Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air [Impatiens balsamina L.] terhadap kultur sel SiHa - USD Repository

(1)

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR (Impatiens balsamina L.) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Widya Adhitama NIM : 058114069

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2009

(2)

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK KLOROFORM DAUN PACAR AIR (Impatiens balsamina L.) TERHADAP KULTUR SEL SiHa

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh : Widya Adhitama NIM : 058114069

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2009

(3)

(4)

(5)

Bersukacitalah dalam pengharapan, sabarlah dalam

kesesakan, dan bertekunlah dalam doa

(Roma 12 : 12)

Karena

Ia membuat segala sesuatu indah pada waktunya,

bahkan Ia memberikan kekekalan dalam hati

mereka

(Pengkhotbah 3 : 11a)

Kupersembahkan karya kecilku ini untuk: Tuhan Yesus Kristus pemilik hidupku Papa dan mama Kakak-kakak ku dan keponakanku Sahabat-sahabatku Almamaterku…

(6)

(7)

PRAKATA

Puji syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan karunia-Nya

sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul: “Uji Sitotoksisitas

Ektrak Kloroform Daun Pacar Air Terhadap Kultur Sel SiHa”, sebagai salah satu

syarat untuk memperoleh gelar kesarjanaan Strata satu (S-1).

Dalam proses penyusunan skripsi ini, penulis banyak mendapat bantuan

berupa bimbingan, dorongan, sarana, dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis

mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Rita Suhadi, M. Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

2. Bapak Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., selaku Dosen Pembimbing, atas

bimbingan, pengarahan, dan dukungan selama penelitian sampai penyusunan

skripsi ini.

3. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro M.Si., Romo Sunu, serta Bapak Aris

Dwiatmaka yang telah banyak membantu dalam penyelesaian skripsi ini.

4. Ibu Tri Yuliani dan segenap karyawan LPPT Universitas Gadjah Mada yang

telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian.

5. Papa dan Mamaku tercinta, Mbak Vivi, Mas Silo, Mas Ary, keponakan ku

Vio dan Eren atas segala dukungan, kasih sayang dan keceriaan yang

diberikan.

6. Sahabat - sahabat setiaku Ika, Nia, Sukma, Dewi,Yesi, dek Lulu, dek Jati, dek

Oline, Adith, Rafi, Mbak Eva, Wahyu, Eka, atas dukungan, semangatnya

selama ini dan buat persahabatan kita.

(8)

7. PMK Apostolos keluarga kedua ku, terima kasih karena aku boleh bertumbuh

bersama kalian. Aku percaya bahwa bukan suatu kebetulan aku berada di

tengah – tengah kalian dan menjadi bagian dari keluarga Apostolos.

8. Anni dan Lise buat suka duka selama dalam penelitian ini makasih buat

semangat dan pengertian kalian.

9. Temen – temen farmasi angkatan 2005 kelas B dan FKK 2005 makasih buat

semangatnya dan kebersamaan selama ini.

10. Mas Wagiran, dan Mas Sigit yang telah membantu dalam penelitian.

11. Semua pihak yang telah membantu penulis.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh

karena itu, penulis mengharapkan adanya saran dan kritik yang membangun demi

kesempurnaan skripsi ini. Namun, penulis berharap semoga skripsi ini dapat

bermanfaat bagi masyarakat dan perkembangan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, Mei 2009

Penulis

(9)

(10)

INTISARI

Kanker merupakan penyakit yang dapat menyebabkan kematian. Banyak penelitian yang telah dilakukan untuk mendapatkan senyawa baru yang dapat mengobati kanker. Secara empiris tanaman pacar air (Impatiens balsamina) telah digunakan untuk melancarkan persalinan, peluruh haid, dan untuk kanker saluran pencernaan bagian atas. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa dan sel Vero.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola satu arah. Konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air yang digunakan adalah 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; dan 100 µg/ml. Uji sitotoksik dilakukan menggunakan metode direct counting. Hasil perhitungan merupakan prosentase kematian sel yang kemudian dianalisis z-test dan analisis probit untuk menentukan nilai LC50.

Melalui uji sitotoksisitas ini dapat diketahui bahwa ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel SiHa maupun sel Vero dengan LC50 sebesar 52,5 µg/ml dan 275,4 µg/ml.

Kata kunci: sitotoksisitas, kanker, daun pacar air, sel SiHa, sel Vero, LC50

(11)

ABSTRACT

Cancer is a kind of disease that might cause death. Many researches have been done to obtain new compounds for cancer treatment. Empiricaly, Impatiens balsamina has been used for partufasien, emenagog, and antitumor. This study aimed to determine whether the chloroform extract of Impatiens balsamina leaves has a cytotoxic effect against SiHa and Vero cell cultures.

This research was a pure experimental with one way completely randomized design. Chloroform extract of Impatiens balsamina was made in concentrations that were 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; dan 100 µg/ml. Cytotoxicity test was conducted against SiHa cell using direct counting method. Percentage of death cell data were analyzed by z-test and probit analysis to determine the LC50

values.

Through this cytotoxicity test, it can be noted that the chloroform extract of Impatiens balsamina leaves have cytotoxicity effect against both SiHa cell and Vero cells with LC50 of 52,5 µg/ml and 275,4 µg/ml, respectively.

Keyword: cytotoxicity, cancer, Impatiens balsamina leaves, SiHa cell, Vero cell, LC50

(12)

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

HALAMAN PENGESAHAN ... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ...v

PRAKATA... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... viii

INTISARI... ix

ABSTRACT...x

DAFTAR ISI... xi

DAFTAR TABEL... xiv

DAFTAR GAMBAR ...xv

DAFTAR LAMPIRAN... xvii

BAB I. PENGANTAR ...1

A. Latar Belakang ...1

1. Permasalahan ...3

2. Keaslian penelitian ...3

3. Manfaat penelitian ...3

B. Tujuan Penelitian ...4

1. Tujuan umum...4

2. Tujuan khusus...4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA...5

A. Tanaman Pacar Air ...5

(13)

1. Keterangan botani...5

2. Kandungan kimia ...5

3. Khasiat dan penggunaan...5

4. Penelitian tanaman pacar air...6

B. Naftokuinon ...6

C. Teknik Penyarian ...7

D. Kanker ...8

E. Kultur Sel ...9

1. Sel Vero...9

2. Sel SiHa...9

F. Uji Sitotoksisitas ...9

G. Landasan Teori ...10

H. Hipotesis ...11

BAB III. METODE PENELITIAN ...12

A. Jenis dan Rancangan Penelitian...12

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional...12

1. Variabel penelitian...12

2. Definisi operasional ...13

C. Alat dan Bahan ...13

1. Alat ...13

2. Bahan ... ….14

D. Tata Cara Penelitian ...14

1. Determinasi tanaman ...14

2. Pengumpulan daun pacar air...15

(14)

3. Ekstraksi ...15

4. Sterilisasi alat...15

5. Pembuatan medium pencuci dan penumbuh ...16

6. Propagasi dan panen sel SiHa dan sel Vero ...16

7. Pembuatan larutan uji ...17

8. Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air dengan menggunakan metode direct counting...18

9. Analisis hasil...18

BAB IV. PEMBAHASAN...20

A. Determinasi Tanaman... 20

B. Pengumpulan Daun Pacar Air ... 20

C. Pembuatan Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air ... 21

D. Sterilisasi Alat ... 22

E. Pembuatan Medium Penumbuh dan Pencuci... 22

F. Preparasi Kultur Sel SiHa ... 23

G. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air ... 24

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ...35

A. Kesimpulan...35

B. Saran ...35

DAFTAR PUSTAKA ...36

LAMPIRAN...39

BIOGRAFI PENULIS ...63

(15)

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil Perhitungan Prosentase Kematian Sel SiHa Setelah Inkubasi 24

Jam ...26

Tabel II. Hasil Perhitungan Prosentase Kematian Sel Vero Setelah Inkubasi 24

Jam ...27

Tabel III. Data Perhitungan Jumlah Kultur Sel SiHa Dengan Metode Direct

Counting...41

Tabel IV. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel SiHa Pada

Replikasi 1...43

Tabel V. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel SiHa Pada

Replikasi 2...46

Tabel VI. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel SiHa Pada

Replikasi 3...48

Tabel VII. Data Perhitungan Jumlah Kultur Sel Vero Dengan Metode Direct

Counting...49

Tabel VIII. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel Vero Pada

Replikasi 1...51

Tabel IX. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel Vero Pada

Replikasi 2...54

Tabel X. Data % Kematian, Harga Probit, dan Log Konsentrasi Sel Vero Pada

Replikasi 3...56

Tabel XI. Nilai r (koefisien korelasi) pada level signifikansi 5% dan 1% ...57

(16)

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur 2-metoksi-1,4-naftokuinon...6

Gambar 2. Morfologi sel setelah pemberian trypan blue, pada bilik

haemocytometer dengan perbesaran 100x ...25

Gambar 3. Morfologi sel yang hidup pada kontrol sel SiHa dilihat dengan

perbesaran 100x ...28

Gambar 4. Morfologi sel yang hidup pada kontrol sel Vero dilihat dengan

Gambar 5. Sel SiHa pada konsentrasi ekstrak 60 µg/ml dilihat dengan

Gambar 6. Sel Vero pada konsentrasi ekstrak 100 µg/ml dilihat dengan

Gambar 7. Grafik pengaruh kadar ekstrak kloroform daun pacar air terhadap

prosentase kematian sel SiHa...29

Gambar 8. Grafik pengaruh kadar ekstrak kloroform daun pacar air terhadap

prosentase kematian sel Vero...29

Gambar 9. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada

sel SiHa replikasi 1 ...30

(17)

sel Vero replikasi 1...32

Gambar 15. Tanaman pacar air ...41

Gambar 16. Daun pacar air ...41

(18)

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Hasil Determinasi... ...40

Lampiran 2. Tanaman Pacar Air yang digunakan dalam penelitian... ...41

Lampiran 3. Perhitungan LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel

Siha menggunakan analisis probit... ...42

Lampiran 4. Perhitungan LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap sel

Vero menggunakan analisis probit... ...50

Lampiran 5. Perhitungan uji linearitas untuk analisis regresi... ….58

Lampiran 6. Analisis statistik uji z antara kelompok kontrol dan perlakuan ….59

Lampiran 7. Uji t terhadap log LC50 sel SiHa dan Sel Vero... ...63

(19)

BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang

Timbulnya penyakit kanker di Indonesia erat kaitannya dengan peralihan

Indonesia dari negara pertanian menjadi negara industri yang mengubah perilaku

atau gaya hidup dan kebiasaan masyarakat (Anonim, 2008a). Kanker leher rahim

merupakan tumor ganas yang paling sering menyerang wanita, terutama yang

disertai dengan predisposisi tertentu seperti wanita yang sering berganti-ganti

pasangan, kawin muda, berhubungan seksual pertama kali pada umur < 20 tahun.

Di negara yang telah maju dan berhasil membasmi penyakit infeksi,

kanker merupakan penyebab kematian kedua setelah penyakit kardiovaskuler.

Pada saat ini dari metode pengobatan yang telah dilakukan, 1/3 jumlah pasien

tertolong melalui pembedahan dan terapi radiasi. Kesembuhan hampir seluruhnya

terjadi pada pasien yang penyakitnya belum menyebar pada saat pembedahan

(Ganiswara dan Nafrialdi, 1995). Menurut WHO, setiap tahun jumlah penderita

kanker di dunia bertambah 6,25 juta orang. Di Indonesia diperkirakan setiap

tahunnya terdapat 100 penderita kanker yang baru dari setiap 100.000 penduduk

(Anonim, 2008a). Mahalnya biaya pengobatan membuat banyak kalangan

masyarakat mulai beralih pada pengobatan tradisional menggunakan berbagai

macam tanaman obat alami (Soedibyo, 1998).

Antikanker diharapkan memiliki toksisitas selektif artinya

menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal. Pada umumnya

(20)

antineoplastik menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan

toksisitas. Terapi hanya dapat dikatakan berhasil baik, bila dosis yang digunakan

dapat mematikan sel tumor yang ganas dan tidak terlalu mengganggu sel normal

(Ganiswara dan Nafrialdi, 1995).

Khasiat dari tanaman pacar air (Impatiens balsamina) secara empiris

untuk melancarkan peredaran darah, peluruh haid, melancarkan persalinan.

Tanaman ini juga diindikasikan untuk mengobati kanker saluran cerna bagian atas

(Dalimartha, 2007).

Penelitian tentang ekstrak kloroform daun pacar air yang dilakukan di

China menunjukkan bahwa ekstrak tersebut memiliki aktivitas anti tumor

terhadap hepatocelular carcinoma cell line Hep-G2. Senyawa aktif yang

diidentifikasi sebagai anti tumor tersebut adalah 2-metoksi 1,4-naftokuinon

(Zhi-Shan et al., 2008).

Perlu dilakukannya penelitian ekstrak tersebut terhadap sel kanker.

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan sel SiHa untuk mengetahui apakah

ekstrak kloroform daun pacar air ini mempunyai efek sitotoksik terhadap sel

kanker. Digunakan sel SiHa karena mempunyai persamaan dengan hepatocelular

carcinoma cell line Hep-G2 yaitu keduanya diambil dari jaringan epitel dan

merupakan kanker yang disebabkan karena virus (Anonim, 2008c). Berdasarkan

hasil, sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air ini selanjutnya dapat

digunakan sebagai dasar untuk mengembangkan suatu senyawa antikanker

(21)

1. Permasalahan

Berdasarkan latar belakang tersebut maka dapat ditarik suatu

permasalahan sebagai berikut:

a. Apakah ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik

terhadap sel SiHa ?

b. Seberapa besar nilai LC50 dari ekstrak kloroform daun pacar air terhadap

sel SiHa ?

2. Keaslian penelitian

Penelitian mengenai Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar

Air Terhadap Sel Kultur SiHa sejauh penelusuran penulis belum pernah

dilakukan.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai

khasiat, penggunaan dan efek sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar

air terhadap kultur sel SiHa yang dapat menambah kemajuan ilmu

pengetahuan khususnya dibidang kefarmasian.

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan khasiat daun pacar

(22)

B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform

daun pacar air ini memiliki potensi yang dapat dikembangkan sebagai

senyawa anti kanker.

2. Tujuan khusus

a. Untuk mengetahui potensi sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air

terhadap kultur sel SiHa.

b. Untuk mengetahui seberapa besar nilai LC50 dari ekstrak kloroform daun

(23)

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Pacar Air 1. Keterangan botani

Tanaman Pacar Air (Impatiens balsamina) merupakan anggota familia

Balsaminaceae (Backer dan Brink, 1986). Tanaman ini berupa terna semusim

yang biasa ditanam di halaman sebagai tanaman hias atau tumbuhan liar di

tempat yang cukup mendapat air dan sinar matahari. Mempunyai daun

tunggal, bertangkai dan berbentuk lanset memanjang, tepi bergerigi tajam,

ujung dan pangkal menyirip, warna hijau (Dalimatha, 2007). Nama lain dari

tanaman ini adalah Lahine (Nias), Paru inai (Minangkabau) (Dalimartha,

2003).

2. Kandungan kimia

Daun: 2-metoksi 1,4-naftokuinon (Thongnopnua et al., 1991).

Biji: saponin, balsaminasterol, kuersetin, naftokuinon (Dalimartha, 2003).

Bunga: sianidin, delphinidin, malvidin, kaempherol, kuersetin (Dalimartha,

2003).

3. Khasiat dan penggunaan

Melancarkan peredaran darah, peluruh haid, melancarkan persalinan,

dan diindikasikan untuk mengobati kanker saluran cerna bagian atas

(Dalimartha, 2007).

(24)

4. Penelitian tanaman pacar air

Penelitian - penelitian yang telah dilakukan sebelumnya menunjukkan

bahwa tanaman pacar air dapat digunakan untuk obat topikal yang mempunyai

efek antipruritik yang dapat mengobati beberapa tipe dari dermatitis. Telah

dilaporkan juga tanaman tersebut digunakan sebagai antianafilaksis,

antihistamin, antiplatelet. Senyawa aktif utama dari tanaman pacar air adalah

1,4-naftokuinon (balsakuinon) (Oku dan Kyoko, 2002). Pada penelitian yang

lain, balsakuinon yang merupakan senyawa aktif dari daun pacar air memiliki

aktivitas antifungal (Thongnopnua et al., 1991).

B. Naftokuinon

O

OCH3

Gambar 1. Struktur 2-metoksi-1,4-naftokuinon

Senyawa naftokuinon merupakan senyawa aromatik alami yang mempunyai ciri mengandung satu rantai samping alifatik yang terikat pada cincin aromatik. Semua senyawa kuinon berupa minyak atau hablur yang mempunyai rentang warna mulai dari kuning sampai merah dan sangat mudah larut dalam pelarut organik seperti benzena, eter dan kloroform (Robinson, 1995).

(25)

anti tumor yang kuat (Anonim, 2008b). Senyawa

5-hidroksi-2-metil-1,4-naftokuinon mampu secara efektif melawan kanker payudara dengan menghambat

pertumbuhan sel kanker payudara dengan tidak memberikan efek terhadap sel

epitelial payudara normal (Ahmad et al., 2008). Suatu penelitian tentang senyawa

2-metoksi-1,4 naftokuinon dalam ekstrak daun pacar air identifikasi sebagai

senyawa yang mempunyai aktivitas terhadap human hepatocellular carcinoma

cell line HepG2 (Zhi-Shan et al., 2008).

C. Teknik Penyarian

Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan

yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang disari, mengandung zat

aktif yang dapat larut dan zat yang tidak larut seperti serat, karbohidrat, protein

dan lain – lain. Faktor yang mempengaruhi kecepatan penyarian adalah kecepatan

difusi zat yang larut melalui lapisan-lapisan batas antara cairan penyari dengan

bahan yang mengandung zat tersebut (Anonim, 1986). Ekstrak adalah sediaan

pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau

simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir

semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan

sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 1995).

Pelarut merupakan cairan penyari untuk ekstrak sebaiknya sesuai dengan

zat aktif yang berkhasiat, dalam arti dapat memisahkan zat aktif tersebut dari

senyawa lainnya dalam bahan sehingga ekstrak mengandung sebagian besar

(26)

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana dan digunakan

simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari.

Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari.

Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan

konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan di luar sel, maka larutan

yang pekat akan keluar (Anonim, 1986).

D. Kanker

Kanker adalah kelainan genetik yang merupakan akibat dari peristiwa

-peristiwa mutasi. Mutasi tersebut mengubah fungsi normal suatu sel itu menjadi

memiliki ciri – ciri berikut: (1) sel menjadi immortal, yaitu mampu melakukan

pembelahan sel secara tak terbatas, (2) sel menjadi independen dari kontrol –

kontrol selular normal yang membatasi pertumbuhan dan pembelahan, dan (3) sel

itu menjadi invasif dengan menyebar ke jaringan – jaringan lain, dalam sebuah

proses yang disebut metatasis (Elrod dan William, 2002).

Tumor dapat dibedakan menjadi 2 yaitu tumor jinak (benigna) dan tumor

ganas (malignan). Tumor benigna bukanlah kanker. Tumor benigna tumbuh di

dalam suatu kapsul yang dikemas dengan baik dimana membatasi ukuran dan

memelihara karakteristik sel asal, serta jarang menyebabkan kematian. Sel dari

tumor benigna tidak menyebar ke bagian lain pada tubuh. Kebalikkannya tumor

malignan merupakan kanker, biasanya lebih serius dan dapat mengancam hidup.

Sel kanker dapat menyerang dan merusak organ dan jaringan didekatnya (Dipiro,

(27)

E. Kultur Sel 1. Sel Vero

Kultur sel Vero dimulai pertama kalinya pada tahun 1962 yang diambil

dari ginjal kera (jenis African Green Monkey) yang sehat sehingga sering

digunakan sebagai contoh dari sel normal (Doyle dan Griffiths, 2000).

2. Sel SiHa

Infeksi HPV (Human Papilomavirus) merupakan faktor tertinggi

penyebab kanker leher rahim. Sel SiHa diambil dari suatu karsinoma serviks yang

banyak digunakan sebagai model dari sel karsinoma serviks (Ishibashi et al.,

2008).

Serviks atau leher rahim merupakan bagian ujung bawah rahim yang

menonjol ke vagina. Kanker leher rahim berkembang secara bertahap, tetapi

progresif. Proses terjadinya kanker ini dimulai dengan sel yang mengalami mutasi

lalu berkembang sehingga terjadi kelainan epitel yang disebut displasia

(Dalimartha, 2007). Human Papilomavirus (HPV) 16 mempunyai peran dalam

terjadinya karsinoma serviks (Arjono, 1999).

F. Uji Sitotoksisitas

Sitotoksisitas ialah sifat toksis atau beracun suatu senyawa terhadap sel

hidup. Uji sitotoksisitas ialah suatu uji yang secara in vitro menggunakan kultur

sel dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik, maupun

bahan-bahan kimia lainnya (Freshney, 2000).

Metode direct counting merupakan uji yang umum dan sering digunakan

untuk penghitungan sel yang akurat dan efisien yaitu dengan haemocytometer.

(28)

untuk mempermudah penghitungan. Pada saat suspensi sel dimasukkan ke dalam

bilik, dapat langsung dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dan sel dihitung

pada sejumlah bilik pada haemocytometer. Trypan blue berguna untuk

memastikan analisis kuantitatif dari kondisi kultur sel. Trypan blue merupakan zat

warna yang hanya akan dapat menembus membran sel yang mati. Ketika suspensi

sel diberi trypan blue, sel yang hidup akan tetap berbentuk bulat dan bersinar

sedangkan sel yang mati mengalami perubahan menjadi berwarna biru tua. Hal

yang perlu diperhatikan pada saat pengisian suspensi sel ke dalam bilik pada

haemocytometer yaitu agar tidak ada gelembung yang dapat menyebabkan

terjadinya kesalahan dalam penghitungan sel. Kondisi lain yang menentukan

keakuratan dalam penghitungan sel adalah kebersihan bilik hitung dan ketepatan

dalam pengisian suspensi sel ke dalam bilik (Doyle dan Griffiths, 2000).

Pada penelitian dengan Brine Shrimp Test menyatakan bahwa suatu

ekstrak atau bahan dikatakan mempunyai efek sitotoksik jika memiliki LC50 <

1000 µg/ml dan mempunyai efek toksik yang berpotensi sebagai anti kanker jika

memiliki LC50 < 30 µg/ml (Meyer et al., 1982).

G. Landasan Teori

Sel SiHa merupakan model dari sel karsinoma serviks. Terjadinya

karsinoma serviks diperantarai oleh Human Papilomavirus (HPV) 16. Dewasa ini

produk herbal sangat berkembang. Banyak tanaman diteliti untuk digunakan

sebagai obat kanker, salah satunya adalah pacar air. Dalam suatu penelitian daun

(29)

terhadap human hepatoscellular carcinoma cell line HepG2. Senyawa tersebut

adalah 2-metoksi-1,4 naftokuinon (Zhi-Shan et al., 2008).

Berdasarkan penelitian tersebut, maka perlu dilakukan penelitian apakah

ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel

SiHa.

H. Hipotesis

Ekstrak kloroform daun pacar air memiliki efek sitotoksik terhadap

(30)

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan penelitian

Penelitian tentang uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air

(Impatiens balsamina) terhadap kultur sel SiHa ini termasuk penelitian

eksperimental murni yang mengikuti rancangan acak lengkap pola satu arah.

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu

(LPPT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel Penelitian

a. Variabel bebas

Kadar ekstrak kloroform daun pacar air untuk perlakuan terhadap sel

SiHa yaitu 30 µg/ml; 40 µg/ml; 50 µg/ml; 60 µg/ml; 70 µg/ml; 80 µg/ml; 90

µg/ml; 100 µg/ml. Untuk perlakuan terhadap sel Vero yaitu 100 µg/ml; 200

µg/ml; 300 µg/ml; 400 µg/ml; 500 µg/ml; 600 µg/ml; 700 µg/ml; 800 µg/ml

b. Variabel tergantung

Persentase kematian sel SiHa dan sel Vero

c. Variabel pengacau terkendali

i. Medium tumbuh sel SiHa dikendalikan dengan menggunakan medium

RPMI 1640-serum dan untuk sel Vero dengan medium M199.

ii. Umur dan tempat tumbuh tanaman pacar air.

Daun pacar air yang digunakan untuk penelitian ini diperoleh dari tempat

yang sama dan umur yang sama.

(31)

2. Definisi operasional

1. Sitotoksisitas adalah sifat toksik atau beracun dari ekstrak kloroform daun

pacar air terhadap kultur sel SiHa.

2. Sel SiHa adalah sel yang di ambil dari kanker serviks yang disebabkan

oleh HPV 16.

3. Sel Vero adalah sel yang diambil dari ginjal kera jenis African Green

Monkey, digunakan sebagai contoh sel normal.

4. Ekstrak kloroform daun pacar air adalah ekstrak yang diperoleh dengan

cara mengekstraksi daun pacar air secara maserasi menggunakan larutan

penyari kloroform.

5. LC50 adalah konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air yang mampu

membunuh atau dapat menyebabkan kematian sejumlah 50 % sel uji dan

dinyatakan dalam µg/ml.

C. Alat dan Bahan 1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas,

timbangan analitik (Mettler toledo), alumunium foil, tabung conical (Nunc),

autoklaf, tissue culture flask (Nunc), swing rotor sentrifuge (PLC), inkubator

(Memerd), mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter (Nunc), 96-well

plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), mikroskop (Olympus IMT-2),

haemocytometer (Nebauer), tissue, glove, waterbath, yellow tip, blue tip,

(32)

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah :

a. Daun pacar air segar.

b. Kultur sel SiHa dan kultur sel Vero yang diambil dari stok dari

Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas

Gadjah Mada, Yogyakarta.

c. Kloroform untuk preparasi ekstrak daun pacar air.

d. Pereaksi - pereaksi untuk uji sitotoksisitas

i. Media pencuci: RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, HEPES

ii. Media penumbuh: RPMI 1640, FBS (Fetal Bovine Serum) 10%,

Penisilin - Streptomisin 1% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco),

M199, natrium bikarbonat, HEPES {4-(2-hidroxyethyl)-1-piperazine

etane sulphonic acid}.

iii. Pelarut : DMSO (dimethylsulfoxide) 0,25 %

e. Bahan untuk melepas sel SiHa: tripsin 0,25 %

f. Trypan blue

D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman

Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun pacar air

segar, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan

dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku ( Backer dan Van den

(33)

2. Pengumpulan daun pacar air

Bahan yang digunakan berupa daun pacar air, diambil dari tanaman pacar

air di daerah Tajem, Sleman. Daun tersebut dicuci dengan air mengalir untuk

menghilangkan kotoran kotoran yang melekat, kemudian ditiriskan sampai sisa

-sisa air menghilang. Daun dijemur di bawah sinar matahari, dengan ditutup kain

hitam supaya tidak merusak kandungan dalam daun, kemudian dikeringkan dalam

oven dengan suhu 45˚ C. Setelah kering, lalu diserbuk dengan menggunakan

mesin sampai halus. Ukuran patikel serbuk sebesar 65 mesh yang telah di set pada

mesin.

3. Ekstraksi

Serbuk kering daun pacar air ditimbang kemudian dimaserasi

menggunakan larutan penyari kloroform selama 24 jam dan dilakukan

penyaringan menggunakan pompa vakum. Setelah itu dilakukan pengupan dengan

menggunakan vacumrotaryevaporator sampai didapatkan ekstrak kental. Ekstrak

kental yang didapat dilanjutkan dengan penguapan di atas penangas air hingga

kloroform menguap semua. Ekstrak kental kemudian dimasukkan dalam oven dan

setiap 2 jam ditimbang sampai didapatkan bobot konstan.

4. Sterilisasi alat

Alat-alat tersebut dicuci bersih dengan sabun dan dikeringkan, setelah itu

dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit

(34)

5. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh

a. Pembuatan medium pencuci

RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml,

ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes, diencerkan sampai 100 ml,

pH dibuat 7,2 lalu disterilkan dengan filter berdiameter 0,22 µm. Medium

disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney, 1986; Jacoby dan

Pastan, 1979).

b. Pembuatan medium kultur (RPMI 1640-serum)

Untuk medium RPMI 1640-serum dilarutkan dalam aquabidest

kurang lebih 80 ml, ditambah 2,3 g natrium bikarbonat, 2 g Hepes,

diencerkan sampai 100 ml, pH dibuat 7,2 kemudian ditambahkan FBS

(Fetal Bovine Serum) 10%, penisilin-streptomisin 1% dan fungison 0,5%

dalam medium RPMI 1640 dan disterilkan dengan filter berdiameter 0,22

µm. Media disimpan dalam almari es pada suhu 4oC (Freshney, 1986;

Jacoby dan Pastan, 1979).

6. Propagasi dan panen sel SiHa dan sel Vero

a. Propagasi sel SiHa

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan

dalam penangas air 37oC, kemudian ampul disemprotkan dengan etanol

70%. Ampul dibuka dan sel SiHa dipindahkan dalam tabung conical steril

yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5

menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru,

(35)

1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan

secara perlahan sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue

culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37oC

dengan aliran 5% CO2 (Freshney, 1986; Jacoby dan Pastan, 1979).

b. Panen sel SiHa

Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari),

media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel

dilepaskan dari dinding flask dengan diberi tripsin 0,25%. Sel dipindahkan

dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai

volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan

dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel

kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah

sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar

2,5x104/100 µl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby

dan Pastan, 1979).

c. Propagasi dan panen sel Vero

Propagasi dan panen sel Vero menggunakan langkah yang sama

dengan propagasi dan panen sel SiHa. Perbedaannya hanya terletak pada

medium yang digunakan. Sel Vero menggunakan medium M199.

7. Pembuatan larutan uji

Ekstrak kental ditimbang sebanyak 0,01 g, dilarutkan dengan pelarut

DMSO 0,25 % dan diaduk untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan

(36)

dengan konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air 30 - 100 µg/ml untuk

perlakuan terhadap sel SiHa dan 100 – 800 µg/ml untuk perlakuan terhadap sel

Vero.

8. Uji sitotoksisitas ekstrak kloroform daun pacar air dengan menggunakan metode direct counting

Pada uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel SiHa dengan

kepadatan 2x104/100 µl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate yang

telah berisi 100 µl ekstrak kloroform daun pacar air dengan kadar 30 µg/ml; 40 µg/ml;

50 µg/ml; 60 µg/ml; 70 µg/ml; 80 µg/ml; 90 µg/ml; 100 µg/ml. Sebagai kontrol,

100 µl suspensi sel SiHa ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium

RPMI 1640 – serum. Selanjutnya 96-well plate diinkubasi selama 24 jam pada

suhu 37°C, dalam inkubator dengan aliran CO2 5%. Pada akhir masa inkubasi,

tiap sumuran sel diresuspensi bersama trypan blue, dimasukkan dalam

haemocytometer kemudian dihitung jumlah sel dengan mikroskop.

Uji sitotoksisitas terhadap sel Vero dilakukan dengan cara yang sama,

yang membedakan adalah konsentrasi ekstrak kloroform daun pacar air yaitu 100

µg/ml; 200 µg/ml; 300 µg/ml; 400 µg/ml; 500 µg/ml; 600 µg/ml; 700 µg/ml; 800

µg/ml dan medium yang digunakan adalah M-199.

9. Analisis Hasil

Persentase kematian sel dihitung dengan persamaan berikut:

− _×₁₀₀_%

∑

kontrol kelompok hidup

sel

perlakuan kelompok

hidup sel kontrol

kelompok hidup

sel

Untuk menghitung harga LC50 dilakukan perhitungan data menggunakan analisis

(37)

dilakukan pengolahan data dengan statistik uji z dan untuk mengetahui adanya

perbedaan antara perlakuan terhadap sel SiHa maupun sel Vero digunakan

(38)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Dalam penelitian ini, digunakan daun pacar air untuk uji sitotoksisitas

terhadap kultur sel SiHa. Tanaman pacar air yang akan digunakan perlu

diidentifikasi terlebih dahulu untuk memastikan kebenaran bahwa bahan yang

digunakan adalah benar tanaman pacar air.

Determinasi tanaman ini dilakukan di Laboratorium

Farmakognosi-Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, dengan

menggunakan buku acuan (Backer dan Brink, 1986). Dari hasil determinasi,

diperoleh bahwa tanaman tersebut merupakan tanaman pacar air (Impatiens

balsamina ) (lampiran 1).

B. Pengumpulan Daun Pacar Air

Daun pacar air yang digunakan untuk penelitian ini diambil dari daerah

Tajem, Maguwoharjo, Sleman, Yogyakarta, pada bulan Agustus 2008. Daun

dipanen dari tanaman yang sama dan pada waktu yang sama, hal ini bertujuan

untuk menyeragamkan kualitas daun dan kandungan kimianya.

Daun pacar air yang telah dipanen kemudian dicuci dengan air yang

mengalir. Tujuannya agar dapat membersihkan daun dari pengotor - pengotor,

misalnya mikroba, debu, bagian lain dari tanaman tersebut, atau bagian tanaman

lain yang ikut terambil sewaktu pengumpulan bahan. Setelah dicuci daun

ditiriskan, dijemur di bawah sinar matahari kemudian dikeringkan dengan

(39)

menggunakan oven pada suhu 45o C sehingga kandungan airnya berkurang dan

kualitas daun masih tetap baik. Simplisia kering kemudian diserbuk untuk

memperkecil ukuran partikel karena akan mempunyai luas permukaan yang besar

sehingga kandungan senyawa dapat tersari dengan maksimal. Jika ukuran serbuk

terlalu besar maka akan memperkecil luas permukaan dari partikel serbuk yang

kontak dengan penyari. Sedangkan jika ukuran partikel terlalu kecil maka dapat

mengakibatkan partikel serbuk akan menggumpal sehingga sulit untuk kontak

dengan penyari.

C. Pembuatan Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air

Pembuatan ekstrak daun pacar air dilakukan dengan metode maserasi.

Metode ini dipilih karena prosesnya yang sederhana sehingga mudah untuk

dilakukan. Sebagai cairan penyari digunakan kloroform, pemilihan cairan penyari

ini didasarkan dari kandungan senyawa di dalam daun pacar air yaitu naftokuinon

yang dapat larut dalam kloroform.

Pada metode maserasi tidak menggunakan pemanasan, sehingga dapat

mencegah adanya kerusakan senyawa yang tidak tahan terhadap panas. Maserasi

ini dilakukan dengan menggunakan bejana tertutup yang bertujuan untuk

mencegah terjadinya penguapan senyawa maupun cairan penyarinya. Pada saat

perendaman simplisia, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke

dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Oleh karena adanya perbedaan

konsentrasi larutan zat aktif di dalam sel maupun yang di luar sel, mampu

mendesak larutan zat aktif keluar. Pada proses maserasi ini juga dilakukan

(40)

D. Sterilisasi Alat

Sterilisasi dilakukan untuk membebaskan alat - alat dari segala macam

bentuk kontaminan terutama mikroorganisme, karena jika terdapat kontaminan

maka akan berpengaruh terhadap kematian sel yang digunakan dalam penelitian

ini, sehingga dengan menjaga sterilitas dapat memperoleh hasil yang maksimum.

Sterilisasi alat menggunakan autoklaf yang merupakan sterilisasi dengan uap air

panas. Mekanisme penghancuran mikroba oleh uap air panas adalah uap panas

akan melakukan penetrasi ke dalam sel mikroorganisme sehingga terjadi

denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial organisme tersebut yang akan

mengakibatkan kematian mikroorganisme. Alat-alat yang akan disterilisasi

terlebih dahulu dicuci, dikeringkan lalu dibungkus dengan alumunium foil.

Kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama kurang lebih 20 menit dengan suhu

121o C.

E. Pembuatan Medium Penumbuh dan Pencuci

Medium penumbuh sel SiHa yang digunakan dalam penelitian ini yaitu

RPMI-1640 atau juga disebut complete medium. Medium ini mengandung FBS

(Fetal Bovine Serum) 10 % yang berisi kandungan nutrisi untuk pertumbuhan sel,

penstrep (penisilin - streptomisin) yang merupakan antibiotik antimikotik

spektrum luas yang berfungsi untuk mencegah tumbuhnya bakteri baik gram

positif maupun negatif, selain itu RPMI 1640 juga mengandung fungison yang

berfungsi sebagai antifungi untuk mencegah adanya pertumbuhan jamur. Selain

itu medium RPMI 1640 mengandung natrium bikarbonat dan HEPES. Medium

(41)

Suatu kultur sel memerlukan perawatan rutin yaitu penggantian medium

secara periodik. Waktu penggantian medium dan subkultur tiap sel berbeda, hal

ini bergantung pada kecepatan pertumbuhan sel dan metabolisme dari sel tersebut.

Untuk sel yang pertumbuhannya cepat, subkultur dilakukan sekali seminggu dan

penggantian medium dilakukan tiap 4 hari sekali. Sedangkan untuk sel yang

pertumbuhannya lambat, subkultur dilakukan setiap 2, 3, atau 4 minggu sekali dan

penggantian medium dilakukan bersamaan dengan waktu subkultur.

Medium pencuci yang digunakan adalah RPMI 1640 yang ditambah bahan

buffer yaitu natrium bikarbonat dan hepes. Pada saat pembuatan medium pencuci

dan medium penumbuh, kedua medium tersebut difiltrasi menggunakan membran

filter dengan diameter pori – pori 0,22 µm. Hal ini bertujuan untuk menyaring

virus, bakteri, dan fungi yang dapat mengkontaminasi selama proses pembuatan

medium berlangsung. Karena jika terkontaminasi akan berpengaruh terhadap

pertumbuhan sel yang memungkinkan terjadinya kematian sel. Sehingga

kontaminasi ini seharusnya dapat dihindari.

F. Preparasi Kultur Sel SiHa

Pada proses propagasi, sel diambil dari tanki nitrogen cair dalam

keadaan beku sehingga tidak merubah bentuk sel dari aslinya. Setelah cair, ampul

dibersihkan dengan etanol untuk mencegah adanya kontaminasi dari luar.

Kemudian dilakukan pencucian sel dengan memindahkan sel ke dalam medium

penumbuh yaitu RPMI-1640 lalu kemudian disentrifugasi, proses ini dilakukan

(42)

Selanjutnya diinkubator pada suhu 37o C supaya mengkondisikan sel dalam tubuh

manusia.

Panen sel dilakukan pada saat keadaan konfluen tercapai, suatu kondisi

dimana populasi sel menempati seluruh permukaan dinding flask. Diberi tripsin

agar sel lepas dari dinding. Sel kemudian ditempatkan dalam medium RPMI yang

baru, lalu disentrifugasi untuk membantu proses pemisahan sel dangan

mediumnya. Pelet sel yang diperoleh disuspensi kembali dengan RPMI untuk

dihitung konsentrasi sel. Perhitungan ini menggunakan haemocytometer.

G. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air

Uji sitotoksisitas ini dilakukan untuk mengetahui efek sitotoksik ekstrak

kloroform daun pacar air terhadap kultur sel SiHa dan sel Vero. Sel Vero

digunakan untuk mengetahui apakah ekstrak kloroform daun pacar air

memberikan efek sitotoksik terhadap sel normal. Uji ini bersifat kuantitatif karena

parameter yang digunakan untuk mengetahui seberapa besar potensi ketoksikan

dari ekstrak yaitu LC50. Lethal Concentration - 50 (LC50) dalam penelitian ini

merupakan besarnya kadar ekstrak kloroform daun pacar air yang mampu

mengakibatkan terbunuhnya 50% jumlah sel SiHa dan sel Vero. Nilai LC50 ini

biasanya ditentukan setelah 24 jam perlakuan.

Dalam penelitian ini untuk uji sitotoksisitas tidak menggunakan metode

MTT karena ekstrak kloroform daun pacar air yang didapat berwarna hijau

kehitaman sehingga akan dapat memberikan serapan dan mempengaruhi hasil

pengukuran absorbansinya. Oleh karena itu metode yang digunakan adalah

(43)

bawah mikroskop menggunakan bantuan haemocytometer dan juga metode ini

tidak dipengaruhi oleh warna dari ekstrak.

Sebelum dilakukan penghitungan, terlebih dahulu kultur sel diberi reagen

trypan blue. Reagen ini berfungsi sebagai penanda untuk membedakan sel yang

hidup dan yang mati. Sel yang hidup akan berwarna terang (bersinar) karena

masih mempunyai sitoplasma yang utuh. Sedangkan pada sel yang mati, reagen

ini akan menembus masuk membran sel yang mati sehingga warnanya menjadi

lebih gelap (biru tua). Namun metode ini mempunyai kelemahan yaitu waktu yang

dibutuhkan untuk penghitungan sel sangat lama dan subyektivitasnya tinggi.

Untuk mengatasi hal tersebut maka dalam penghitungan sel dilakukan oleh satu

orang saja dan dilakukan replikasi sebanyak tiga kali.

b

a

Gambar 2. Morfologi sel setelah pemberian trypan blue, pada bilik haemocytometer dengan perbesaran 100x (a) Sel hidup; (b) Sel mati

Dalam uji ini digunakan kontrol yang berisi suspensi sel SiHa dan

RPMI-1640, dan tanpa diberi ekstrak. Kontrol ini berfungsi untuk membandingkan

antara sel yang diberi perlakuan dengan sel yang tidak diberi perlakuan. Pada

kondisi perlakuan seri kadar yang digunakan yaitu 30 µg/ml; 40 µg/ml; 50 µg/ml;

60 µg/ml; 70 µg/ml; 80 µg/ml; 90 µg/ml; dan 100 µg/ml. Untuk sel Vero

(44)

yaitu M-199. Kemudian kadar ekstrak yang digunakan untuk perlakuan adalah

100 µg/ml; 200 µg/ml; 300 µg/ml; 400 µg/ml; 500 µg/ml; 600 µg/ml; 700 µg/ml;

dan 800 µg/ml. Seri kadar ini dibuat untuk melihat adanya respon yang diberikan

oleh ekstrak terhadap kematian dari sel SiHa maupun sel Vero.

Dari hasil perhitungan sel didapatkan rata-rata konsentrasi sel pada kontrol

sel SiHa yaitu 38.333 sel/200µlsedangkan kontrol pada sel Vero yaitu 37.000

sel/200µl. Hasil perhitungan prosentase kematian sel SiHa (tabel 1) dan sel Vero

(tabel 2) menunjukkan bahwa semakin besar kadar ekstrak kloroform daun pacar

air, jumlah kematian sel SiHa maupun sel Vero juga semakin besar.

Tabel I. Hasil Perhitungan Prosentase Kematian Sel SiHa Setelah Inkubasi 24 Jam

Replikasi

I II III Kadar

ekstrak kloroform

daun pacar air

(µg/ml)

Log kadar

ekstrak Kematian sel

Harga probit

Kematian sel

Harga probit

Kematian sel

Harga probit

30 1,48 28,26 % 4,42 28,26 % 4,42 28,26 % 4,42

40 1,60 34,78 % 4,61 34,78 % 4,61 36,09 % 4,61

50 1,70 43,91 % 4,85 42,61 % 4,82 41,30 % 4,77

60 1,78 51,74 % 5,05 51,74 % 5,05 51,74 % 5,05

70 1,85 59,56 % 5,25 60,87% 5,28 59,56 % 5,25

80 1,90 68,70 % 5,50 68,70 % 5,50 68,70 % 5,50

90 1,95 77,83 % 5,77 77,83 % 5,77 77,83 % 5,77

(45)

Tabel II. Hasil Perhitungan Prosentase Kematian Sel Vero Setelah Inkubasi 24 Jam

Replikasi

I II III Kadar

ekstrak kloroform

daun pacar air

(µg/ml)

Log kadar

ekstrak Kematian sel

Harga probit

Kematian sel

Harga probit

Kematian sel

Harga probit

100 2,00 28,38 % 4,42 27,03 % 4,39 27,03 % 4,39

200 2,30 37,84 % 4,69 37,84 % 4,69 37,84 % 4,69

300 2,48 45,95 % 4,90 45,95 % 4,90 45,95 % 4,90

400 2,60 55,41 % 5,13 54,05 % 5,10 54,05 % 5,10

500 2,70 62,16 % 5,31 62,16 % 5,31 60,81% 5,28

600 2,78 67,57 % 5,47 67,57 % 5,47 67,57 % 5,47

700 2,85 78,38 % 5,77 77,03 % 5,77 78,38 % 5,77

800 2,90 95,95 % 6,75 94,59 % 6,64 94,59 % 6,64

Hasil perhitungan prosentase kematian sel di atas didapat dengan

membandingkan jumlah sel hidup pada perlakuan dengan jumlah sel hidup pada

kontrol. Kemudian berdasarkan prosentasi kematian sel diketahui nilai harga

probit yang dapat dilihat dari tabel probit (Mursyidi, 1985).

Kultur sel SiHa yang hidup berbentuk bulat dan panjang, sel yang mati

bentuknya terlihat bulat kusam. Sedangkan untuk sel vero yang hidup bentuknya

panjang dan yang mati berbentuk bulat.

(46)

Gambar 3. Morfologi sel yang hidup pada kontrol sel SiHa dilihat dengan perbesaran 100x

Gambar 4. Morfologi sel yang hidup pada kontrol sel Vero dilihat dengan perbesaran 100x

i

ii

(47)

i

ii

Gambar 6. Sel Vero pada konsentrasi ekstrak 100 µg/ml (i. sel hidup; ii. Sel mati)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

kadar ekstrak kloroform daun pacar air (µg/ml)

kem at ian sel ( % ) replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3

Gambar 7. Grafik pengaruh kadar ekstrak kloroform daun pacar air terhadap prosentase kematian sel SiHa

0 20 40 60 80 100 120

0 200 400 600 800 1000

kadar ekstrak kloroform daun pacar air (µg/ml)

ke m a tia n s e l (% ) replikasi 1 replikasi 2 replikasi 3

(48)

Pada gambar 6 dan 7 dapat dijelaskan bahwa semakin tinggi konsentrasi

dari ekstrak kloroform daun pacar air maka semakin besar pula prosentase

kematian dari sel SiHa maupun sel Vero. Hal ini dapat ditunjukkan pada gambar,

untuk sel SiHa pada konsentrasi paling rendah memiliki rata-rata prosentase

kematian sel sebesar 28,26 % kemudian pada konsentrasi paling tinggi memiliki

rata - rata prosentase kematian sel sebesar 85,65 %. Sedangkan untuk sel Vero

pada konsentrasi paling rendah rata-rata prosentase kematian sel sebesar 27,48 %

dan 95,04 % pada konsentrasi paling tinggi. Dari grafik juga dapat menjelaskan

bahwa nilai prosentase kematian sel dipengaruhi oleh konsentrasi dari ekstrak

kloroform daun pacar air. Dapat diistilahkan dose dependent dimana semakin

rendah konsentrasi ekstrak maka prosentase kematian sel juga akan menurun.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0 0,5 1 1,5 2 2,5

log konsentrasi

ha

rga

pr

obi

t

y = 3,10x - 0,33

Gambar 9. Grafik hubungan log kadar ekstrak terhadap harga probit pada sel SiHa replikasi 1

(49)

0 1 2 3 4 5 6 7

0 0,5 1 1,5 2 2,5

log konsentrasi

ha

rga

pr

obi

t y = 3,12x - 0,37

0 1 2 3 4 5 6 7

0 0,5 1 1,5 2 2,5

log konsentrasi

ha

rg

a

pr

ob

it

y = 3,13x - 0,40

Pada grafik hubungan antara log kadar ekstrak dengan harga probit dari

prosentase kematian sel SiHa replikasi 1, 2, dan 3 diperoleh hubungan yang

linear. Dari gambar 9,10 dan 11 menunjukkan bahwa grafik replikasi 1, 2, dan 3

(50)

0 1 2 3 4 5 6 7 8

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

log konsentrasi

h

a

rga

pr

obi

t

y = 2,05x + 0,02

Gambar 12. Grafik hubungan log kadar ekstrak terhadap harga probit pada sel Vero replikasi 1

0 1 2 3 4 5 6 7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

log konsentrasi

h

a

rg

a

pr

ob

it

y = 2,02x + 0,07

(51)

0 1 2 3 4 5 6 7

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

log konsentrasi

ha

rga

pr

obi

t

y = 2,02x + 0,08

Gambar 14. Grafik hubungan log kadar ekstrak terhadap harga probit pada sel Vero replikasi 3

Pada grafik hubungan antara log kadar ekstrak dengan harga probit dari

prosentase kematian sel vero replikasi 1, 2, dan 3 diperoleh hubungan yang

linear. Dari gambar 12,13 dan 14 menunjukkan bahwa grafik replikasi 1, 2, dan 3

linear terhadap persamaan garis yang didapat.

Parameter sitotoksisitas ditentukan oleh LC50. Nilai LC50 didapatkan dari

analisis probit, dengan regresi linear dari log konsentrasi ekstrak dengan harga

probit prosentase kematian sel pada perlakuan. Uji linearitas untuk memenuhi

analisis regresi linear yang mensyaratkan adanya hubungan antara variabel bebas

dan variabel terikat yang saling membentuk kurva linear. Hasil dari uji linearitas

diperoleh nilai r hitung > r tabel, sehingga menunjukkan bahwa tidak terjadi

penyimpangan signifikan terhadap linearitas. Kemudian hasil yang diperoleh

untuk LC50 sel SiHa yaitu 52,5 µg/ml dan LC50 sel Vero sebesar 275,4 µg/ml.

Menurut Meyer (1982) suatu ekstrak atau bahan dikatakan mempunyai efek

(52)

anti kanker jika memiliki LC50 < 30 µg/ml. Sehingga ekstrak kloroform daun

pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap sel SiHa maupun sel Vero. Tetapi

belum bisa dikatakan mempunyai efek toksik sebagai anti kanker terhadap sel

SiHa. Namun hal ini menunjukkan bahwa ekstrak kloroform daun pacar air

mempunyai kemampuan untuk membunuh sel kanker. Untuk dapat memperoleh

harga LC50 yang lebih kecil dapat dilakukan dengan melakukan fraksinasi

terhadap ekstrak daun pacar air sehingga didapatkan fraksi ekstrak yang lebih

spesifik terhadap sel kanker.Ekstrak kloroform daun pacar air juga memberikan

efek sitotoksik terhadap sel kanker lainnya, pada sel Hela dengan LC50 53,7 µg/ml

(Natalia, 2009) dan pada sel T47D dengan LC50 34,9 µg/ml (Anni, 2009).

Untuk mengetahui apakah ada perbedaan antara kontrol dengan perlakuan pada

masing-masing kadar dilakukan analisis dengan uji z, menggunakan taraf

kepercayaan 95 %. Hasil yang diperoleh dari perhitungan secara manual

memperoleh nilai z hitung lebih besar dari nilai z tabel yang artinya terdapat

perbedaan yang signifikan antara hasil perlakuan ekstrak kloroform daun pacar air

dengan kontrol. Untuk mengetahui adakah perbedaan antara LC50 sel SiHa dan sel

Vero digunakan uji t. Hasilnya menunjukkan bahwa ada perbedaan yang

bermakna antara LC50 sel SiHa dan LC50 sel Vero. Sehingga dapat disimpulkan

bahwa ekstrak kloroform daun pacar air memiliki efek sitotoksik terhadap sel

(53)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Ekstrak kloroform daun pacar air mempunyai efek sitotoksik terhadap

sel SiHa dan sel vero dengan LC50 masing-masing yaitu 52,5 µg/ml dan 275,4

µg/ml. Oleh karena itu mempunyai kemungkinan ekstrak ini dapat dikembangkan

sebagai agen antikanker karena memiliki efek sitotoksik yang lebih dominan

terhadap sel SiHa.

B. Saran

Saran yang dapat dikemukakan dari penelitian ini adalah perlu dilakukannya

pengujian sitotoksisitas terhadap fraksi dari ekstrak kloroform daun pacar air

terhadap sel SiHa.

(54)

DAFTAR PUSTAKA

Anni, 2009, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsamina L.) Terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-2, 10, Departemen Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan I, 9-11, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2008a, Kanker, http://www.dinkes-diy.org/?x =berita&id_berita= 10032009115425, diakses pada tanggal 17 Maret 2009

Anonim, 2008b, Medicine and Quinone, http://www.quinone.com/ver1_0/ e/appli_e/appli_health01_e.html, diakses pada tanggal 24 Maret 2009

Anonim, 2008c, Cell Biology, www.atcc.org/atccadvancecatalogsearch/ product/details/tabid/452/default.aspx?atccnum=crl10741&template=cell biology, diakses pada tanggal 8 Mei 2009

Ahmad, A., Sanjeev B., Zhiwei W., Dejuan K., dan Fazlul H. S., 2008, Plumbagi-Induced Apoptosis of Human Breast Cancer Cells Is Mediated by Inactivation of NF-KB and Bcl-2, Journal of Cellular Biochemistry,

1058:1461-1471

Arjono, 1999, Onkologi, Edisi 5, 494-498, UGM Press, Yogyakarta

Backer, C. A., dan Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I dan II, N. V. Noordhoff, Graningen

Dalimartha, S., 2003, Atlas Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid 3, 84-86, Puspa Swara, Jakarta

Dalimartha, S., 2007, Ramuan Tradisional Untuk Pengobatan Kanker, cetakan 8, 72-73, Penerbit Swadaya, Jakarta

Dipiro, J.T., 2005, Pharmacotherapy A Pathophysiologic Approach, 6th Edition, 2285-2286, McGraw-Hill, New York

(55)

Elrod, S., dan William S., 2002, Genetika, Edisi 4, 261, Erlangga, Jakarta

Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-73, IRL Press, Washington DC

Freshney, R.I., 2000, Culture of Animal Cells, A manual of Basic Technique, 4th Edition, 329-330, A John Wiley & Sons, inc, New York

Ganiswara, S.G dan Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Immunosupresan dalam

Farmakologi dan Terapi, Edisi 4, editor Sulistia G. Ganiswara dkk, 686-687, Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta

Hagman, D.E., 2005, Remington The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, 776-781, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia

Ishibashi, M., 2008, A Review of Papillomaviral Tumors: Human Papillomavirus Type 47 and the SiHa cell, Two Material Contributions to the Research

World from this Institute,

http://www.cmj.org/periodical/XMLList.asp?id=LW8524, diakses pada tanggal 25 juni 2008

Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York

Kimball, J.W., 1983, Biology, Edisi 5, Jilid 2, diterjemahkan oleh Siti Soemarmi T, 418-419, Erlangga, Jakarta

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nochols, D.E., Mc Laughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents, Planta Medica, 45, 32-34

Natalia, L., 2009, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Kloroform Daun Pacar Air (Impatiens balsamina L.) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Oku, H., dan Kyoko I., 2002, Cyclooxygenase-2 Inhibitory 1,4-Naphtoquinones from Impatiens balsamina L., Biol. Pharm. Bull. 25, 658-660

Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Edisi Keenam, 57;61, Penerbit ITB, Bandung

(56)

Thongnopnua, P., Jutima B., Vilai C., dan Wallee V., 1991, Quantitative Determination of 2-Methoxy-1,4-Naphthoquinone in Plasma by High-Perfomance Liquid Chromothography, Analytical Sciences, 7, 1529-1534

(57)

(58)

(59)

Lampiran 2. Tanaman Pacar Air yang digunakan dalam penelitian

Gambar 15. Tanaman pacar air

(60)

Lampiran 3. Perhitungan LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap

sel Siha menggunakan analisis probit.

Tabel III. Data perhitungan jumlah kultur sel SiHa dengan metode direct counting

Replikasi

I II III

No. Konsentrasi

(µg/ml) Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati

1 Kontrol 77 0 76 0 77 0

2 30 55 9 55 9 55 9

3 40 50 11 50 13 49 13

4 50 43 14 44 14 45 14

5 60 37 17 37 18 37 18

6 70 31 20 30 20 31 20

7 80 24 24 24 24 24 24

8 90 17 28 17 28 17 28

9 100 11 31 11 32 11 31

Jumlah sel = 10 200

4 × ×

x

Keterangan: x = jumlah sel hasil perhitungan langsung pada haemocytometer

4 = jumlah bilik dalam haemocytometer

10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer(µl)

200 = jumlah volume total (µl)

Jumlah sel pada kontrol:

Replikasi I = 10 200 4

77 _× _×

= 38.500

Replikasi II = 10 200 4

76 _× _×

(61)

Replikasi III = 10 200 4

77 _× _×

= 38.500

Rata-rata kontrol =

3 500 . 38 000 . 38 500 .

38 + +

= 38.333

Jumlah sel pada kontrol adalah 38.333 sel/ 200µl

REPLIKASI I

Jumlah sel SiHa yang hidup:

Konsentrasi 30 µg/ml = 10 200 4

55 _× _×

= 27.500 sel/sumuran

50 _× _×

43_× _×

37 _× _×

31_× _×

24 _× _×

17 _× _×

= 8.500 sel/sumuran

11_× _×

= 5.500 sel/sumuran

Persen kematian sel SiHa = − × B

B A

100 %

Keterangan: A = jumlah sel hidup pada sumuran kontrol

(62)

Konsentrasi 30 µg/ml = − × 333 . 38 500 . 27 333 . 38

100% = 28,26 %

Konsentrasi 40 µg/ml = − ×

333 . 38 000 . 25 333 . 38

100% = 34,78 %

333 . 38 500 . 21 333 . 38

100% = 43,91 %

333 . 38 500 . 18 333 . 38

100% = 51,74 %

333 . 38 500 . 15 333 . 38

100% = 59,56 %

333 . 38 000 . 12 333 . 38

100% = 68,70 %

333 . 38 500 . 8 333 . 38

100% = 77,83 %

333 . 38 5500 333 . 38

100% = 85,65 %

Tabel IV. Data % kematian, harga probit, dan log konsentrasi sel SiHa pada replikasi 1

No.

Konsentrasi Ekstrak Kloroform Daun

Pacar air (µg/ml)

Presentase kematian sel

Siha

Harga probit Log konsentrasi

1 30 28,26 % 4,42 1,48

2 40 34,78 % 4,61 1,60

3 50 43,91 % 4,85 1,70

4 60 51,74 % 5,05 1,78

5 70 59,56 % 5,25 1,85

6 80 68,70 % 5,50 1,90

7 90 77,83 % 5,77 1,95

(63)

Regresi linear dari log konsentrasi vs harga probit:

a = - 0,33

b = 3,10

r = 0,97

Y = bx + a

= 3,10x – 0,33

Y = nilai probit 50 maka 5 = 3,10x – 0,33

x = 1,72

REPLIKASI II

55 _× _×

50 _× _×

44 _× _×

37 _× _×

30 _× _×

24 _× _×

17 _× _×

= 8.500 sel/sumuran

11_× _×

(64)

B A

100 %

B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan

333 . 38 500 . 27 333 . 38

100% = 28,26 %

333 . 38 000 . 25 333 . 38

100% = 34,78 %

333 . 38 000 . 22 333 . 38

100% = 42,61 %

333 . 38 500 . 18 333 . 38

100% = 51,74 %

333 . 38 000 . 15 333 . 38

100% = 60,87 %

333 . 38 000 . 12 333 . 38

100% = 68,70 %

333 . 38 500 . 8 333 . 38

100% = 77,83 %

333 . 38 5500 333 . 38

(65)

Tabel V. Data % kematian, harga probit, dan log konsentrasi sel SiHa pada replikasi 2

No.

Pacar air (µg/ml)

Siha

1 30 28,26 % 4,42 1,48

2 40 34,78 % 4,61 1,60

3 50 42,61 % 4,82 1,70

4 60 51,74 % 5,05 1,78

5 70 60,87% 5,28 1,85

6 80 68,70 % 5,50 1,90

7 90 77,83 % 5,77 1,95

8 100 85,65 % 6,08 2,00

a = - 0,37

b = 3,12

r = 0,97

Y = bx + a

= 3,12x – 0,37

x = 1,72

REPLIKASI III

55 _× _×

49 _× _×

(66)

45 _× _×

37 _× _×

31_× _×

24 _× _×

17 _× _×

= 8.500 sel/sumuran

11_× _×

= 5.500 sel/sumuran

B A

100 %

B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan

333 . 38 500 . 27 333 . 38

100% = 28,26 %

333 . 38 500 . 24 333 . 38

100% = 36,09 %

333 . 38 500 . 22 333 . 38

100% = 41,30 %

333 . 38 500 . 18 333 . 38

100% = 51,74 %

333 . 38 500 . 15 333 . 38

100% = 59,56 %

333 . 38 000 . 12 333 . 38

(67)

Konsentrasi 90 µg/ml = − × 333 . 38 500 . 8 333 . 38

100% = 77,83 %

333 . 38 5500 333 . 38

100% = 85,65 %

Tabel VI. Data % kematian, harga probit, dan log konsentrasi sel SiHa pada replikasi 3

No.

Pacar air (µg/ml)

Siha

1 30 28,26 % 4,42 1,48

2 40 36,09 % 4,61 1,60

3 50 41,30 % 4,77 1,70

4 60 51,74 % 5,05 1,78

5 70 59,56 % 5,25 1,85

6 80 68,70 % 5,50 1,90

7 90 77,83 % 5,77 1,95

8 100 85,65 % 6,08 2,00

a = - 0,40

b = 3,13

r = 0,97

Y = bx + a

= 3,13x – 0,40

x = 1,73

Nilai xrata-rata = ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ + + 3 73 , 1 72 , 1 72 , 1 = 1,72

(68)

Lampiran 4. Perhitungan LC50 ekstrak kloroform daun pacar air terhadap

sel Vero menggunakan analisis probit.

Tabel VII. Data perhitungan jumlah kultur sel Vero dengan metode direct counting

Replikasi

I II III

No. Konsentrasi

(µg/ml) Hidup Mati Hidup Mati Hidup Mati

1 Kontrol 74 0 74 0 74 0

2 100 53 10 54 10 54 9

3 200 46 13 46 12 46 3

4 300 40 16 40 16 40 6

5 400 33 18 34 18 34 16

6 500 28 21 28 21 29 20

7 600 24 24 24 24 24 24