Analisis Polimorfisme Pro12Ala Gen Ppar-γ2 pada Penderita Diabetes Mellitus TIPE 2 Etnis Minangkabau - Universitas Negeri Padang Repository

(1)

Prosiding Seminar Nasional Kimia dan Pendidikan Kimia HKI Cabang Sumbar, Padang, 7 Desember 2013 ISBN. 978-602-17878-2-3

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7)

(8)

295

ANALISIS POLIMORFISME Pro12Ala GEN PPAR-

γ2 PADA

PENDERITA DIABETES MELLITUS TIPE 2 ETNIS

MINANGKABAU

Yuni Ahda#_{, Dewi Rahma Putri,}_{Elsa Yuniarti}

Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Padang

#_{Email: ahdayuni@yahoo.com}

Abstract. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui frekuensi polimorfisme Pro12Ala gen

PPAR-2 pada pasien Diabetes mellitus tipe-2 (DM Tipe-2) dan orang normal (bukan penderita) etnis Minangkabau. Penelitian dilaksanakan dari bulan Maret – Desember 2012 di Rumah Sakit Umum Pusat Dr. M Jamil Padang dan laboratorium Bioteknologi Jurusan Biologi FMIPA UNP. Deteksi polimorfisme Pro12 Ala dilakukan terhadap 29 pasien DM Tipe-2 dan 31 orang normal menggunakan metoda PCR-RFLP. Enzim restriksi yang digunakan adalah BstUI. Frekuensi polimorfisme Pro12Ala dianalisis dengan Chi-square dan analisis parameter klinik pada pasien dilakukan menggunakan Anova 1 arah. Hasil penelitian menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada frekuensi polimorfisme Pro12 Ala antara pasien DM tipe 2 dan orang normal. Hasil penelitian juga menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada parameter klinik dari pasien DM tipe 2 yang dikelompokkan berdasarkan alelnya. Dari penelitian ini disimpulkan bahwa polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 tidak berkontribusi terhadap kemunculan penyakit DM Tipe-2 pada etnis Minangkabau.

Keywords: DM Tipe-2, Gen PPAR-γ2, Polimorfisme Pro12Ala

1. Pendahuluan

Diabetes mellitus (DM) didefinisikan sebagai suatu penyakit metabolik yang mempunyai ciri ditemukannya kadar glukosa darah yang tinggi (hiperglikemia) akibat adanya gangguan dalam

sekresi insulin oleh sel β pankreas atau gangguan kerja insulin pada jaringan target[17]. _{Salah satu}

variasi dari diabetes mellitus adalah DM tipe 2, yang kejadiannya lebih dari 90% dari populasi diabetes [18]_.

Diabetes mellitus (DM) merupakan penyakit tidak menular yang prevalensinya meningkat dari tahun ke tahun. Menurut World Health Organization (WHO), kejadian DM tipe 2 saat ini dapat dikelompokkan sebagai epidemik noninfeksi. Jumlah pasien DM tipe 2 meningkat dua kali lipat setiap 12–15 tahun, dan pada tahun 2025 diperkirakan sebanyak 300 juta orang di seluruh dunia akan menderita penyakit DM tipe 2. Jumlah penderita DM tipe 2 di Indonesia menempati posisi keempat teratas setelah India, Cina, dan Amerika Serikat[14]_{. Selanjutnya di Indonesia sendiri,}

WHO memprediksikan kenaikan jumlah pasien DM tipe 2 dari 8,4 juta pada tahun 2000 menjadi sekitar 21,3 juta pada tahun 2030[9]_{. Berdasarkan Riset Kesehatan Dasar (RISKESDAS) pada}

tahun 2007, prevalensi nasional penyakit DM tipe 2 adalah 1,1%. Sementara itu Provinsi Sumatera Barat merupakan salah satu dari 17 provinsi yang memiliki prevalensi diatas prevalensi nasional menderita penyakit DM tipe 2[13]_{.. Beberapa faktor penyebab DM tipe 2 adalah faktor}

usia, asupan karbohidrat yang tinggi, kurangnya aktivitas fisik, gaya hidup (merokok, minum alkohol) dan faktor genetik[4][20]_.

Kebiasaan masyarakat di Sumatera Barat yang terkenal dengan pengonsumsi makanan yang tinggi karbohidrat dan lemak dapat memicu terjadinya kegemukan, dapat berisiko menderita penyakit DM tipe 2[5]_{. Salah satu gen yang diduga menyebabkan DM tipe 2 adalah gen PPAR-}γ2.

Gen PPAR-γ2 merupakan faktor transkripsi yang berfungsi meningkatkan kepekaan sekelompok reseptor fungsional untuk hormon insulin[15]_{. Ada beberapa polimorfisme pada gen PPAR-}γ2, tetapi

(9)

296

C menjadi G pada nukleotida 34 kodon inisiasi translasi pada ekson B yang merubah asam amino prolin kodon ke-12 menjadi alanin[17]_._{Penelitian yang dilakukan dibanyak negara menununjukkan}

adanya variasi dalam polimofisme serta perbedaan hasil yang diperoleh di setiap etnis yang diteliti[12]_{. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan frekuensi}

polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 antara penderita DM tipe 2 dengan kontrol pada etnis Minangkabau, serta mengetahui hubungan polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 dengan parameter klinik penderita DM tipe 2 etnis Minangkabau.

2. Metode Penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian deskriptif dengan melibatkan 29 orang sampel penderita DM tipe 2 dan 31 orang bukan penderita (kontrol). Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2012 – Desember 2012 di Rumah Sakit Umum Pusat (RSUP) Dr. M. Djamil Padang dan laboratorium Bioteknologi FMIPA UNP. Pengambilan sampel pasien DM tipe 2 dilakukan oleh pihak Rumah Sakit dan pasien dinyatakan menderita DM tipe 2 bila: Kadar glokusa darah puasa

≥ 126 mg/dL, kadar gula darah dua jam pada TTGO ≥ 200 mg/dL, resistensi insulin, menderita

diabetes mellitus setelah berumur ≥ 40 tahun dan mengalami obesitas abdominal. Pengambilan

sampel kontrol dilakukan di lingkungan kampus oleh analis kesehatan. Sampel dikumpulkan sebanyak 31 sampel, Kriteria kontrol berdasarkan tidak terdapatnya riwayat diabetes mellitus pada donor untuk dua generasi sebelumnya.

Pelaksanaan dimulai dari isolasi DNA genom, DNA genom diisolasi dari 3 mL darah penderita dan kontrol menggunakan Wizard DNA genomic purification kit (Promega) mengikuti prosedur standar. Tahap PCR digunakan untuk mengamplifikasi gen PPAR-γ2 . PCR dilakukan dalam mesin PCR Whatman Biometra type T personal (Germany) dengan pasangan primer yang digunakan untuk polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 berdasarkan Susumiarsih (2005), adalah:

F:5’-GCC AAT TCA AGC CCA GTC-3’ dan R:5’-GAT ATG TTT GCA GAC AGT GTA TCA GTG AAG G-AA TCG CTT TCC G-3’. Amplifikasi dilakukan sebanyak 35 siklus, dengan rincian tahap denaturasi awal (siklus 1) dengan suhu 950_{C selama 4 menit, denaturasi (siklus 2}–_{35) dengan}

suhu 950_{C selama 1 menit, annealing dengan suhu 55}0_{C selama 0,5 menit, elongasi dengan suhu}

720_{C selama 1 menit dan elongasi tambahan (akhir siklus 35) dengan suhu 72}0_{C selama 10 menit.}

Produk PCR dielektroforesis dengan gel elektroforesis 1% selama 25 menit dengan voltase 100 V. Hasil elektroforesis selanjutnya dicek dengan UV illuminator.

Untuk deteksi adanya polimorfisme, fragmen DNA hasil amplifikasi dipotong dengan menggunakan enzim restriksi yaitu enzim BstUI. Produk PCR diambil sebanyak 8 µL kemudian ditambahkan dengan 1 µL enzim BstUI. Campuran diinkubasi selama 120 menit pada suhu 370_C,

kemudian dielektroforesis dalam gel agarosa 2%. Hasil elektroforesis selanjutnya divisualisasi dengan UV illuminator dan didokumentasi dengan gel documentation.

Data diolah secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kualitatif dengan melihat kehadiran polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 pada gel elektroforesis dan secara kuantitatif melihat ada tidaknya perbedaan frekuensi polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 pada penderita DM tipe 2 dengan kontrol menggunakan uji Chi Square dan analisis hubungan parameter klinik penderita DM tipe 2 dengan ANOVA satu arah.

3. Hasil dan Pembahasan

(10)

297

Gambar 2. Hasil Visualisasi Produk PCR Gen PPAR-γ2; Marker DNA Ladder 100 bp (M), Fragmen DNA berukuran 270 bp (1-10)

Hasil visualisasi elektroforesis produk PCR pada Gambar 2 memperlihatkan DNA teramplifikasi dengan menghasilkan fragmen DNA berukuran 270 bp. Panjang fragmen dapat dilihat dengan membandingkan panjang fragmen DNA pada marker Ladder 100 bp dengan hasil visualisasi elektroforesis. Hal ini sesuai dengan yang diharapkan karena fragmen terletak pada daerah amplifikasi.

Pemotongan (restriksi) gen PPAR-γ2 fragmen DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi BstUI. Hasil digesti (restriksi) kemudian dipisahkan secara elektroforesis dengan menggunakan gel agarosa 2% pada tegangan 100 Volt selama 25 menit.

Gambar 3. Hasil visualisasi pada sampel penderita DM Tipe 2, Marker DNA Ladder 100 bp (M), homozigot Pro/Pro (1-7, 9-12), heterozigot Pro/Ala (8), fragmen kecil 43 bp tidak terdeteksi jelas pada gel.

Hasil visualisasi menggunakan gel elektroforesis 2% menunjukkan tiga macam fragmen yang memiliki ukuran yang berbeda yaitu 270 bp, 227 bp dan 43 bp. Wild type (Pro/Pro) memiliki satu fragmen DNA berukuran 270 bp, homozigot (Ala/Ala) memiliki dua fragmen DNA berukuran

(11)

298

227 bp dan 43 bp dan heterozigot (Pro/Ala) memiliki tiga fragmen DNA berukuran 270 bp, 227 bp dan 43 bp.

Frekuensi polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 di antara penderita DM tipe 2 dan kontrol yang dilakukan terhadap seluruh sampel yang dikerjakan (29 orang penderita dan 31 orang kontrol), didapatkan individu dengan genotip Pro/Pro, Ala/Ala, dan Pro/Ala. Dari 29 orang sampel penderita DM tipe 2, diperoleh 27 orang bergenotip Pro/Pro (frekuensi 93,1%), 1 orang bergenotip Ala/Ala (frekuensi 3,45%) dan 1 orang bergenotip Pro/Ala (frekuensi 3,45%). Dari 31 sampel kontrol, didapatkan 27 orang bergenotip Pro/Pro (frekuensi 87,1%), 2 orang bergenotip Ala/Ala (frekuensi 6,45%) dan 2 orang bergenotip Pro/Ala (frekuensi 6,45%). Keterangan selengkapnya dapat dilihat pada Tabel 1 berikut.

Tabel 1. Frekuensi Genotip dan Alel Gen PPAR-γ2

χ2_{=0,6004; P>0,05; tidak bermakna secara statistik}

Berdasarkan hasil analisis frekuensi genotip dan alel pada Tabel 1 di atas, pada penderita DM tipe 2 didapatkan frekuensi alel Pro adalah 0,948 dan frekuensi alel Ala adalah 0,0517, sedangkan pada sampel kontrol didapatkan frekuensi alel Pro adalah 0,903 dan frekuensi alel Ala adalah 0,0967. Jika dibandingkan, frekuensi alel Ala dari kedua sampel tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan, begitu juga dengan frekuensi alel Pro dari kedua sampel tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan. Dengan demikian, alel Ala dan Pro tidak berperan pada kemunculan DM tipe 2 di etnis Minangkabau. Hubungan polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 dengan parameter klinik penderita DM tipe 2 etnis Minangkabau diperoleh dengan mengamati beberapa parameter klinik yang diperiksa, seperti terlihat pada Tabel 2 berikut.

Tabel 2. Analisis Parameter Klinik Gen PPAR-γ2 Penderita DM Tipe 2 Etnis Minangkabau

M=Mean, SEM=Standard Error of Mean, HDL= High Density Lipoprotein (mg/dL), LDL= Low

Parameter Klinik Pro/Pro Ala/Ala Pro/Ala Nilai P

(12)

299

Dari hasil analisis parameter klinik penderita DM tipe 2 pada Tabel 2 di atas, salah satu parameter klinik yang diuji yaitu gula darah puasa (GDP) tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara ketiga genotip. Pada genotip Pro/Pro memiliki rerata 158,78 ± 12,97 mg/dL, genotip Ala/Ala (158,00 mg/dL) dan genotip Pro/Ala (122,00 mg/dL), ini terlihat dari nilai P yang diperoleh (p>0,05). Begitu juga dengan beberapa parameter lainnya seperti gula darah 2 jam pp (GDR), HDL, LDL, kolesterol total dan trigliserida, tidak menunjukkan perbedaan secara signifikan antara ketiga genotip. Dengan demikian frekuensi polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 tidak berperan dalam kemunculan DM tipe 2 di etnis Minangkabau.

Berdasarkan hasil analisis frekuensi polimorfisme, tidak terdapat perbedaan yang signifikan dalam frekuensi alel Ala antara penderita DM tipe 2 dan kontrol (0,0517 dan 0,0967). Begitu juga dengan frekuensi alel Pro (0,948 dan 0,903) tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kedua sampel. Hasil yang sama juga telah dipelajari pada populasi Kaukasia[21]_,

dan umumnya pada populasi Indonesia[17]_{. Namun hasil ini masih sangat bervariasi di beberapa}

etnis di dunia. Sebagian besar telah menemukan frekuensi alel Ala secara signifikan lebih rendah pada kelompok DM tipe 2 daripada kontrol, yang dilakukan pada populasi Kaukasia[1]_{, populasi}

Gujarat[19]_{dan Jepang}[6].

Sebagian besar penelitian menemukan bahwa alel Ala memiliki risiko rendah terhadap DM tipe 2 dan resistensi insulin, sedangkan alel Pro dikaitkan dengan penurunan sensitivitas insulin dan meningkatkan kejadian DM tipe 2[1] [3] [16] [19]_{. Hasil yang bertentangan ditemukan oleh Radha}

pada populasi Asia Selatan dan Kaukasia. Radha menemukan bahwa alel Pro yang berisiko rendah terhadap DM tipe 2 di Asia Selatan walaupun frekuensi alel Ala yang diperoleh tinggi pada populasi tersebut, tetapi pada populasi Kaukasia polimorfisme ini tidak meningkatkan sensitivitas insulin ataupun menurunkan risiko terkena DM tipe 2[12]_{. Selain itu Mori menemukan bahwa varian Ala}

dikaitkan dengan mengurangi risiko perkembangan diabetes pada populasi umumnya, tetapi juga dapat menjadi faktor risiko untuk defisiensi insulin dan keparahan penyakit pada individu dengan DM tipe 2[6]_.

Berdasarkan hasil analisis hubungan parameter klinik penderita DM tipe 2 yang diuji, memperlihatkan tidak terdapat hubungan yang bermakna secara statistik, baik itu umur (tahun), berat badan (Kg), gula darah puasa (mg/dL), HDL (mg/dL), LDL (mg/dL), gula darah 2 jam pp (mg/dL), kolesterol total (mg/dL), maupun trigliserida (mg/dL). Hal yang sama juga dikemukan oleh Pinterova pada populasi Republik Ceko[10]_.

Dalam hal IMT (Index Massa Tubuh), [1] [15] _{menemukan tidak ada hubungan antara}

polimorfisme Pro12Ala gen PPARγ2. Hal yang bertentangan dikemukakan oleh Passaro,

menyatakan bahwa alel Ala menunjukkan IMT dan lemak tubuh yang lebih tinggi dibandingkan dengan homozigot Pro/Pro. Passaro menemukan secara signifikan IMT dan lemak tubuh lebih tinggi terlihat pada wanita, bukan pria[8]_{. Hal ini berbeda dengan yang dilaporkan oleh Morini}

dalam populasi yang dilatarbelakangi oleh genetik yang sama. Morini menyatakan tidak bisa mengecualikan kurangnya hubungan tersebut pada pria, mungkin ini disebabkan kurangnya jumlah pria sehingga kurangnya dalam ukuran statistik[7]_.

Kesimpulan dan Saran

Secara statistik tidak terdapat perbedaan frekuensi polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 antara penderita DM tipe 2 dan kontrol pada etnis Minangkabau. Berdasarkan analisis parameter klinik, polimorfisme Pro12Ala tidak berperan dalam kemunculan DM tipe 2 pada etnis Minangkabau.

Perlunya penelitian lebih lanjut dengan cakupan penelitian yang lebih besar mengenai perbedaan frekuensi polimorfisme Pro12Ala gen PPAR-γ2 agar hasil yang didapatkan lebih valid dan dengan parameter yang lebih beragam guna memberikan informasi yang dapat dimanfaatkan dalam usaha mengurangi prevalensi DM tipe 2.

Ucapan Terima Kasih

Terima kasih kepada Lembaga Penelitian UNP yang telah mendanai penelitian ini melalui dana DIPA UNP pada pelaksanaan penelitian Hibah Bersaing Tahun Anggaran 2012.

(13)

300

[1]_{Altshuler, D., Hirschhorn, J.N., Klannemark, M., Lindgren, C.M., Vohl, M.C., Nemash, J., Lane,}

C.R., Schaffner, S.F., Bolk, S., Brewer, C., Toumi, T., Gaudet, D., Hudson, T.J., Daly, M.,

Groop, I and Lander, E.S. 2000. The common PPAR γ Pro12Ala polymorphism is associated

with decreased risk of type 2 diabetes. Nat Genet., Vol 26, pp. 76-80

[2]_{Argmann, C.A, T.-}A. Cock, and J. Auwerx. 2005. Peroxisome proliferator activated receptor γ: the

more the merrier ?. European Journal of Clinical Investigation,35, 82-92

[3]_{Frederiksen, L., Brodbaek, K., Fenger, M., Jorgensen, T., Johnsesn, K.B., Madsbad, S and}

Urhammer, S.A. 2002. Studies of the Pro12Ala polymorphism of the PPAR-γ gene in the Danish MONICA Cohort: homozygosity of the Ala allela conferse a decreased risk of the insulin resistance syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism., Vol 87, pp. 3989-3992

[4]Lin, C.C., Li, C.I., Liu, C.S., Lin, W.Y., Fuh, M.M.T., Yang, S.Y., Lee, C.C., Li, T.C. 2012. “Impact

of lifestyle-related factors on all-cause and cause-specificmortality in patientswith type 2

diabetes the taichung diabetes study”. Diabetes Care., Vol 35, pp. 105 – 112

[5]_{Liputo, N.I., Rosalina L., Sulastri D. 2002.} _{Pemberian Diet Minangkabau Tinggi Sumber}

Antioksidan dapat menurunkan Tekanan Darah. Padang: FK Universitas Andalas

[6]_{Mori, H., Ikegami, H., Kawaguchi, Y., Seino, S., Yokoi, N., Takeda, J., Inoue, I.,}_{et al.}_2001.

Pro12Ala substitution in PPAR-γ is assosiated with resistent to development of diabetes in the general population. Diabetes 50: 891-894.

[7]_{Morini E, Tassi V, Capponi D, Ludovico O, Dallapiccola B, Trischitta V,}_{et al}_{. Interaction between}

PPARgamma2 variants and gender on the modulation of body weight. Obesity (Silver

Spring) 2008, 16:1467-1470.

[8]_{Passaro, A., Nora, E.D., Marcello, F., Vece, D.V.,}_{et al}. 2011. PPARγ Pro12Ala and ACE ID

polymorphisms are associated with BMI and fat distribution, but not metabolic syndrome.

Cardiovascular Diabetology 2011, 10:112

[9]_{Perkeni. 2006. Konsensus Pengelolaan dan Pencegahan Diabetes Mellitus Tipe 2 Di Indonesia.}

Perkupulan Endokrinologi Indonesia.

[10]_{Pinterova, D., Cerna, M., Kolostova, K.,}_{et al}_{. 2004. The Frequency of alleles of the Pro12Ala}

polymorphism in PPARγ2 Is different between healthy controls and patients with type 2

diabetes. Folia Biologica (Praha) 50, 153-156

[11]_{Promega Coorporation. Promega Life Science Catalog 2008-2009. Madison: Manual Promega,}

2008

[12]_{Radha, V., Vimaleswara, K.S., Babu, H.N.S., Abate, N., Chandalia, M., Sathija, P}_{et al.}_2006.

Role of genetic polymorphism peroxisome proliferator- activated receptor γ2-Pro12Ala on ethnic susceptibility to diabetes in Soult Asia and Caucasion subject. Diabetes Care., Vol 29, pp 1046-1051

[13]_{Riset Kesehatan Dasar (RISKESDAS). 2007. Laporan Kesehatan Nasional 2007. Jakarta: Badan}

Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Departemen Kesehatan, Republik Indonesia

[14]_{Slominsky PA, Pivovarova OV, Shadrina AV et al. 2009. Association of insulinase gene}

polymorphish with type 2 diabetes mellitus in patients from the Moscow population.

Russian Journal of Genetic, Vol. 45 No. 1

[15]_Sokkar_{et al.}_{2009. Role of peroxisome proliferator-activated receptor gamma2 (PPAR-}γ2) gene

(14)

301

[16]_{Soriguer, F., Morcillo, S., Cardona, F., Martinez, G.R., Alzamer, M, Cruz,} _{et al}_{. Pro12Ala}

polymorphism of the PPARG2 gene is associated with type 2 diabetes mellitus and peripheral insulin sensitivity in a population with a high intake of oleic acid. The Journal of Nutrion 136: 2325-2330, 2006

[17]Susmiarsih, T. 2005. Hubungan polimorfisme Pro12Ala gen PPARγ2 terhadap obesitas dan

diabetes mellitus tipe 2 (DMT2). Jurnal Kedokteran Yarsi 13 (3): 313 – 322

[18]_{Syah, M. 2010. Faktor}–_{Faktor yang Berhubungan dengan Penyakit Diabetes Mellitus Tipe 2 di}

Desa Sekip Kecamatan Lubuk Pakam Kabupaten Deli Serdang Tahun 2010. (Skripsi).

[19]_{Vaishnav, Devendra J.}_{et al.}. “Studies on screening of Pro12Ala SNP in PPARγ2 gene among

Gujarat subjects”. AJPTR. 2011: 1(1): 1-6

[20]Wicaksono, Radio Putro. 2011. ”Faktor_{-Faktor yang Berhubungan dengan Kejadian Diabetes}

Mellitus Tipe 2”. Padang : Program Pendidikan sarjana Kedokteran Fakultas Kedokteran

Universitas Diponegoro (Skripsi)

[21]_{Yen CJ, Beamer BA, Negri C, Silver K, Brown KA, Yarnall DP, Burns DK, Roth J, Shuldiner AR.}

Molecular scanning of the human peroxisome proliferator activated receptor gamma gene in diabetic Caucasians: identification of a Pro12Ala PPARgamma 2 missense mutation.