fungsi dari kontrol adalah untuk memberikan perbandingkan

antara sel yang diberikan perlakuan dengan kondisi sel tanpa adanya perlakuan.

Gambar 3. Kontrol Pada Perbesaran 100x, tidak terdapat kematian sel Raji

Hasil penelitian menunjukkan semakin besar konsentrasi ekstrak etanolik

daun sirih merah yang diberikan maka semakin besar jumlah kematian sel uji.

Konsentrasi terendah dari ekstrak telah dapat menimbulkan kematian dari sel Raji

dan pada konsentrasi tertinggi mengakibatkan kematian seluruh sel Raji.

0

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250

konsentrasi kadar ekstrak etanolik daun sirih merah (µg/ml)

(48)

Melalui jumlah sel yang diperoleh dari metode direct counting dapat

dilakukan perhitungan terhadap persentase kematian sel Raji. Berdasarkan pada

persentase kematian sel maka dapat diketahui harga probit pada masing – masing

konsentrasi ekstrak.

Tabel III. Persentase kematian sel Raji dan harga probit setelah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah dan inkubasi 24 jam

Penetapan

Untuk mengetahui efek sitotoksisitas dari ekstrak etanolik daun sirih

merah maka dilakukan analisis statistik Anova satu arah. Analisis ini bertujuan

untuk mengetahui apakah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah dalam

berbagai konsentrasi pada sel raji, memiliki perbedaan bermakna terhadap kontrol.

Salah satu syarat yang harus dipenuhi dalam analisis menggunakan Anova satu

arah adalah distribusi data yang diuji adalah normal. Pengujian distribusi data

digunakan metode Kolmogorov-Smirnov. Hasil uji menunjukkan data yang

diperoleh dalam penelitian ini memiliki distribusi normal. Dari uji Anova satu

(49)

kelompok perlakuan berbeda bermakna dengan kontrol, dengan demikian ekstrak

etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap sel Raji.

Potensi sitotoksisitas dari ekstrak digambarkan melalui LC50. Harga LC50

ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji dihitung menggunakan analisis

probit yang merupakan analisis regresi antara log konsentrasi ekstrak terhadap

harga probit dari persentase kematian sel Raji setelah perlakuan pada masing -

masing konsentrasi ekstrak.

Gambar 5. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan I

Untuk penetapan I diperoleh hubungan yang linier (r hitung > r tabel) antara

log konsentrasi ekstrak terhadap nilai probit dari persentase kematian sel Raji

setelah perlakuan dan inkubasi 24 jam. Pada perhitungan diperoleh nilai r sebesar

(50)

Gambar 6. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan II

Pada penetapan II diperoleh hubungan yang linier (r hitung > r tabel) antara

log konsentrasi ekstrak terhadap nilai probit dari persentase kematian sel Raji.

Dari perhitungan diperoleh nilai r sebesar 0,968 sedangkan nilai r pada tabel

untuk taraf kepercayaan 95% adalah 0,811.

(51)

Pada penetapan III juga diperoleh hubungan yang linier (r hitung > r tabel)

antara log konsentrasi ekstrak terhadap nilai probit dari persentase kematian sel

Raji. Untuk perhitungan diperoleh nilai r sebesar 0,962 sedangkan nilai r pada

tabel untuk taraf kepercayaan 95% adalah 0,811.

Melalui analisis probit yang dilakukan pada tiap penetapan maka

didapatkan harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji sebesar

395,5 µg/ml. Menurut NCI (National Cancer Institute) suatu bahan dapat

dikatakan berpotensi sitotoksik apabila memiliki nilai LC50 < 1000 µg/ml, dengan

demikian ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel Raji

dan berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut.

Ekstrak etanolik daun sirih merah juga memberikan efek sitotoksik

terhadap kultur sel kanker yang lain seperti pada sel SiHa yaitu sel kanker serviks

dengan nilai LC50 sebesar 200,6 µg/ml (Nur’aniyah, 2008), terhadap kultur sel

Mieloma yaitu sel kanker sumsum tulang dengan nilai LC50 sebesar 434,1 µg/ml

(Meri, 2008), terhadap kultur sel T47D yaitu sel kanker payudara dengan nilai

LC50 sebesar 587,7 µg/ml (Neritika, 2008) dan terhadap kultur sel Hela yaitu sel

kanker serviks dengan nilai LC50 yang dihasilkan sebesar 1143,1 µg/ml

(Atmaningsih, 2008). Perbedaan nilai LC50 pada masing – masing sel kanker

dikarenakan perbedaan karakteristik dari sel. Selain itu dimungkinkan terdapat

perbedaan reseptor pada masing – masing sel yang dapat berikatan dengan

(52)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat ditarik dari penelitian ini adalah ekstrak etanolik

daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel Raji dengan harga LC50

sebesar 395,5 µg/ml.

B. Saran

Saran yang dapat dikemukakan dari penelitian ini adalah :

1. Perlu dilakukan uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap

kultur sel normal.

2. Dilakukan pengujian sitotoksisitas terhadap fraksi dari daun sirih merah.

(53)

DAFTAR PUSTAKA

Adamo, D., 2006, Diet Sehat Golongan Darah untuk Mencegah dan Mengobati Kanker, 26-27, PT Bhuana Ilmu Populer Kelompok Gramedia, Jakarta

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 17, 25-26, Direktorat POM, Jakarta

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan pertama, 1 – 38, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2007a, Piper ornatum, http://toptropicals.com/catalog/uid/Piper_ornatum.htm, diakses tanggal 10 Mei 2008

Anonim, 2007b, Kanker, http://id.wikipedia.org/wiki/Kanker diakses tanggal 7 September 2007

Anonim, 2007c, Position Statement of the ZKBS on Risk Assessment of the Recipient Cell Lines COS, 239 and Raji, BVL, http://www.bvl.bund.de/nn_1115098/EN/06__Genetic__Engineering/ZK BS/01__Allg__Stellungnahmen/05__zellbiologischeThemen/COS-293-Raji.html diakses tanggal 10 September 2007

Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Hela, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Backer, C. A., and Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I dan II, N. V. Noordhoff, Graningen

Dalimartha, S., 2006, Ramuan Obat Tradisional untuk Pengobatan Kanker, 1, 5, 7, Penebar Swadaya, Jakarta

De Muth, J.E., 1999, Basic Statistics and Pharmaceutical Statistical Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., New York

Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research, 12 -16, 47-50, 402 – 415 John Willey and Sons Ltd, New York

Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-73, IRL Press, Washington DC

(54)

Freshney, R.I., 2000, Culture of Animal Cells, A manual of Basic Technique, 4th Edition, 71-73, 309 – 312, 337 – 339, A John Wiley & Sons Inc, New York

Hagman, D.E., 2005, Sterilization, th, Beringer, Paul., Remington The Science and Practice of Pharmacy, 21th edition, 776 – 781, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.

Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York.

King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2ndedition, 79 – 80, School of Biological Sciences, University of Surrey, England

Meri, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Mieloma, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Miller, R. E., Rausher, M. D., and Manos, P. S., 1999, Phylogenetic systematics of Ipomoea (Convolvulaceae) based on ITS and waxysequences, Syst Bot, 24:209-227

Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi Dan Biologi, 157, Ghalia Indonesia,Jakarta

Mutschler, E., 1999, Dinamika Obat, Edisi 5, 701 – 702, Penerbit ITB, Bandung

Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Imunosupresan, Farmakologi dan Terapi, 687 – 689, Fakultas Kedokteran UI, Jakarta

Neritika, Kartina., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

(Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Nur’aniyah, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Roberts, F.M., and Wink, M., 1998, Alkaloid: Biochemistry, Ecology and Medicinal Aplications, 312 – 314, Plenum Press, New York

(55)

Schneider, 1997, Cancer Genetics, Encyclopedia of Human Biology, 2nd ed., Academic Press, New York

Sofyan, R., 2000, Terapi Kanker Pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia Kedokteran, No. 127, 5 - 10

Sudewo, B., 2006, Basmi Penyakit Dengan Sirih Merah, 22, 35 – 36, 40 – 45, 66 – 71, Agromedia Pustaka, Yogyakarta

Sukardiman., Hadi P., dan Aty W., 2003, Penapisan Antikanker dari Tanaman Obat Indonesia dengan Molekul Target Enzim DNA Topoisomerase,

Majalah Farmasi Airlangga, Vol.III, No.3, 93 – 95

Tambunan, G.W., 2003, Diagnosis dan Tatalaksana Sepuluh Jenis Kanker Terbanyak di Indonesia, 67 – 84, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta

Voigt, Rudolf., 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, 551, 565 – 566, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Wolf, J.B., 2007, Tissue Culture Methods,

(56)

Lampiran 1. Hasil Determinasi

(57)

Lampiran 2. Peralatan dan Bahan yang Digunakan dalam Penelitian

Gambar 8. Tanaman Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

Gambar 9. 96 well Plate dan conical steril

(58)

Gambar 11. Laminar air flow

Gambar 12. Haemocytometer dan cell counter

(59)

Lampiran 3. Sel Raji setelah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah pada inkubasi 24 jam dengan perbesaran 100x

Gambar 14. Sel raji yang mati dengan pemberian kadar ekstrak 1750 µg/ml

i

ii

Gambar 15. Sel raji yang hidup (i) dan mati (ii) dengan kadar ekstrak 1500 µg/ml

ii i

(60)

ii

i

ii i

i

ii

(61)

Lampiran 4. Tabel Probit

Tabel IV. Harga Probit Sesuai dengan Prosentasenya

Probit Prosentase

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66

10 3,72 3.77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12

20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45

30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,39 4,72

ss40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97

50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23

60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50

70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81

80 5,34 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23

90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99

7,33 7,37 7,41 7,51 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09

(62)

Lampiran 5. Perhitungan LC50 Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah terhadap Sel Raji Menggunakan Analisis Probit

Kontrol Sel Raji

Penetapan

Keterangan: x = jumlah sel hasil perhitungan langsung pada haemocytometer

4 = jumlah bilik dalam haemocytometer

10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer (µl)

200 = jumlah volume total (µl)

Penetapan I = 10 200

Konsentrasi sel pada kontrol adalah 37.833/200 µl

PENETAPAN I

Jumlah sel Raji yang hidup/ sumuran : 10 200

(63)

Konsentrasi 750 µg/ml = 10 200 4

25_× _×

= 12.500 sel/sumuran

17 ×

× = 8.500 sel/sumuran

9 ×

5_× _×

= 2.500 sel/sumuran

0 ×

× = 0 sel/sumuran

0_× _×

= 0 sel/sumuran

Persen Kematian Sel Raji = 100%

A ×

Β − Α

Keterangan : A = jumlah sel hidup pada sumuran kontrol

B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan

(64)

Sel No

Konsentrasi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

(µg/ml) Hidup Mati

Log konsentrasi ekstrak vs harga probit

Dengan menggunakan regresi linier diperoleh nilai :

A = - 0,56218; B = 2,15849

r = 0,97118; n = 6

persamaan yang didapatkan : y = 2,15849x – 0,56218

y= nilai probit 50Æ 5 = 2,15849x – 0,56218

X= 2,57688

PENETAPAN II

(65)

18_× _×

= 9.000 sel/sumuran

10 ×

6 ×

0_× _×

= 0 sel/sumuran

0 ×

× = 0 sel/sumuran

A ×

Β − Α

(66)

Konsentrasi 1500 µg/ml = 100% Daun Sirih Merah

(µg/ml) Hidup Mati

(67)

PENETAPAN III

4× ×

18 ×

11_× _×

= 5.500 sel/sumuran

5 ×

0 ×

× = 0 sel/sumuran

0_× _×

= 0 sel/sumuran

A ×

Β − Α

(68)

Konsentrasi 1500 µg/ml = 100% Daun Sirih Merah

(µg/ml) Hidup Mati

(69)

Lampiran 6. Perhitungan nilai korelasi LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji pada taraf kepercayaan 95%

Tabel V. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1%

Degrees of Freedom

(DF) 5% 1%

Korelasi pada masing – masing penetapan :

Penetapan 1 :

r2 = 0,94319 r = 0,97118 [rtabel (95%, 4) = 0,811]

--- rhitung > rtabel, sehingga korelasinya linier ---

(70)

Lampiran 7. Tes Distribusi Normal dengan Menggunakan Metode Kolmogorov-Smirnov

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

SELHIDUP

N ₂₇

Mean 11925,9259

Normal Parameters(a,b)

Std. Deviation 12018,17830

Absolute ,161

Positive ,152

Most Extreme Differences

Negative -,161

Kolmogorov-Smirnov Z ,834

Asymp. Sig. (2-tailed) ,490

a Test distribution is Normal. b Calculated from data.

Lampiran 8. Analisis Statistik Anova Satu Arah

Oneway

ANOVA

SELHIDUP

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 3753518518,519 8 469189814,815 4606,591 ,000

Within Groups 1833333,333 18 101851,852

(71)

BIOGRAFI PENULIS

Penulis yang bernama lengkap Eva Dwi

Kusumaningtyas lahir di Rembang pada tanggal 22

Agustus 1986. Penulis merupakan anak kedua dari

pasangan Bapak Stefanus Darjatmo dan Ibu

Purwahyuni. Tahun 1990 hingga 1992 menempuh

pendidikan taman kanak-kanak di TK Pertiwi I

Mojosongo, Boyolali. Tahun 1992 hingga 1998

menempuh pendidikan sekolah dasar di SD Kanisius

Boyolali, dilanjutkan dengan menempuh pendidikan

pada tahun 1998 hingga 2001 di SLTP Negeri I Boyolali. Tahun 2001 hingga

2004 menempuh pendidikan di SMU Negeri I Boyolali. Tahun 2004 melanjutkan