ABSTRACT
Key words : Rhizoctonia mycorrhizal, PCR-RFLP, vanilla
KEKERABATAN ANTAR ISOLAT MIKORIZA RHIZOCTONIA DARI VANILI
BERDASARKAN ANALISIS PCR-RFLP
Haryuni 1, Bambang Hadisutrisno2, Achmadi Priyatmodjo2, Jaka Widada2
PENDAHULUAN
Relationship between the Isolates of Rhizoctonia Mycorrhizal from Vanilla
Based on PCR-RFLP Analysis
1
Mahasiswa Doktoral Fitopatologi Fakultas Pertanian UGM Yogyakarta, Dosen Fakultas Pertanain UTP Surakarta. E-mail: yuni_utp@yahoo.co.id
experiment was carried out at the Laboratory of Agricultural Biotecnology, Gadjah Mada Uni-versity in Yogyakarta and the Research Center of Perum Perhutani Cepu. Object of the experi-ment was to study on the genetic relationship between the isolates of Rhizoctonia
Mycor-Penurunan harga vanili Indonesia di dalam negeri terutama karena vanili Indonesia ditolak di pasaran luar negeri, sehingga buah vanili melimpah. Penolakan ini terutama disebabkan oleh mutu buah vanili rendah karena kekeringan, dan penyakit busuk batang (Hadisutrisno, 2005).
Rhizoctonia spp. yang berperan sebagai mikoriza ditemukan di anggrekan yaitu Rhizoctonia stahlii, R. goodyerae-repentis juga pada Goodyerae repens, dan R. mucoroides, pada Dactylorhiza. Jamur tersebut membantu perkecambahan biji anggrek (Sneh et al., 1991). Keberadaan mikoriza dalam tanah membantu menyediakan unsur hara biji anggrek pada saat proses perkecambahan, terutama kebutuhan unsur fosfor dan nitrogen (Taylor et al., 2004).
Rhizoctonia terdiri atas jamur yang mempunyai simbiosis mutualisme. Pengelompokan dibedakan berdasarkan pada morfologi koloni, karakteristik pertumbuhan, dan patogenisitasnya pada tanaman inang. Anggota Rhizoctonia. berperan sebagai patogen, saprofit, mikoriza, dan Plant Grwoth Promoting Fungi (PGPF) (Sneh et al., 1991; Alexopoulus et al., 1996;
Andersen & Rasmussen, 1996; Priyatmojo et al., 2001; Hyakumachi, 2004).
Diferensiasi miselium mikoriza menjadi struktur infeksi, dan penetrasinya ke tanaman inang dipengaruhi oleh faktor biotik, dan abiotik. Faktor biotik yang penting ialah kemampuan tanaman menghasilkan sinyal-sinyal tertentu sebagai pengenal inang dan tempat infeksi pada akar. Didukung oleh fakta adanya akar tanaman, eksudat akar, suspensi kultur sel, dan produk sel (Anonim, 2007; Nusantara, 2007).
Mikoriza anggrekan membentuk peloton yang berfungsi mensuplai sumber karbon dan nutrien selama perkecambahan biji. Anggrek Corallorhiza maculata mempunyai variasi genetik terhadap berbagai jenis mikoriza (Taylor et al., 2003).
PCR-RFLP merupakan salah satu metode identifikasi kelompok jasad hidup yang akurat dan cepat sehingga lebih mudah diketahui kelompok jasad tersebut. Identifikasi dan karakterisasi molekuler pada Rhizoctonia spp. diharapkan membantu mendapatkan fragmen-fragmen DNA yang lebih spesifik sehingga dapat diketahui hubungan kekerabatannya secara akurat.
The
rhizal from vanilla root based on PCR-RFLP analysis. It was arranged in PCR with pimer of ITS 1 and ITS 4, and RFLP with restriction enzyme of Hinf I, Hae III, Msp I, and Bsrd I. The results suggested that based on the PCR-RFLP analysis, isolate of SR-8 had no relationship to isolate of SR-9 and TMG-2 whereas between the latest isolates were close related.
BAHAN DAN METODE HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini dilakukan pada bulan Juni sampai dengan bulan Oktober 2009 di Laboratorium Bioteknologi Pertanian UGM dan Laboratorium Bioteknologi Pusat Penelitian dan Pengembangan (Puslitbang) Perhutani Cepu.
Isolat mikoriza Rhizoctonia yang berasal dari Kelompok peneliti Fakultas Pertanian UGM dengan kode isolat (SR-8=A, SR-9=B, dan TMG-2=C).
Ekstraksi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan teknik CTAB (Cetyltrimetyl ammonium bromide). Larutan CTAB ditambahkan PVP (Poly Vinil Pyrolidone).
Fragmen DNA pada gel agarose 1,5 % diamati dengan pewarnaan dan dideteksi dengan penyinaran ultraviolet. Panjang gelombang 260 nm - 280 nm, batas kemurnian DNA 1,8-2,0 (Anonim, 1999).
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Pada tahap ini menguji kemampuan dari primer ITS 1 (forward): 5' CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 3' dan ITS 4 B (reverse) : 5' -CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG -3' (Pharmacia Biotech, Sweden) untuk mengamplifikasi bagian DNA ribosomal jamur. Amplifikasi dengan mesin PCR campuran dengan reaksi total dalam volume 20 ?l, kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR (Biorad My Cycler TM Thermal Cycler), hasil PCR dielektroforesis menggunakan gel agarose 1,5% dan marker (DNA Ladder). PCR pada tegangan 100 volt selama 25 menit, kemudian gel diamati bagian fragmen DNA diatas UV transluminator.
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphisms)
Hasil amplifikasi DNA dengan ITS 1 dan ITS 4. Digunakan sebagai cetakan reaksi RFLP dengan enzim restriksi, yaitu Hinf1, HaeIII, MspI, dan Bsrd I (New England Rbiolabs, Beverly, MA, USA) (Sen et al., 1999).
Analisis
Hubungan kekerabatan antarisolat Rhizoctonia didasarkan pada koefisien kesamaan pola fragmen DNA hasil PCR-RFLP dan dendrogram UPGMA-NTSYS (SPSS Inc., Chicago, II, USA)
1. ITS-RFLP dengan Enzim Hae III dan Bsrd I
Gambar 1: Elektroforesis ITS-RFLP dengan enzim Hae III ( isolat A,B, dan C) dan enzim Bsrd I ( isolat A1, B1, dan C1) pada gel agarose 3%, M=Marker berukuran 1 Kb. Isolat A dan A1= SR-8; B dan B1= SR-9; C dan C1=TMG-2
Enzim Hae III
PCR-RFLP dengan enzim Hae III menghasilkan fragmen DNA pada semua isolat berukuran kurang lebih 50 bp sampai kurang lebih 500 bp dengan jumlah 2 fragmen DNA pada masing - masing isolat (Gambar 1). Ketiga isolat A, B, dan C tidak terlihat adanya hubungan kekerabatan dengan pengujian enzim Hae III karena memiliki pola fragmen DNA yang tidak mirip.
Enzim Bsrd I
Elektroforesis hasil RFLP-PCR-ITS dengan menggunakan enzim Bsrd I menunjukan bahwa restriksi produk PCR-ITS menghasilkan satu sampai 2 fragmen DNA pada masing - masing isolat (Gambar 1). Fragmen DNA yang dihasilkan berukuran kurang lebih 250 bp sampai kurang lebih 750 bp.
Hasil elektroforesis ditransformasikan sebagai dasar dendrogram dimana hasil dendrogram menunjukkan hubungan kekerabatan 80% pada isolat B, dan C sedangkan isolat A dengan isolat B, dan C berada pada satu garis lurus (0%) sehingga isolat A tidak ada hubungan kekerabatan dengan isolat B, dan C dengan pengujian enzim Bsrd I. Nilai koefisien 80% pada isolat B memiliki hubungan kekerabatan yang dekat dengan isolat C. Kemampuan enzim Bsrd I mampu membedakan isolat A dengan isolat B, dan C dimana mampu membedakan pada tingkat spesies dan forma spesialis.
2. ITS-RFLP dengan Enzim Msp I dan Hinf I
Gambar 2: Elektroforesis ITS-RFLP dengan enzim Msp I (isolat A, B, dan C) dan enzim Hinf I ( isolatA, B, dan C) pada gel agarose 3%, M=Marker berukuran 1 Kb. Isolat A dan A1= SR-8; B dan B1= SR-9; C dan C1=TMG-2
Enzim Msp I
Elektroforesis hasil RFLP-PCR-ITS dengan menggunakan enzim Msp I menunjukan bahwa restriksi produk PCR-ITS menghasilkan satu atau 2 fragmen DNA pada masing - masing isolat (Gambar 2). Fragmen DNA yang dihasilkan berukuran kurang lebih 50 bp sampai kurang lebih 740 bp.
Hasil elektroforesis ditransformasikan dan digunakan sebagai dasar data dendogram dimana hasil dendogram menunjukkan hubungan kekerabatan 67% pada isolat B, dan C. Kemampuan enzim Msp I mampu
Enzim Hinf I
Hasil dendrogram menunjukkan bahwa isolat A tidak ada hubungan kekerabatan dengan isolat B dan C, sedangkan isolat B dan C mempunyai hubungan kekerabatan 63 %. Fragmen DNA (Gambar 2) berukuran kurang lebih 100 bp sampai kurang lebih 325 bp. membedakan antara isolat A dengan isolat B, dan C dimana mampu membedakan pada tingkat spesies dan forma spesialis. Isolat A dengan isolat B, dan C berada pada satu garis lurus (0%) sehingga dapat diartikan bahwa isolat A tidak ada hubungan kekerabatan dengan isolat B, dan C dengan n enzim Msp I
Analisis Hubungan Kekerabatan Isolat Rhizoctonia spp.
Koefisien Kesamaan 0,10 0,20 0,52 0,63 0,41 B C A
Gambar 3. Dendrogram-UPGMA hubungan kekerabatan tiga isolat mikoriza Rhizoctonia berdasarkan pola fragmen Hubungan kekerabatan berdasarkan hasil ITS-RFLP. dendrogram gabungan berdasarkan hasil analisa NTSYS elektroforesis restriksi daerah ITS dengan 4 enzim Hae III, Bsrd I, Msp I, dan Hinf I dapat dibedakan menjadi dua kelompok (Gambar 3). Kelompok I yaitu isolat A yang memiliki koefisien hubungan kekerabatan 10% dengan isolat B dan C. Kelompok II isolat B, dan C memiliki koefisien kekerabatan sebesar 63%, sehingga antara kelompok I dan kelompok II mempunyai hubungan kekerabatan yang jauh. Nilai koefisien lebih besar dari 95% menunjukkan bahwa isolat tersebut identik, sedangkan nilai koefisien 63-95% menunjukkan tingkat kesamaan yang tinggi atau mirip (Kim et al., 2004).
DAFTAR PUSTAKA
Nilai koefisien kesamaan menunjukkan hubungan kelompok yang memiliki karakterisasi struktur genetik dengan pola fragmen DNA sebagai kontribusi terhadap evolusi adaptasi, bilogi, biokimia, studi ekologi, dan diversifikasi genetik (Cai et al., 2006; Wallace, 2006). Karakterisasi struktur genetik juga telah dilakukan pada galur Ceratorhiza, Ceratobasidium, Thanatephorus, dan Tulasnella yang berperan sebagai mikoriza (Taylor, 2008). Kelompok yang sama menunjukkan hubungan kekerabatan dalam suatu populasi Rhizoctonia spp. yang heterogen dari suatu lahan melalui identifikasi dan pemantauan galur spesifik (Borges et al., 2002). Metode ini sebagai dasar pengelompokan dan diferensiasi inter-atau intrakelompok spesies (Toda et al, 1998).
UNGKAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini merupakan bagian dari Disertasi dan didanai oleh Anggaran DIPA UGM Hibah untuk Mahasiswa Doktor Tahun Anggaran 2009 No. Kontrak: LPPM-UGM/1107/2009 Tanggal 19 Mei 2009. Ucapan terima kasih disampaikan juga kepada Pusat Penelitian dan Pengembangan (Puslitbang) Perhutani Cepu yang memberikan kesempatan kepada penulis untuk menambah pengetahuan di Laboratorium Bioteknologi Puslitbang Perhutani Cepu.
KESIMPULAN
Berdasarkan analisis PCR-RFLP dengn enzim restriksi Hae III, Bsrd I, Msp I, dan Hinf I, Rhizoctonia mikoriza isolat SR-8 tidak memiliki hubungan kekerabatan dengan isolat SR-9 dan TMG-2, sedangkan kedua isolat terakhir berkerabat dekat.
Alexopoulus CJ, CW Mims, Blackwell. 1996. Introduc-tory Mycology. 4th ed. John Wiley & Sons, Inc. New York. 869 p.
Andersen TF, HN Rasmussen. 1996. The Mycorrhizal spesies of Rhizoctonia. 379-390 pp. in: Sneh B, SJ.Hare, Neate, G Dijst. Eds. Rhizoctonia spe-cies : Taxonomy, Moleculer Biology, Ecology, Pathology, and Disease Control. Kluwer Aca-demic Publisher. Dordrecht, The Netherlands. Anonim. 1999. Measuring DNA Concentration.
Univer-sitas Sumatra Utara
http://www.msu.ac.th/bio-dept/Measure-DNA.htm.. Diakses tanggal 16 Pebruari 2009).
_______, 2007. Mikoriza pada Tanaman Kehutanan. Ringkasan Materi Workshop Hasil-Hasil Penelitian dan Pengembangan. Pusat Penelitian dan Pengembangan Perum Perhutani Cepu, Desember : 17-19.
Borges AC, EG Barros, EA Gomes, MC Kasuya, 2002. Polymorphism in the internal transcribed spacer (ITS) of the ribosomal DNA of 26 isolats of ectomycorrhizal fungi. G e n M o l e c . B i o l . 25(24):477-483.
Cai L, R Jeewon, KD Hyde. 2006. Phylogenetic investi-gations of Sordariaceae based on multiple gene sequences and morphology. Mycolog, Res. 110(2):137-150
Hadisutrisno B. 2005. Budidaya Vanili Tahan Busuk Batang. Penebar Swadaya. Jakarta. 83 p. Hyakumachi M. 2004. Plant-growth-promoting fungi
from turfgrass rhizospere with potential for diasease supressions. Soil Microorganisms 44 : 53-68.
Kim HG, Nagarajan G, Nam M.H, Song JY, Yoo SJ. 2004. Genetic variation in Fusarium oxysporum f.sp. fragariae population based on RAPD and rDNA RFLP analyeses. Plant Pathol J. 20:264-270. Nusantara AD. 2007 Baku mutu inokulum cendawan
mikoriza arbuskula. In: Pros.Kongres Nasional Mikoriza Indonesia II 2007. Bogor. 11-12 Juli :1-21 pp.
Priyatmojo A, Y Yotani, K Hattori, K Kageyama, M Hyakumachi. 2001. Charcterization of Rhizocto-nia sp. causing root rot and stem rot of miRhizocto-nia- minia-ture rose. Plant Dis. 85: 1200-1205.
Sen R, AM Hietala, C Zelmer. 1999. Common anastomo-sis and internal transcribed pacer RFLP group-ing in binukleate Rhizoctonia isolats represent-ing root endophytes of Pinus sylvestris, Ceratorhiza spp. from orchid mycorrhiza l and a phytophatogenic anastomosis group. New Phythol. 144:331-341.
Sneh, B., L., Burpee, & A. Ogoshi. 1991. Identification of Rhizoctonia sp. APS Press.Inc., St. Paul. Min-nesota.
Taylor.D,L., & T.D.Bruns. 2004. Evidence for mycorrhizal races in a cheating orchid. Sci. Horticult. 271: 35-43.
Toda T, H Nasu, K Kageyama, M Hyakumachi. 1998. Genetic identification of web-blight fungus (Rhizoctonia solani AG 1) obtained from Euro-pean pear using RFLP of rDNA-ITS and RAPD anlyses.Res. Bull. Fac. Agric. Gifu Univ. 63: 1-9
Wallace LE. 2006. Spatial genetic structure and fre-quency of interspecific hybridization in P l a t a n t h e r a a q u i l o n i s and P. dilatata (Orchidaceae) occurring in sympatry. American J. Botany. ;93:1001-1009.
