Penentuan Kadar Protein Dalam Albumin Telur Dengan Metode

PENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM

PENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM SAMPEL PSAMPEL PUTIH TELUR MELALUIUTIH TELUR MELALUI METODE LOWRY

METODE LOWRY

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA

Oleh Oleh N

Ni i PPuuttuuCCaannddrraaMMaahhaayyaannii NNIIM M !!!!""!!""## N

Ni i MMaadde e WWiilllly y LLaarraa$$hhaatti i AAnnaa$$ttaa$$iiaa NNIIM M !!!!""!!""%% I

I &&uu$$ttiiAAyyuuDDee''iiAA((rriiyyaannttii NNIIM M !!!!""!!"")))) I

I PPuuttu u PPaannddu u SSeettiiaa''aann NNIIM M !!!!""!!""))**

+URUSAN PENDIDIKAN KIMIA +URUSAN PENDIDIKAN KIMIA

,AKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PEN&ETAHUAN ALAM ,AKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PEN&ETAHUAN ALAM

UNI-ERSITAS PENDIDIKAN &ANESHA UNI-ERSITAS PENDIDIKAN &ANESHA

SIN&ARA+A SIN&ARA+A

)"% )"%

PENENTUAN KADAR PROTEIN DALAM SAMPEL PUTIH TELUR MELALUI METODE LOWRY

I. TU+UAN

1. Membuat kurva hubungan antara konsentrasi protein standar dengan absorbansinya. 2. Menentukan kadar protein yang terdapat dalam putih telur dengan menggunakan

metode Lowry.

II. DASAR TEORI

Protein tersusun atas asam-asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Asam amino merupakan molekul organik dengan massa molekul rendah (antara 100-200 a! yang mengandung setidak-tidaknya satu gugus karboksil (-"##$! dan satu gugus amino (-%$2!. (&ika'2010!. &elur merupakan salah satu sumber protein hewani yang

 banyak dikonsumsi masyarakat. alam protein (albumin! telur ini terkandung beberapa asam amino seperti tirosin dan triptoan ()irahadikusumah' 1*+*!. ,omposisiputihtelurkandungan total protein 10-11 dasarbasah' ovalbulmin 0 dari total protein' /analbumin * dari total protein' ovoummu/oid 1 dari total protein. edangkankuningtelurterdiriatashipovitelindanhipotellenin.

Penentuan konsentrasi proteinasam amino merupakan proses rutin yang digunakan dalam analisis kimia. alah satu tu3uan dari penentuan konsentrasi proteinasam amino ini adalah untuk mengetahui nilai gi4i dari suatu bahan makanan. Ada beberapa metode yang  biasa digunakan dalam rangka menentukan konsentrasi protein' salah satunya adalah metode Lowry. Pemilihan metode yang baik dan tepat untuk suatu pengukuran tergantung  pada beberapa aktor' seperti banyaknya material atau sampel yang tersedia' waktu yang

tersedia untuk melakukan pengukuran' alat spektrootometer yang tersedia untuk  melakukan pengukuran (5edhana' 2006!.

5eagen pendeteksi gugus-gugus enolik' seperti reagen 7olin-"io/alteu telah digunakan dalam penentuan konsentrasi protein oleh Lowry (1*81! yang kemudian dikenal dengan metode Lowry. alam bentuk yang paling sederhana' reagen 7olin-"io/alteu dapat mendeteksi residu tirosin (dalam protein! karena kandungan enolik dalam residu tirosin yang mampu mereduksi reagen osotungstat dan osomolibdat men3adi tungstat dan molibdenum yang berwarna biru.5eagen osotungstat dan osomolibdat ini merupakan konstituen utama reagen 7olin-"io/alteu. $asil reduksi ini menun3ukkan

 pun/ak absorpsi yang lebar pada daerah merah dari spektrum sinar tampak (900-+00 nm! (&ika' 2010!.

ensitivitas dari metode 7olin-"io/alteu ini mengalami perubahan yang /ukup signiikan apabila digabung dengan ion-ion "u2:  _{(metode ;iuret!. ,ompleks "u-protein}

yang dihasilkan oleh reagen ;iuret akan menyebabkan reduksi pula pada os otungstat dan osomolibdat dalam reagen 7olin-"io/alteu. ,ira-kira 8 dari reduksi yang ter3adi diakibatkan oleh adanya kompleks "u-protein tersebut' sementara residu-r esidu tirosin dan triptoan mereduksi 28 sisanya (&ika' 2010!. 5eagen 7olin-"io/alteu merupakan suatu komposisi kompleks yang diperoleh dengan /ara pemanasan reluks dari %a-tungstat dan  %a-molibdat dengan asam ortoosat. elain itu' disertakan pula komponen-komponen lain untuk meningkatkan kestabilan reagen yang dalam kondisi normal berwarna kuning pu/at (&ika' 2010!.

Pada saat menentukan konsentrasi protein dalam suatu sampel' harus dilakukan  pula pengukuran terhadap beberapa larutan protein standar yang memiliki rentang konsentrasi tertentu di mana konsentrasi sampel protein berada di dalam rentang tersebut (&ika' 2010!. Protein dimasukkan pertama kali ke dalam tabung reaksi' kemudian ditambahkan air. eluruh tabung harus mempunyai volume akhir yang sama dan dilakukan  pengadukan atau pen/ampuran yang baik setelah penambahan 4at atau reagen. 5eagen  penghasil warna selalu ditambahkan terakhir dan biasanya diperlukan selang waktu

tertentu untuk ter3adinya reaksi yang sempurna (5edhana' 2010!.

Pengukuran yang dilakukan terhadap larutan protein standar dan sampel menggunakanspektrootometer. Melalui pengukuran ini akan diperoleh absorbansi dari larutan standar dan sampel. pektrosotometri merupakan salah satu metode analisis instrumental yang didasarkan pada interaksi energi dan materi. pektrootometri mempunyai aplikasi yang /ukup luas pada analisis se/ara kuantitati. $asil pengukuran se/ara kuantitati menggunakan metode ini mempunyai akurasi yang tinggi' walaupun tidak seakurat metode instrumentasi serapan atom atau sinar gamma. Prinsip dasar   pengukuran se/ara kuantitati adalah menggunakan hukum Lambert-;eer (&ika' 2010!.

Langkah-langkah umum dalam analisis dengan spetrootometer adalah< 1! pembentukan molekul yang dapat menyerap /ahaya pada daerah => atau tampak? 2! pembuatan spektrum dan pemilihan pan3ang gelombang? ! pembuatan kurva kalibrasi? dan 6!  pengukuran absorbansi /uplikan (Muderawan' 200*!.

$ukum Lambert-;eer men3abarkan pengurangan eksponensial dari intensitas radiasi yang diteruskan karena peningkatan aritmatik dari kadar 4at penyerap' sehingga diperoleh persamaan berikut (&ika' 2010!.

 

 

 



 

 

=

−

=

=

T  T   A  I   I  ₁ log log log 0

@o@ disebut optical density (#! atau absorbansi (A!' sedangkan @@o  disebut

transmitan (&!' yaitu proporsi radiasi yang diteruskan. ;ila & dikalikan dengan 100 disebut persen transmitansi (&!. engan menggunakan notasi-notasi yang merupakan  penggabungan $ukum ;eer dengan $ukum ;ouguer' maka $ukum ;eer dapat dituliskan

sebagai berikut<

A  B b "

imana B merupakan absorptivitas molar yang nilainya tergantung pada pan3ang gelombang dan 3enis 4at' b merupakan tebal medium penyerap yang biasanya dinyatakan dalam sentimeter (/m!' " merupakan konsentrasi molar. elan3utnya konsentrasi molar  larutan protein dapat dihitung melalui persamaan berikut<

y  mC : b

dimana< y  absorbansi C  konsentrasi m  kemiringan   b  intersep

III. ALAT DAN BAHAN !. Alat

Ta/el . atar Alat

N0 Na1aAlat +u1lah

1 pektoronik 202: ₁ 2 Delaskimia   ;atangpengaduk 1 6 Delasukur 8 mL 2 8 Pipettetes 2 9 Pipet volume8 mL 1  &abungreaksi 1 !.) Bahan

Ta/el ). atar ;ahan

1 ,ertas aring e/ukupnya

2 %a2"# e/ukupnya

 %a#$ 0'1 % e/ukupnya

6 "u8$2# 0'8 e/ukupnya

8 %a-tartarat e/ukupnya

 Larutan ;A e/ukupnya

+ Larutan Albumin &elur e/ukupnya

I-. PROSEDUR KER+A DAN HASIL PEN&AMATAN

Ta/el !. Prosedur ,er3a dan $asil Pengamatan

N0 Pr0$edurKer2a Ha$ilPen3a1atan

1 5eagen biuret

dibuatdenganmen/ampurkanreagen A sebanyak 80 mL danreagen ; sebanyak 1 mL

- 5eagen A dibuat dari 8 gram %a2"#  yang

dilarutkan dalam 280 mL larutan %a#$ 0'1 % - 5eagen A tidakberwarna

- 5eagen ; dibuatdari 0'29 gram "u#6.8$2# dan

 %a-tartarat yang dilarutkandalam 80 mLaguades - 5eagen ; berwarnabiru

- Larutanreagen buretdibuat dengan men/ampurkan reagen A (280 mL! dan reagen ; sebanyak 8 mL.

- 5eagen buret berwarna biru

2 Larutan albumin telurdibuatdenganmelarutkan 10 mL albumin telurkedalam *0 mL aEuades' 10 mL dari/ampuraninidien/erkanlagiseban yak 10 mL (pengen/eransampai 100 kali!

- Larutan albumin telurdibuatdenganmelarutkan 10 mL albumin telurdalam *0 mLaEuades

- Albumin telurberwarnakuning'

setelahditambahaEuadeslarutanmen3adikeruh - "ampurandiambilsebanyak 10

mLdandien/erkansampai 100 Ml

- Larutan ;A dibuat dengan 0'0 gram ;A dan dilarutkan dalam 100 mL aEuades

 Larutan protein standar (;A!

di/ampurdengan air   hinggavolumenyamen3adi 1'0mL. $al yang sama3ugadilakukanpadalarutansampe l protein. Penambahan (mL! 7enomena &abung 1 2  6 8 9  + tandar (;A! - "4 "4) "4 5 "4 % "4 * 4 " 6 tandar  protein - - - -4 " AEuades  "47 "4* "4 % "4 5 "4 ) 6 "4 7 Larutan berwarna bening

2 ebanyak 8 mL reagen ;iuret dimasukkankedalammasing-masingtabung yang  berisilarutanstandardansampel. ,emudian/ampuraninidiinkubasisela ma 10 menitpadasuhukamar. Penambahan (mL! 7enomena &abung 1 2  6 8 9  + 5eagen  buret 8 8 8 8 8 8 8 8

Larutan berwarna bening. Larutan tersebut diinkubasi selama F10menit

 etelah 10 menit' sebanyak 0'8 mL reagenenol (enolik-/io/elteu! ditambahkankedalammasing-masingtabungreaksikemudiandiko/o k. &abung-tabunginidiinkubasiselama 0 menitpadasuhukamar. )aktuinkubasidimulaisetelahpenamb ahanreagenenolik-/io/elteukedalamtabungterakhir. Penambahan (mL! 7enomena &abung 1 2  6 8 9  + 5eagen enol "4 # "4# "4# "4 # "4 # "4 # "4 # "4 # Larutan berwarna biru tua. Larutan tersebut diinkubasi selama F0menit pada suhu kamar 

6 Absorbansidarimasing-masinglarutantersebutdiukurdengans  pektronik  20:_{denganpan3anggelombang 00} nm. &abung Absorbansi 1 0'828 2 0'68  0'6+8 6 0'680 8 0'660 9 0'20  0'2*0 + 0'260

-. ANALISIS DAN PEMBAHASAN

alam praktikum ini dilakukan analisis kadar protein dalam sampel larutan kuning telur dengan menggunakan metode Lowry. Prinsip metode Lowry adalah menentukan konsentrasi protein yang didalamnya terdapat asam amino yang mengandung gugus enolik seperti tirosin dan triptoan dengan menggunakan reagen  pendeteksi gugus-gugus enolik' yaitu reagen 7olin-"io/alteu.imana salah satu residu dari asam amino yang memiliki gugus enolik adalah asam amino tirosin dan triptopan.

Langkah pertama yang dilakukan adalah menyiapkan reagen 7olin-"io/alteu dan reagen ;iuret. etelah larutan ;iuret disiapkan selan3utnya dilakukan pembuatan larutan sampel protein dengan melarutkan sebanyak 10 mL albumin

telurdalamaEuadessampai volume 100 mL.kemudiansebanyak 10 mL larutan albumin telurtersebutdien/erkanlagidenganmenggunakanaEaudessampai 10 kali pengen/eran (volume 100 mL!. etelah dilakukan pengen/eran larutan albumin telur berubah dari  bening tidak berwarna men3adi keruh. &u3uan dari pengen/eran ini yaitu untuk 

memperke/il konsentrasi sampel. #leh karena itu' dengan adanya pengen/eran' larutan sampel yang diukur akan mempunyai absorbansi diantara kurva kalibrasi' sehingga konsentrasi protein yang terkandung dalam kuning telur dapat diketahui.

Langkah selan3utnya yaitu memasukan larutan standar ;A dan larutan albumin ke dalam tabung reaksi' larutan standar ;A yang diisi pada masing-masing tabung  beda' sesuai dengan prosedur ker3a. Pengisian tabung dengan volume berbeda- beda ini bertu3uan untuk memberi variasi konsentrasi larutan standar protein (;A!' sehingga konsentrasi masing-masing tabung berbeda satu dengan lainnya. Pembuatan larutan standar dengan konsentrasi yang berbeda-beda ini bertu3uan untuk  mempermudah pembuatan kurva kalibrasi.

,onsentrasi dari masing-masing tabung dapat dihitungdengan persamaan berikut< >1M1  >2M2

,eterangan < >1  volume putih telur sebelum pengen/eran

M1 konsentrasi putih telur sebelum pengen/eran

>2  volume putih telur setelah pengen/eran

M2  konsentrasi putih telur setelah pengen/eran

,onsentrasi dari masing-masing tabung dapat dihitungdengan persamaan berikut< >1M1  >2M2

,eterangan < >1  volume putih telur sebelum pengen/eran

M1 konsentrasi putih telur sebelum pengen/eran

>2  volume putih telur setelah pengen/eran

M2  konsentrasi putih telur setelah pengen/eran

,onsentrasi larutan standar protein putih telur adalah 00 GgmL Tabung 1 : M₂ = V1M1 V₂ = 0 mL x 300 µg/mL 1,0 mL  = 0 µg/mL 0GgmL mL 1'0 GgmL 00 C mL 0'1 > M > M < 2 &abung 2 1 1 2= = =

90GgmL mL 1'0 GgmL 00 C mL 0'2 > M > M <  &abung 2 1 1 2 = = = 120GgmL mL 1'0 00GgmL C mL 0'6 > M > M < 6 &abung 2 1 1 2 = = = 1+0GgmL mL 1'0 00GgmL C mL 0'9 > M > M < 8 &abung 2 1 1 2 = = = 260GgmL mL 1'0 00GgmL C mL 0'+ > M > M < 9 &abung 2 1 1 2

=

=

=

Tabung7 : M₂ = V1M1 V₂ = 1,0 mL x 300 µg/mL 1,0 mL  =300 µg/mL

Langkah selan3utnya' masing-masing tabung diisi dengan reagen ;iuret. etelah ditambahkan reagen ;iuret ter3adi perubahan warna larutan' warna larutan men3adi  bening kebiruan. $al ini disebabkan karena terbentuknya kompleks "u2: _{dengan asam}

amino pada larutan albumin.,ompleks yang terbentuk adalah sebagai berikut.

" $% "$5  " $% "$5  # # "  %$ 5$" "  %$ 5$" # # "u2:

&a1/ar . truktur ,ompleks "u2:

Pada saat larutan ditambahkan reagen ;iuret' larutan diaduk kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama F10 menit. &u3uan larutan diinkubasi adalah agar  reaksi berlangsung sempurna dan tidak ter3adi penggumpalan pada larutan protein.

etelah itu 7olin-"io/alteu dimasukan sebanyak 0'8 mL kedalam masing-masing tabung. etelah penambahan reagen 7olin-"io/alteutampakter3adiperubahanpadalarutan' dimanalarutanpadatabungberwarnabiru

tua. 5eagen 7olin-"iao/alteu dapat mendeteksi residu tirosin dalam larutan protein karena kandungan enolik dalam residu tirosin mampu mereduksi reagen 7olin-"iao/alteu yang terdiri dari osotungstat dan osomolibdat men3adi tungstat dan molibdenum yang berwarnabiru.)arna ini dapat menyerap /ahaya pada daerah sinar  tampak' sehingga transmitansi dan absorbansinya dapat diukur. )arna yang ditimbulkansetelahpenambahanreagen7olin-"io/alteumengindikasikan terbentuknya tungstat dan molibdenum.engan reaksi yang ter3adi adalah sebagai berikut<

" # #$ " $₂ % "$₂ $ #$ Mo # # # ₁₂ P # $# #$ #$ -: Mo#2 : " # #$ " $₂ % "$₂ $ $# # : $_P#₆ molibdenum (berwarna biru! kuning pu/at ( osomolibdat! P)₁₂#₆₀ -_: " # #$ " $₂ % "$₂ $ #$ )#₆2- : " # #$ " $₂ % "$₂ $ $# # : $_P#₆ tungstat

(ion berwarna biru! kuning pu/at

(ion  osotungstat!

&a1/ar ).5esidu &irosin Mereduksi 5eagen 7olin-"iao/alteu yang &erdiri ari 7osotungstat dan 7osomolibdat Men3adi &ungstat dan Molibdenum yang

;erwarna;iru

imana kompleks "u-protein yang dihasilkan oleh reagen ;iuret  3ugamenyebabkan reduksi pada osotungstat dan osomolibdat. Adanya ion-ion "u2:_{darireagen ;iuretmenyebabkan sensitiitas dari reagen 7olin-"io/alteu ini}

mengalami perubahan yang /ukup signiikan. $al inidapatdilihat dariwarna yang dihasilkankepekatannya meningkat dari tabung 1-+.

Langkahselan3unya' setelah penambahan reagen 7olin-"io/alteu' kemudian larutan diinkubasi selama 0 menit. )aktu inkubasi dimulai setelah penambahan reagen 7olin-"io/alteu ke dalam tabung terakhir. elan3utnya dilakukan pengukuran absorbansi masing-masing larutan. Pada metode ini digunakan alat spektronik 20:

untuk menganalisis absorbansi larutan sampel dan larutan standar. ;erdasarkan hasil  pengukuran' diperoleh nilai absorbansi sampel sebagai berikut.

Ta/el 5. Absorbansi Larutan pada &iap &abung Ta/un3 A/$0r/a$i 8A9 &abung 1 0'88 &abung 2 0'68 &abung  0'6+8 &abung 6 0'680 &abung 8 0'660 &abung 9 0'20 &abung  0'2*0 &abung + (sampel! 0'260

;erdasarkan data di atas' dapat dibuat kurva kalibrasi sebagai berikut.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 f(x) = - 0x + 0.52 R² = 0.83

Konsentrasi µg/mL

A/$0r/an$i 8A9

&a1/ar !. ,urva $ubungan Antara Absorbansi dengan ,onsentrasi Larutan tandar  Protein (;A!

Persamaan garis yang diperoleh dari kurva di atas adalah y -0'000C : 0'8196' dimana y adalah absorbansi (A! dan C adalah konsentrasi ("!' sehingga persamaan di atas 3uga dapat ditulis sebagai berikut.

y  -0'000C : 0'8196

A  -0'000" : 0'8196

;erdasarkan pengukuran dengan spektronik 20:_{' diperoleh absorbansi sampel yaitu}

sebesar 0'26. ,onsentrasi sampel dapat ditentukan atau dihitung dengan /ara mensubstitusikan nilai absorbansi sampel ke dalam persamaan garis di atas' sehingga diperoleh< y  m" : b 0'26  -0'000" : 0'8196 -0'000" 0'26 H 0'8196 -0'000" 0'26 H 0'8196 "  *6'+9 GgmL

Iadi' kadar protein dalam sampel setelah dien/erkan (pada tabung +! adalah *6'+9. =ntuk kadar protein sebelum pengen/eran dapat ditentukan dengan rumus sebagai  berikut<

>1.M1  >2.M2'dimana

>1  >olume sampel sebelum pengen/eran

M1 ,adar sampel sebelum pengen/eran

>2  >olume sampel setelah pengen/eran

M2 ,adar sampel setelah pengen/eran

>1.M1  >2.M2 0'1 mL C M1  1'0 mL C*6'+9 GgmL M1  mL 1 ' 0 GgmL *6'+9 mL 0 ' 1 x  *6+'9 GgmL  '*6+ mgmL

,onsentrasi tersebut adalah hasil pengen/eran 10 kali' sehingga kadar protein pada sampel putih telur awal adalah<

mgmL + ' *6 M mL 1 mL 100 GgmL '*6+ M

=

×

=

ehingga kadar protein dalam sampel albumin telur tersebut adalah *6'+ mgmL.

-I. SIMPULAN

;erdasarkan data hasil pengamatan dan pembahasan di atas' maka dapat disimpulkan sebagai berikut.

1. ,urva hubungan antara absorbansi (A! dengan konsentrasi ( G

gmL! adalah mendekati linear dengan 5 2 _{ 0'+29*' dengan persamaan garis dari kurva adalah y}

 -0'000C : 0.8196.

2. ,adar protein dalam sampel albumin telur adalah sebesar *6'+ mgmL.

-II. DA,TAR PUSTAKA

Muderawan' @ )ayan. 200*. Analisis @nstrumen. ingara3a<=%@,$A P5J

5edana' @ )ayan. 2006. Buku Ajar Biokimiajilid I. Singaraja< @,@P %egeriingara3a. 5edana' @ )ayanKiti Maryam. 200. PenuntunPraktikumBiokimia. ingara3a< @,@P

 %egeriingara3a.

&ika' @ %yoman. 2010.  PenuntunPraktikumBiokimia. ingara3a< =niversitasPendidikan Danesha

LAMP@5A% 1. DAM;A5 

Dambar . Larutan tandar ;A Dambar 6. Proses @nkubasi