ANTIBODI ANTI-IDIOTIPE SEBAGAI
KANDIDAT VAKSIN RABIES
SAYU PUTU YUNI PARYATI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Antibodi Anti-idiotipe sebagai Kandidat Vaksin Rabies adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Bogor, Desember 2006
Sayu Putu Yuni Paryati NIM. B161020061
ABSTRAK
SAYU PUTU YUNI PARYATI. Antibodi anti-id iotipe sebagai kandidat vaksin rabies. Di bawah bimbingan I WAYAN TEGUH WIBAWAN, RETNO DAMAYANTI SOEJOEDONO dan FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
Serum anti rabies (SAR) yang diproduksi pada kuda, disebut antibodi 1 (Ab1) digunakan untuk mengimunisasi ayam. Imunoglobulin ayam (IgY) anti-Ab1
merupakan antibodi anti-idiotipe (Ab2) terhadap rabies, dipanen dari darah ayam
setiap minggu selama 10 minggu. Rata-rata titer Ab2 tertinggi diperoleh pada minggu ketiga dan keempat pasca vaksinasi. Pemurnian IgY (Ab2) dilakukan
melalui pengendapan dengan amonium sulfat jenuh konsentrasi 60% dan 50%, dilanjutkan dengan dialisis menggunakan PBS pH 8,0 selama 24 jam pada suhu 2 – 8 oC. Pemurnian tahap berikutnya dengan kolom kromatografi afinitas spesifik terhadap IgY, menghas ilkan protein dengan berat molekul 185.000, 95.000 dan 49.000 dalton. Sebanyak 3 ekor kelinci New Zealand White diimunisasi dengan Ab2 dan 3 ekor kelinci lainnya sebagai kelompok kontrol. Pemeriksaan serum kelinci (Ab3) dengan teknik Agar Gel Presipitation Test (AGPT), menunjukkan Ab3 bereaksi homolog dengan Ab2 dan virus rabies. Reaksi juga memperlihatkan
pola reaksi identitas sebagian (partial identity) antara Ab2 dan virus, menunjukkan
bahwa tidak semua dari Ab2 yang terbentuk dari responnya terhadap Ab1
mengandung internal image yang dapat menginduksi antibodi spesifik terhadap antigen aslinya. Pengujian serum terhadap kadar antibodi rabies menunjukkan bahwa Ab2 mampu menginduksi respon antibodi lebih dari 0,5 IU/ml mulai
minggu pertama sampai keempat pasca vaksinasi.
Kesimpulan dari hasil penelitian ini, yaitu antibodi anti-id iotipe mampu menginduksi tingkat antibodi protektif terhadap virus rabies, sehingga Ab2 dapat
digunakan sebagai antigen pengganti dalam imunisasi rabies.
ABSTRACT
SAYU PUTU YUNI PARYATI. Anti-idiotype Andibody as A Rabies Vaccine Candidate. Under the direction of I WAYAN TEGUH WIBAWAN, RETNO DAMAYANTI SOEJOEDONO dan FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
Anti rabies serum (ARS) called antibody 1 (Ab1) was used as the antigen to immunize laying chickens. Anti-Ab1 chicken immunoglobulins (IgY), the
anti-idiotype antibodies against rabies (Ab2) was isolated from chicken blood every
week for ten weeks. The highest titer of Ab2 was found at the third week after the
last immunization. Immunoglobulin Y was separated by means of ammonium sulfate precipitation, then dialyzed using PBS pH 8.0 for 24 hours at 2 – 8 oC and purified using affinity chromatography column for IgY lead the proteins molecules with 185,000; 95,000 and 49,000 dalton in weigth. Purified IgY was used to immunize New Zealand White rabbit and the antibody response (Ab3) was detected using Agar Gel Precipitation Test (AGPT). The Ab3 showed specific reaction with Ab2 as well as rabies virus. Interestingly, Ab2 and rabies virus
express partial identity reaction. This lead the insight, that not all parts of Ab2 are
internal image of rabies virus. The efficacy of Ab3 was detected using enzyme
linked immunosorbent assay (ELISA) and indicated that the level of Ab3 titer is
protective according to WHO standard (more than 0.5 IU/ml).
The conclusion of this study is the anti-idiotype antibody can induce protective immune response against rabies virus and can be used as an alternative for rabies anti-idiotype vaccine.
ANTIBODI ANTI-IDIOTIPE SEBAGAI
KANDIDAT VAKSIN RABIES
SAYU PUTU YUNI PARYATI
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada
Program Studi Sains Veteriner
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006
Judul Disertasi : Antibodi Anti-idiotipe sebagai Kandidat Vaksin Rabies Nama : Sayu Putu Yuni Paryati
NIM : B161020061
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS Ketua
Dr. drh. Retno D. Soejoedono, MS. Prof. Dr. drh. Fachriyan H. Pasaribu Anggota Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Dekan Sekolah Pascasarjana Sains Veteriner
Dr. drh. Bambang P. Priosoeryanto, MS. Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadapan Ida Sang Hyang Widhi Waça, Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkah dan rahmatNya penulis dapat menyelesaikan penyusunan disertasi sebagai tugas akhir untuk menyelesaikan pendidikan program doktor di Program Studi Sains Veteriner pada Sekolah Pascasarjana IPB. Dalam penelitian ini, penulis mengambil judul : Antibodi Anti-idiotipe sebagai Kandidat Vaksin Rabies”.
Penulis menyampaikan penghargaan dan hormat serta terima kasih yang tulus kepada dosen pembimbing, yaitu Bapak Dr. drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS., Ibu Dr. drh. Retno D. Soejoedono, MS. dan Bapak Prof. Dr. drh. Fachriyan H. Pasaribu yang telah membantu, membimbing, memberikan pengarahan dan semangat kepada penulis mulai dari rencana mengikuti pendidikan, selama mengikuti pendidik an, persiapan dan pelaksanaan penelitian hingga penyusunan disertasi ini.
Terima kasih penulis sampaikan kepada Pimpinan Proyek BPPS Dikti, Departemen Pendidikan Nasional RI yang telah memberikan beasiswa kepada penulis selama mengikuti pendidikan. Ucapan terima kasih penulis sampaikan juga kepada Ibu drh. Lia Siti Halimah, M.Si. dan staf di laboratorium Uji Hewan PT. Bio Farma Bandung, atas segala bantuan yang telah diberikan. Demikian juga kepada Bapak drh. I Dewa Made Ngurah Dharma, M.Sc., Ph.D. selaku Kepala Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan (BBPMSOH) di Gunung Sindur, Bogor beserta staf, penulis menyampaikan terima kasih atas bantuan dan kesempatan yang diberikan untuk menggunakan fasilitas laboratorium.
Kepada Ibunda dan Ayahanda I Gusti Kayan Suparta (alm.), Ibunda dan Ayahanda I Gusti Ngurah Mecutan, adik-adik tercinta serta seluruh keluarga, penulis menyampaikan terima kasih yang sedalam-dalamnya dan penghargaan yang setinggi-tingginya atas doa, bimbingan, serta dorongan semangat yang tak pernah berhenti diberikan dalam kehidupan penulis dengan suasana penuh cinta. Terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya penulis sampaikan kepada suami tercinta, Ir. I Gusti Ngurah Sudira, MSAe., yang dengan penuh rasa kasih, sabar dan penuh pengertian, selalu mendoakan, memberikan dorongan, berkorban dan mendampingi penulis, sehingga penulis dapat mengikuti pendidikan, menyelesaikan penelitian dan disertasi ini. Terima kasih pula untuk anak -anak tercinta, Gusti Ayu Sinta Deasy Andani dan Gusti Ngurah Dananjaya Gandhewa, yang senantiasa memberikan warna serta dorongan dalam kehidupan penulis.
Penulis menyadari, bahwa karya ilmiah ini belum sempurna. Oleh karena itu, dengan rendah hati penulis mohon maaf dan berharap semoga karya kecil ini dapat bermanfaat.
Bogor, Desember 2006
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan pada tanggal 4 Juni 1965 di Tabanan, Bali, sebagai putri pertama dari empat bersaudara, dari ayah I Gusti Kayan Suparta (alm.) dan ibu Ni Putu Daning. Pendidikan sarjana dan profesi dokter hewan ditempuh di Program Studi Kedokteran Hewan Universitas Udayana, lulus tahun 1990.
Tahun 1999, penulis memperoleh kesempatan melanjutkan pendidikan program magister di Program Studi Sains Veteriner pada Program Pascasarjana IPB dan menamatkannya pada tahun 2002. Pada tahun dan perguruan tinggi yang sama, penulis memperoleh kesempatan untuk melanjutkan ke program doktor. Beasiswa pendidikan pascasarjana diperoleh dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, Departemen Pendidikan Nasional melalui Biaya Pendidikan Program Pascasarjana (BPPS).
Sejak tahun 1991, penulis mengabdikan diri sebagai staf pengajar di Akademi Medis Veteriner Puragabaya Bandung dan tahun 1993 diangkat menjadi staf pengajar Kopertis Wilayah IV Jawa Barat yang dipekerjakan di Akademi Medis Veteriner Puragabaya Bandung hingga sekarang dan menjadi anggota Himpunan Dokter Hewan Indonesia.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... vii
DAFTAR GAMBAR ... viii
DAFTAR LAMPIRAN ... ix
PENDAHULUAN Latar Belakang ... 1
Rumusan Masalah ... 3
Maksud dan Tujuan ... 4
Manfaat Penelitian ... 4 Hipotesis ... 4 TINJAUAN PUSTAKA Antibodi ... 5 Idiotipe ... 6 Antibodi Anti-idiotipe ... 7
Antibodi Anti-idiotipe sebagai Vaksin ... 11
Produksi Antibodi Anti-idiotipe pada Ayam ... 12
Virus Rabies ... 14
Patogenesis dan Imunitas Rabies ... 15
Vaksin dan Vaksinasi Rabies ... 18
Evaluasi Hasil Vaksinasi Rabies ... 19
BAHAN DAN METODE PENELITIAN Lokasi dan Waktu Penelitian ... 21
Bahan dan Peralatan ... 21
Metode ... 23
Karakterisasi Serum Kuda Anti Rabies (SAR) ... 23
Reidentifikasi Serum Kuda Anti Rabies (SAR) ... 23
Pemotongan Imunoglobulin dan Purifikasi Fragmen F(ab)2 ... 23
Uji Potensi Ab1 ... 24
Produksi Antibodi Anti-idiotipe (Ab2) ... 25
Pengendapan Imunoglobulin Ayam dengan Amonium Sulfat …… 26
Pemurnian IgY dengan Kolom Kromatografi Afinitas ………….. 26
Karakterisasi Antibodi Anti-idiotipe ... 27
Pengukuran Konsentrasi Antibodi Anti-idiotipe (Ab2) ... 28
Imunisasi Kelinci dengan Antibodi Anti-idiotipe (Ab2) ... 28
Pengujian Antibodi Kelinci terhadap Virus Rabies dengan Metode Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ... 29
Kalkulasi dan Interpretasi Hasil Uji ELISA ... 30
Analisis Data ... 31
HASIL DAN PEMBAHASAN Karakterisasi Serum Kuda Anti Rabies ... 32
Reidentifikasi SAR ... 32
Pemotongan Imunoglobulin Kuda Anti Rabies ... 32
Produksi Antibodi Anti-idiotipe (Ab2) pada Ayam ... 35
Purifikasi dan Karakterisasi Imunoglobulin Ayam (IgY) ...…...… 38
Pengukuran Konsentrasi Antibodi Anti-id iotipe (Ab2) ... 44
Imunisasi Kelinc i dengan Antibodi Anti-idiotipe (Ab2) ... 45
Pengujian Serum Kelinci dengan metode AGPT ... 46
Pengujian Antibodi Kelinci terhadap Virus Rabies dengan Metode ELISA ... 50
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan ... ... 56
Saran ... 56
DAFTAR PUSTAKA ... 57
LAMPIRAN ... 63
DAFTAR TABEL
Halaman 1. End-point proteksi 50% populasi mencit dari SAR ………. 34 2. End-point proteksi 50% populasi mencit dari Serum Referensi ………. 34 3. Titer antibodi anti-idiotipe pada serum ayam diuji dengan AGPT ... 36 4. Hasil pengukuran kandungan imunoglobulin yang telah dimurnikan ….. 44 5. Hasil pengujian serum kelinci (Ab3) terhadap antibodi rabies yang
diuji dengan metode ELISA ... 52 6. Hasil pengujian serum kelinci (Ab3) terhadap antibodi rabies dengan
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Skema antibodi dengan det erminan isotypic, allotypic dan idiotypic ... 5
2. Skema kaskade idiotipe (Hiernaux 1988) ………... 10
3. Perbedaan struktur IgY dan IgG (Anonim 2002) ... 13
4. Patogenesis Rhabdovir us (Hunt 2004) ……….. 16
5. Skema penyebaran virus rabies (Baron et al. 2004) ………... 17
6. Garis presipitasi pada uji imunodifusi (AGPT) menunjukkan adanya reaksi homolog antara serum anti rabies (Ab1) dengan vaksin rabies ... 32
7. Skema pemotongan imunoglobulin (A) dengan enzym pepsin, menghasilkan fraksi Fc (B) dan fraksi F(Ab)2 (C) ... 33
8. Garis presipitasi (tanda panah) pada uji imunodifusi (AGPT) menunjukkan adanya reaksi homolog antara antiserum ayam (Ab2) dengan SAR (Ab1) ... 35
9. Grafik Titer Antibodi terhadap Ab1 pada Serum Ayam ... 37
10. Proses pengendapan protein dengan amonium sulfat (A), diperoleh endapan berwarna putih (B) ………. 38
11. Proses dialisis larutan protein menggunakan PBS pH 8,0 ……… 39
12. Pemurnian dengan kromato grafi afinitas spesifik, IgY terdeteksi pada panjang gelombang 280 nm. ………... 40
13. Profil pita protein yang dimurnikan dengan kromatografi afinitas (1 dan 2) dan hasil pengendapan dengan amonium sulfat (3) diband ingkan dengan marker (M) ………. 41
14. Pemekatan larutan IgY menggunakan tabung dialisis dan PEG 6000 di sekeliling tabung ……… 42
15. Pembentukan abses steril di tempat penyuntikan pada kelinci yang diimunisasi dengan Ab2 yang diemulsikan dalam CFA ... 46
16. Serum kelinci (Ab3) bereaksi spesifik dengan virus rabies (V) dan Ab2, ditunjukkan dengan garis presipitasi (tanda panah) yang membentuk pola reaksi identitas sebagian (tanda lingkaran) antara Ab2 dan virus rabies ... 47
17. Ilustrasi pembentukan Ab3, dimana hanya sebagian Ab3 saja yang mempunyai spesifisitas sama dengan serum asal ... 49
18. Pola nilai OD serum kelinci terhadap titer antibodi rabies yang diuji dengan metode ELISA ... 50
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Prosedur kerja pada uji potensi serum anti rabies ... 64
2. Contoh perhitungan uji potensi serum kuda anti rabies (SAR) ... 66
3. Reagensia untuk kromatografi afinitas (Fast Protein Liquid Chromatography = FPLC) ... 67
4. Reagensia untuk ELISA ... 68
5. Perhitungan berat molekul protein ... ... 69
6. Tabel 10. Berat molekul protein pada serum ayam ... 70
7. Tabel 11. Rekapitulasi hasil pembacaan nilai OD Ab3 antibodi rabies pada serum kelinci yang diuji dengan metode ELISA .. ... 71
8. Tabel 12 Hasil pembacaan ELISA OD serum kontrol (+) dan (-) pemerikasaan serum kelinci kontrolpada panjang gelombang 414 nm ... 71
9. Kurva standar serum kontrol ... 71
10. Tabel 13 : Hasil pembacaan ELISA serum kelinci kontrol (diimunisasi dengan NaCl fisiologis) dibandingkan OD serum kontrol (+) dan (-) pada panjang gelombang 414 nm ... 71
11. Tabel 14 : Hasil pembacaan ELISA OD serum kontrol (+) dan (-) pemeriksaan serum kelinci yang diimunisasi dengan Ab2 pada panjang gelombang 414 nm ... 72
12. Kurva standar serum kontrol ... 72
13. Tabel 15: Hasil pembacaan ELISA serum kelinci yang diimunisasi dengan Ab2 dibandingkan OD Serum Kontrol (+) dan (-) pada panjang gelombang 414 nm ... 72
14. Tabel 16 Hasil pembacaan ELISA OD serum kontrol (+) dan (-) pemeriksaan serum kelinci yang diimunisasi dengan vaksin rabies pada panjang gelombang 414 nm ... 73
15. Kurva standar serum kontrol ... …... 73
16. Tabel 17. Hasil pembacaan ELISA serum kelinci yang diimunisasi dengan vaksin rabies dibandingkan OD serum kontrol (+) dan (-) pada panjang gelombang 414 nm... 73
17. Tabel 18. Kadar antibodi spesifik terhadap rabies (Ab3) serum kelinci yang diperiksa dengan metode ELISA. ... 74
18. Tabel 19. Rekapitulasi kadar antibodi spesifik terhadap rabies (Ab3) serum kelinci yang diperiksa dengan metode ELISA ... 75
