3. HASIL PENELITIAN - PENGARUH PENAMBAHAN GARAM 5% DAN 7,5% TERHADAP POTENSI PROBIOTIK BAKTERI ASAM LAKTAT HASIL FERMENTASI ACAR KUBIS PUTIH (Brassica oleracea) ASAL GETASAN, KOPENG - Unika Repository

(1)

16 3.1. Acar Kubis Putih (Brassica oleracea₎

Bahan utama yang digunakan sebagai substrat untuk proses fermentasi acar ini adalah kubis putih yang berasal dari daerah Getasan, Kopeng (Gambar 2a). Garam yang digunakan pada proses fermentasi sebanyak 5% (b/v) dan 7,5% (b/v). Proses fermentasi dilakukan pada suhu ruang 30°C selama 4 hari di dalam inkubator. Setelah selesai waktu fermentasi selama 4 hari, acar kubis putih berubah warna menjadi kuning kecoklatan serta berbau asam khas (Gambar 2b).

(a) (b) (c)

Gambar 2. Kubis Putih (Brassica oleracea) sebagai Bahan Utama Pembuatan Acar (a); Irisan Kubis Putih (b); Acar Kubis Putih Setelah Selesai Fermentasi Selama 4 Hari (c) (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2016)

3.2. Hasil Isolasi Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat hasil fermentasi acar kubis putih dapat diperoleh dengan cara isolasi menggunakan media MRS agar yang diberi tambahan CaCO3 1%. Setelah inkubasi

(2)

Gambar 3. Isolat Bakteri Asam Laktat Hasil Fermentasi pada Kadar Garam 5% yang Ditandai dengan Munculnya Zona Bening di Sekitar Koloni Bakteri (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2016)

3.3. Perhitungan Total Bakteri Asam Laktat (Total Plate Count₎

Koloni bakteri penghasil asam laktat yang ditunjukkan dengan adanya zona bening di sekitar koloni kemudian dilakukan perhitungan untuk mengetahui jumlah total bakteri asam laktat yang tumbuh. Hasil perhitungan jumlah total koloni bakteri asam laktat yang tumbuh dari hasil fermentasi dengan kadar garam 5% lebih banyak dibandingkan hasil fermentasi dengan kadar garam 7,5%. Pada perlakuan kadar garam 5% jumlah koloni yang tumbuh sebanyak 5,3 x 104 CFU/ml, sedangkan pada perlakuan kadar garam 7,5% jumlah koloni yang tumbuh sebanyak 4 x 104 CFU/ml. Koloni bakteri asam laktat yang berupa koloni tunggal dan memiliki zona bening akan dipilih dan diidentifikasi lebih lanjut untuk mengetahui karakteristik morfologi dan biokimianya.

M1 -3

(3)

3.4. Identifikasi Bakteri Asam Laktat

Identifikasi bakteri asam laktat dapat diketahui melalui beberapa pengujian morfologi dan biokimia yang meliputi pewarnaan gram, pewarnaan spora, uji motilitas, uji katalase, dan uji produksi gas. Hasil identifikasi bakteri asam laktat dari acar kubis putih dalam kadar garam 5% dapat dilihat pada Tabel 1 dengan kode isolat M.

Tabel 1. Hasil Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Acar Kubis Putih dalam Kadar Garam 5%

Kode Isolat

Pewarnaan Bentuk Bakteri Aktivitas Katalase Uji Motilitas Produksi Gas Jenis Bakteri

Gram Spora

M1a1 + - batang - - + B

M1a2 + - batang - + + NB

M1a3 + - batang - - + B

M1a4 + - batang - - + B

M1a5 - - batang - - + NB

M1a7 + - batang - - + B

M1a8 - - batang - + + NB

M1a9 + - batang - - + B

M1a11 + - batang - - + B

M1a12 + - batang - - + B

M1a13 + - batang - - + B

M1a14 + - batang - - + B

M1a21 + - batang - - + B

M1a22 + - batang - - + B

M1a23 - - batang - + + NB

M1a25 + - batang - - + B

M3b1 + - batang - - + NB

M3b2 - - batang - + + NB

M3b3 + - batang - - + B

M3b4 - - batang - - + NB

M3b6 + + batang - - + NB

M3b7 + - batang - - + B

(4)

Lanjutan Tabel 1. Hasil Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Acar Kubis Putih dalam Kadar Garam 5%

Kode Isolat

Pewarnaan Bentuk Bakteri Aktivitas Katalase Uji Motilitas Produksi Gas Jenis Bakteri

Gram Spora

M3b9 + - batang - - + B

M3b10 + - batang - - + B

M3b11 + - batang - - + B

M3b12 + - batang - - + B

M3b14 + - batang - - + B

M3b15 + - batang - - + B

M3b16 + - batang - + + NB

M3b17 + - batang - - + B

M3b18 + - batang - - + B

M3b19 + - batang - - + B

M3b21 + - batang - - + B

M3b23 + - batang - - + NB

M3b25 + - batang - - + B

Keterangan:

M1a_ = isolat berasal dari ulangan ke 1 pada pengenceran 10-3

M3b_ = isolat berasal dari ulangan ke 3 pada pengenceran 10-4

Pewarnaan Gram = (+) Gram positif; (-) Gram negatif

Pewarnaan Spora = (+) membentuk spora; (-) tidak membentuk spora

Katalase = (+) Katalase positif; (-) Katalase negatif

Motilitas = (+) motil; (-) non-motil

Produksi Gas = (+) menghasilkan gas; (-) tidak menghasilkan gas

Jenis Bakteri = (B) Bakteri Asam Laktat; (NB) Bukan Bakteri Asam Laktat

(5)

Hasil identifikasi bakteri asam laktat dari acar kubis putih dalam kadar garam 7,5% dilihat pada Tabel 2 dengan kode isolat Y.

Tabel 2. Hasil Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Acar Kubis Putih dalam Kadar Garam 7,5%

Kode Isolat

Pewarnaan Bentuk Bakteri Aktivitas Katalase Uji Motilitas Produksi Gas Jenis Bakteri Gram Spora

Y2a1 + - batang - - + B

Y2a2 + - batang - + + NB

Y2a3 + - batang - - + B

Y2a4 + - batang - - + B

Y2a5 + - batang - - + B

Y2a6 + + batang - - - NB

Y2a7 - - batang - - + NB

Y2a8 + - batang - - + B

Y2a9 + - batang - - + B

Y2a10 - - batang - - + NB

Y2a13 + - batang - - + B

Y2a14 + - batang - - + B

Y3b1 + - batang - - + B

Y3b2 + - batang - - + B

Y3b3 + - batang - - + B

Y3b4 + - batang - - + B

Y3b5 + - batang - + + NB

Y3b8 + - batang - - + B

Y3b9 + + batang - + + NB

Y3b10 + - batang - - + B

Y3b11 + - batang - - - B

Y3b12 - - batang - - + NB

Y3b13 + - batang - - - B

Y3b15 + - batang - - + B

Y3b16 + - batang - - - B

Y3b17 + - batang - - - B

Y3b18 + - batang - - + NB

Y3b19 + - batang - - - NB

Y3b20 + - batang - - + B

Y3b21 + - batang - - + B

Y3b22 + + batang - + + NB

(6)

Lanjutan Tabel 2. Hasil Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Acar Kubis Putih dalam Kadar Garam 7,5%

Kode Isolat

Pewarnaan Bentuk Bakteri

Aktivitas Katalase

Uji Motilitas

Produksi Gas

Jenis Bakteri Gram Spora

Y3b26 + - batang - - + B

Y3b27 + - batang - - - B

Y3b29 + - batang - - + B

Y3b30 + - batang - - + B

Y3b32 + - batang - - + B

Y3b34 - - batang - - + NB

Keterangan:

Y2a_ = isolat berasal dari ulangan ke 2 pada pengenceran 10-3

Y3b_ = isolat berasal dari ulangan ke 3 pada pengenceran 10-4

Pewarnaan Gram = (+) Gram positif; (-) Gram negatif

Pewarnaan Spora = (+) membentuk spora; (-) tidak membentuk spora

Katalase = (+) Katalase positif; (-) Katalase negatif

Motilitas = (+) motil; (-) non-motil

Produksi Gas = (+) menghasilkan gas; (-) tidak menghasilkan gas

Jenis Bakteri = (B) Bakteri Asam Laktat; (NB) Bukan Bakteri Asam Laktat

(7)

3.4.1. Hasil Uji Pewarnaan Gram

Isolat bakteri yang berupa koloni tunggal dan memiliki zona bening selanjutnya diambil untuk dilakukan uji pewarnaan Gram. Hasil pengamatan bakteri yang tumbuh pada kadar garam 5% dan 7,5% sebagian besar termasuk ke dalam jenis bakteri asam laktat. Hal ini dapat ditunjukkan pada Gambar 4a, di mana terlihat warna ungu pada sel bakteri yang menandakan bahwa bakteri tersebut merupakan bakteri asam laktat (Gram positif). Namun ada juga beberapa bakteri yang bukan termasuk bakteri asam laktat yang terlihat dari sel bakteri yang berwarna merah (Gram negatif) pada Gambar 4b.

(a) (b)

(8)

3.4.2. Hasil Uji Pewarnaan Spora

Pewarnaan spora dalam pengujian ini dilakukan untuk mengetahui bakteri yang menghasilkan spora atau tidak. Bakteri asam laktat tidak menghasilkan spora sehingga isolat bakteri bewarna merah (Gambar 5a), sedangkan bakteri yang menghasilkan spora akan berwarna hijau dan bukan dikategorikan sebagai bakteri asam laktat (Gambar 5b). Dari hasil uji pewarnaan spora ini terdapat 1 isolat bakteri dari hasil fermentasi dengan kadar garam 5% dan 4 isolat bakteri dari hasil fermentasi dengan kadar garam 7,5% yang berwarna hijau.

(a) (b)

Gambar 5. Hasil Uji Pewarnaan Spora Isolat M3b14 yang Berwarna Merah (a); Hasil Uji Pewarnaan Spora Isolat M3b6 yang Berwarna Hijau (lihat tanda panah) (b) pada Perbesaran Mikroskop 10x100 (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2016)

3.4.3. Hasil Uji Motilitas

(9)

(a) (b)

Gambar 6. Hasil Uji Motilitas Isolat Y3b11 yang Non Motil (a); Hasil Uji Motilitas Isolat Y3b14 yang Motil (b) (lihat tanda panah) (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2016)

3.4.4. Hasil Uji Aktivitas Katalase

Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang memiliki sifat katalase negatif, yang tidak menunjukkan adanya gelembung gas pada pengujian aktivitas katalase. Dari hasil uji aktivitas katalase ini dapat diketahui bahwa secara keseluruhan hasil fermentasi dengan kadar garam 5% dan 7,5% merupakan bakteri asam laktat karena tidak ditandai dengan adanya gelembung gas (katalase negatif) (Gambar 7).

Gambar 7. Hasil Uji Aktivitas Katalase Isolat Y3b8, Y2a2, dan M3b8 yang Menunjukkan Katalase Negatif (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2016) 3.4.5. Hasil Uji Produksi Gas

Uji produksi gas dilakukan untuk mengetahui sifat fermentasi dari isolat bakteri asam laktat. Dari hasil uji produksi gas ini dapat diketahui bahwa hasil fermentasi dengan kadar garam 5% dan 7,5% mengasilkan isolat bakteri yang bersifat homofermentatif dan heterofermentatif. Isolat bakteri asam laktat yang bersifat heterofermentatif ditandai

Y3b11 Y3b14

(10)

dengan adanya gelembung gas di dalam tabung Durham (Gambar 8a), sementara pada bakteri asam laktat yang bersifat homofermentatif tidak ada gelembung gas pada tabung Durham (Gambar 8b).

(a) (b)

Gambar 8. Hasil Uji Produksi Gas Isolat Bakteri Y3b4 yang Bersifat Heterofermentatif (lihat tanda panah) (a) dan Isolat Bakteri Y3b17 yang Bersifat Homofermentatif (b) (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2016) 3.5. Hasil Identifikasi Genus Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan

Pertumbuhannya

Berdasarkan pengujian morfologi dan biokimia, sebanyak 52 isolat terseleksi sebagai bakteri asam laktat. Isolat yang termasuk bakteri asam laktat tersebut dilakukan identifikasi lebih lanjut untuk mengetahui genus bakteri asam laktat. Identifikasi genus bakteri asam laktat dapat diketahui melalui pengujian kemampuan pertumbuhannya pada berbagai kadar NaCl (6,5% dan 18%), suhu (10°C dan 45°C), dan kondisi pH (4,4 dan 9,6). Pertumbuhan isolat bakteri asam laktat dilihat dari hasil nilai absorbansi yang diperoleh pada jam ke-24 sampai jam ke-48. Hasil identifikasi genus bakteri asam laktat berdasarkan kemampuan pertumbuhannya di berbagai kadar NaCl, suhu dan pH pada acar kubis dengan kadar garam 5% dapat dilihat pada Tabel 3.

Y3b4 Y3b17

(11)

Tabel 3. Hasil Identifikasi Genus Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Pertumbuhan di Berbagai kadar NaCl, suhu dan pH pada Acar Kubis dengan Kadar Garam 5%

No. Isolat NaCl Suhu pH Genus

6,5% 18% 10°C 45°C 4,4 9,6

1 M1a1 + - - - + + Lactobacillus*

2 M1a3 + - - + + + Lactobacillus*

13 M3b3 + - - - + + Lactobacillus*

14 M3b7 + - - + + + Lactobacillus*

15 M3b8 + - - + + - Lactobacillus

17 M3b10 + + - - + + Lactobacillus*

20 M3b14 + + - - + + Lactobacillus*

23 M3b18 + - - - + - Lactobacillus*

Keterangan: + = tumbuh

- = tidak tumbuh

(12)

Hasil identifikasi genus bakteri asam laktat berdasarkan kemampuan pertumbuhannya di berbagai kadar NaCl, suhu dan pH pada acar kubis dengan kadar garam 7,5% dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Hasil Identifikasi Genus Bakteri Asam Laktat Berdasarkan Kemampuan Pertumbuhan di Berbagai kadar NaCl, suhu dan pH pada Acar Kubis dengan Kadar Garam 7,5%

No. Isolat NaCl Suhu pH Genus

6,5% 18% 10°C 45°C 4,4 9,6

1 Y2a1 + - - - + + Lactobacillus*

9 Y3b1 + - - + + + Lactobacillus*

10 Y3b2 + - - - + + Lactobacillus*

12 Y3b4 + - - + + - Lactobacillus

14 Y3b10 + - - - + - Lactobacillus*

Keterangan: + = tumbuh

- = tidak tumbuh

* = bakteri asam laktat yang diduga Lactobacillus

(13)

pada kondisi pH 4,4 dan kadar NaCl 6,5%. Selain itu, terdapat sebanyak 48 isolat bakteri asam laktat pada acar kubis dengan kadar garam 5% dan 7,5% termasuk dalam bakteri Lactobacillus yang beradaptasi.

3.6. Potensi Probiotik Bakteri Asam Laktat

Sebanyak 52 isolat bakteri asam laktat yang sudah diidentifikasi genusnya, selanjutnya dilakukan pengujian lebih lanjut untuk mengetahui potensi probiotiknya. Potensi probiotik bakteri asam laktat dapat diketahui melalui beberapa pengujian yang meliputi pengujian ketahanan terhadap asam (pH 3 dan pH 7), ketahanan terhadap garam empedu, dan pengujian aktivitas antimikroba.

3.6.1. Hasil Pengujian Ketahanan Terhadap Asam

(14)

Gambar 9. Hasil Pengujian Ketahanan Isolat M1a3 Terhadap pH 3 pada Jam ke 0 (a-i), Jam ke 1,5 (a-i(a-i), dan Jam ke 3 (a-ii(a-i), serta Ketahanan Isolat M1a3 Terhadap pH 7 pada Jam ke 0 (b-i), Jam ke 1,5 (b-ii), dan Jam ke 3 (b-iii) (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2017)

3.6.2. Hasil Pengujian Ketahanan Terhadap Garam Empedu

Selain tahan terhadap asam, bakteri asam laktat yang termasuk dalam bakteri probiotik harus memiliki ketahanan terhadap garam empedu di dalam saluran pencernaan manusia. Di dalam pengujian ini, apabila isolat bakteri asam laktat mampu tumbuh pada media MRS B yang diberi penambahan garam empedu 0,3% pada jam ke 0, 2, dan 4 maka isolat bakteri asam laktat tersebut dinyatakan tahan terhadap garam empedu. Dari hasil pengamatan yang diperoleh, menunjukkan bahwa keseluruhan isolat bakteri asam laktat (ada 52 isolat) mampu tumbuh pada media MRS B yang telah diberi penambahan garam empedu pada jam ke 0, 2, dan 4 yang ditandai dengan adanya kekeruhan pada media MRS A. Hasil pengujian ketahanan terhadap garam empedu pada isolat M1a4 dapat dilihat pada Gambar 10.

a-i a-ii a-iii

(15)

Gambar 10. Hasil Pengujian Ketahanan Isolat M1a4 Terhadap Garam Empedu pada Jam ke 0 (a), Jam ke 2 (b), dan Jam ke 4 (c) (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2017)

3.6.3. Hasil Pengujian Aktivitas Antimikroba

Bakteri asam laktat yang tergolong probiotik memiliki senyawa antimikroba dalam menghambat pertumbuhan mikroorganisme patogen. Di dalam pengujian ini, digunakan mikroorganisme patogen jenis Escherichia coli FNCC 0091 dan Staphylococcus aureus FNCC 0047. Isolat bakteri asam laktat yang memiliki aktivitas antimikroba terhadap bakteri patogen dapat diketahui dengan melihat adanya zona bening pada sekitar lubang sumuran. Zona bening yang terbentuk dari isolat Y3b20 terhadap bakteri patogen S. aureus FNCC 0047 dan E. coli FNCC 0091 dapat dilihat pada Gambar 11.

Keterangan: k = kontrol; 1, 2, 3 = ulangan

Gambar 11. Zona bening yang terbentuk dari isolat Y3b20 terhadap bakteri patogen S. aureus FNCC 0047 (a); dan E. coli FNCC 0091 (b) (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2017)

a b c

a b

1 1

2

2 3

K K

(16)

Zona bening yang dihasilkan oleh isolat bakteri asam laktat dalam menghambat bakteri patogen Staphylococcus aureus dan Escherichia coli selanjutnya diukur diameternya (mm) dengan menggunakan jangka sorong. Hasil pengujian aktivitas antimikroba bakteri asam laktat terhadap bakteri patogen Staphylococcus aureus FNCC 0047 dan Escherichia coli FNCC 0091 pada acar kubis dengan kadar garam 5% dapat dilihat pada

Tabel 5.

Tabel 5. Hasil Pengujian Aktivitas Antimikroba Bakteri Asam Laktat terhadap Bakteri Patogen Staphylococcus aureus FNCC 0047 dan Escherichia coli FNCC 0091 pada Acar Kubis dengan Kadar Garam 5%

Isolat

Diameter Zona Bening (mm) Staphylococcus aureus

FNCC 0047

Escherichia coli FNCC 0091

M1a1 7,87 ± 0,44 7,45 ± 0,78

M1a3 8,64 ± 0,44 9,14 ± 0,67

M1a4 9,31 ± 0,29 -

M1a7 10,92 ± 1,16 -

M1a9 11,18 ± 0,25 -

M1a11 11,43 ± 0,44 -

M1a12 10,16 ± 1,27 9,14 ± 0,92

M1a13 13,63 ± 0,15 -

M1a14 6,77 ± 1,20 10,75 ± 2,07

M1a21 8,30 ± 0,39 8,21 ± 0,78

M1a22 9,91 ± 0,25 10,16 ± 0,44

M1a25 11,18 ± 0,25 -

M3b3 8,81 ± 0,15 7,11 ± 0,72

M3b7 6,77 ± 0,53 5,34 ± 0,36

M3b8 9,14 ± 0,44 8,13 ± 0,44

M3b9 6,60 ± 0,51 5,59 ± 0,88

M3b10 9,99 ± 1,80 -

M3b11 10,75 ± 1,55 -

M3b12 10,16 ± 1,16 8,89 ± 0,92

M3b14 7,62 ± 0,51 7,03 ± 1,63

M3b15 10,58 ± 0,53 -

M3b17 11,09 ± 0,82 11,30 ± 1,26

M3b18 6,35 ± 0,92 5,59 ± 0,92

M3b19 8,81 ± 0,53 8,72 ± 0,82

M3b21 10,16 ± 1,52 6,22 ± 0,54

M3b25 8,38 ± 1,16 5,59 ± 0

(17)

Hasil pengujian aktivitas antimikroba bakteri asam laktat terhadap bakteri patogen Staphylococcus aureus FNCC 0047 dan Escherichia coli FNCC 0091 pada acar kubis dengan kadar garam 7,5% dapat dilihat pada Tabel 6.

Tabel 6. Hasil Pengujian Aktivitas Antimikroba Bakteri Asam Laktat terhadap bakteri patogen Staphylococcus aureus FNCC 0047 dan Escherichia coli FNCC 0091 pada Acar Kubis dengan Kadar Garam 7,5%

Isolat

Diameter Zona Bening (mm) Staphylococcus aureus

FNCC 0047

Escherichia coli FNCC 0091

Y2a1 9,65 ± 0,92 12,45 ± 3,08

Y2a3 9,57 ± 2,29 7,37 ± 1,27

Y2a4 11,85 ± 0,64 9,65 ± 1,59

Y2a5 8,64 ± 0,92 10,84 ± 0,39

Y2a8 11,68 ± 1,11 8,64 ± 1,08

Y2a9 9,06 ± 0,82 8,30 ± 1,40

Y2a13 11,85 ± 0,64 11,43 ± 0,44

Y2a14 11,09 ± 1,94 7,28 ± 2,05