3. HASIL PENELITIAN 3.1. Fermentasi Acar Kubis - AKTIVITAS PROBIOTIK BAKTERI ASAM LAKTAT HASIL FERMENTASI ACAR KUBIS PUTIH (Brassica oleracea) TAWANGMANGU, SURAKARTA DENGAN PERLAKUAN GARAM 5% DAN 7,5% - Unika Repository

(1)

15 3.1. Fermentasi Acar Kubis

Fermentasi kubis dilakukan dengan menggunakan kubis segar yang diambil langsung dari perkebunan Gondosuli, Tawangmangu, Surakarta, Jawa Tengah. Proses fermentasi dilakukan dengan 2 perlakuan yang berbeda, yaitu proses fermentasi dengan kadar garam 5% dan 7,5%. Proses inkubasi dilakukan pada suhu ruang, yaitu 30˚C selama 3 hari. Acar kubis hasil fermentasi dapat dilihat pada Gambar 3. Acar kubis yang dihasilkan memiliki penampakan air yang keruh keputihan. Pada hasil fermentasi acar kubis juga tidak terlihat adanya tanda-tanda kontaminasi, terutama kontaminasi kapang. Jumlah total hasil fermentasi acar kubis adalah 6 toples, yang terdiri dari 3 toples merupakan acar kubis dengan kadar 5% dan 3 toples dari fermentasi dengan kadar garam 7,5%.

Gambar 3. Acar Kubis Hasil Fermentasi : dengan Kadar Garam 5% (a); dan Kadar Garam 7,5% (b) (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017)

3.2. Isolasi Bakteri Asam Laktat

Proses isolasi dilakukan menggunakan metode spread plate dengan media MRSA yang mengandung CaCO3 1%. Koloni yang muncul dan membentuk zona bening merupakan bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat yang berukuran besar dan membentuk koloni tunggal seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4 merupakan bakteri yang diambil atau dipanen untuk diuji. Koloni bakteri tunggal yang membentuk zona bening dihitung menggunakan colony counter. Hasil perhitungan didapatkan jumlah koloni sebanyak

(2)

2,27 x 107 log CFU/ml pada hasil fermentasi dengan kadar garam 5% dan 5,00 x 107 log CFU/ml pada hasil fermentasi dengan kadar garam 7,5%.

Gambar 4. Hasil Isolasi Bakteri Asam Laktat dari Acar Kubis dengan Kadar Garam 5% dengan Pengenceran 10-5 (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017)

3.3. Uji Morfologikal dan Biokimia Bakteri Asam Laktat

Hasil identifikasi bakteri asam laktat yang berasal dari hasil fermentasi dengan kadar garam 5% dapat dilihat pada Tabel 1 dengan kode “S”, dan kode “C” menunjukkan hasil pengenceran 10-5.

(3)

Tabel 1. Hasil Identifikasi Morfologi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi dengan Kadar Garam 5%

Isolat

Morfologi Biokimia

Jenis Bakteri Bentuk

Sel

Pewarnaan

Motilitas Katalase Produksi Gas Gram Spora

S1C1 b + - - - + BAL

S1C2 b - - - - + NB

S1C3 b + - - - + BAL

S1C4 b + - - - + BAL

S1C5 b + - - - + BAL

S1C6 b - - - - + NB

S1C7 b - - - - + NB

S1C8 b - - - - + NB

S1C9 b - - + - + NB

S1C10 b + - - - + BAL

S3C1 b + - + - + NB

S3C2 b + - - - + BAL

S3C3 b + - - - + BAL

S3C4 b + - - - + BAL

S3C5 b + - + - + NB

S3C6 b + - + - + NB

S3C7 b + - - - + BAL

S3C8 b - - - - + NB

S3C9 b - - - - + NB

S3C10 b + - - - + BAL

S3C11 b + - - - + BAL

S3C12 b - - - - + NB

S3C13 b + - - - + BAL

S3C14 b - - - - + NB

S3C15 b + - - - + BAL

S3C16 b - - - - + NB

S3C17 b - - - - + NB

S3C18 b - - - - + NB

S3C19 b + - + - + NB

S3C20 b + - - - + BAL

S3C21 b - - - - + NB

S3C22 b + - - - + BAL

S3C23 b + - - - + BAL

S3C24 b - - - - + NB

S3C25 b - - - - + NB

S3C26 b + - - - + BAL

S3C27 b + - - - + BAL

S3C28 b + - - - + BAL

(4)

Lanjutan Tabel 1.

S3C30 b + - + - + NB

S3C31 b + - - - + BAL

S3C32 b + - - - + BAL

S3C33 b + - - - + BAL

S3C34 b + - - - + BAL

S3C35 b + - - - + BAL

S3C36 b - - - - + NB

S3C37 b + - + - + NB

S3C38 b + - - - + BAL

S3C39 b + - - - + BAL

S3C40 b + - - - + BAL

Keterangan : (+) : positif (-) : negatif

(b) : batang/ bacil

(BAL) : Bakteri Asam Laktat (NB) : Non Bakteri Asam Laktat

Pada Tabel 1 diketahui bahwa isolat yang diuji seluruhnya memiliki bentuk yang sama yaitu berbentuk batang atau bacil. Hasil uji pewarnaan Gram diperoleh bahwa dari 50 isolat yang diuji, 33 isolat diantaranya merupakan gram positif. Hasil uji pewarnaan spora dan katalase didapatkan bahwa keseluruhan isolat yang diuji memiliki hasil yang negatif. Hasil uji motilitas didapatkan sebanyak 43 isolat merupakan bakteri nonmotil. Hasil uji produksi gas seluruh isolat menunjukkan hasil positif. Berdasarkan uji pewarnaan Gram, pewarnaan spora, motilitas, dan katalase didapatkan sebanyak 27 isolat dari fermentasi dengan kadar garam 5% merupakan isolat bakteri asam laktat yang digunakan untuk uji selanjutnya.

(5)

Tabel 2. Hasil Identifikasi Morfologi Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi dengan Kadar Garam 7,5%

Isolat Bentuk Sel

Morfologi Biokimia

Jenis Bakteri Pewarnaan

Motilitas Katalase Produksi Gas Gram Spora

T1C1 b + - + - + NB

T1C2 b + - - - + BAL

T1C3 b + - + - + NB

T1C4 b + - - - + BAL

T1C5 b - - + - + NB

T1C6 b + - + - + NB

T1C7 b + - - - + BAL

T1C8 b + - - - + BAL

T1C9 b - - - - + NB

T1C10 b + - - - + BAL

T1C11 b - - + - + NB

T1C12 b - - - - + NB

T1C13 b + - - - + BAL

T1C14 b - - - - + NB

T1C15 b + - - - + BAL

T1C16 b - - - - + NB

T1C17 b + - - - + BAL

T1C18 b + - - - + BAL

T1C19 b - - + - + NB

T1C20 b - - + - + NB

T1C21 b + - - - + BAL

T1C22 b - - + - + NB

T1C23 b + - + - + NB

T1C24 b + - - - + BAL

T1C25 b + - - - + BAL

T1C26 b + - - - + BAL

T1C27 b + - + - + NB

T1C28 b + - - - + BAL

T1C29 b + - - - + BAL

T1C30 b + - - - + BAL

T2C1 b + - - - + BAL

T2C2 b + - - - - BAL

T2C3 b + - + - + NB

T2C4 b - - + - + NB

T2C5 b + - + - + NB

T2C6 b + - + - + NB

T2C7 b + - - - + BAL

T2C8 b + - - - + BAL

(6)

Lanjutan Tabel 2.

T2C10 b + - - - - BAL

T2C11 b - - - - + NB

T2C12 b + - + - - NB

T2C13 b + - - - + BAL

T2C14 b + - - - + BAL

T2C15 b + - - - + BAL

T3C1 b - - - + + NB

T3C2 b - - - - + NB

T3C3 b + - - - + BAL

T3C4 b + - - - + BAL

T3C5 b + - - - + BAL

Keterangan : (+) : positif (-) : negatif

(b) : batang/ bacil

(BAL) : Bakteri Asam Laktat (NB) : Non Bakteri Asam Laktat

Berdasarkan Tabel 2, didapatkan bahwa seluruh isolat yang berasal dari hasil fermentasi dengan kadar garam 7,5% memiliki bentuk sel bakteri berbentuk batang atau bacil. Hasil pewarnaan spora menunjukkan bahwa seluruh isolat tidak menghasilkan spora, sedangkan hasil pewarnaan gram menunjukkan sebanyak 36 isolat merupakan bakteri gram positif. Hasil uji motilitas sebanyak 34 isolat merupakan bakteri nonmotil. Hasil uji biokimia dapat dilihat bawah dari 50 isolat yang diuji didapatkan 1 isolat memiliki hasil katalase positif, dan 3 isolat tidak memproduksi gas. Berdasarkan uji pewarnaan gram, pewarnaan spora, motilitas, dan katalase didapatkan sebanyak 27 isolat merupakan bakteri asam laktat. Isolat yang telah teridentifikasi sebagai bakteri asam laktat selanjutnya digunakan untuk diidentifikasi yang terdiri dari identifikasi genus dan aktivitas probiotiknya.

3.3.1. Pewarnaan Gram

(7)

Gambar 5. Hasil Pewarnaan Gram pada Isolat S3C19 Mengguankan Mikroskop dengan Perbesaran 100 x 10 dengan Sel Berwarna Ungu (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017)

3.3.2. Pewarnaan Spora

Uji pewarnaan spora dapat digunakan untuk menggolongkan bakteri menjadi 2, yaitu bakteri penghasil spora dan yang tidak menghasilkan spora. Bakteri penghasil spora akan menghasilkan warna hijau sedangkan bakteri yang tidak menghasilkan spora tidak akan menghasilkan warna hijau pada uji pewarnaan spora. Bakteri asam laktat merupakan bakteri yang tidak menghasilkan spora, sehingga tidak akan memunculkan warna hijau pada hasil pewarnaan spora seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6.

(8)

3.3.3. Uji Motilitas

Uji motilitas menjadi salah satu faktor penentu agar isolat dapat digolongkan menjadi bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat memiliki ciri tidak dapat bergerak. Oleh karena itu pada uji motilitas, bakteri asam laktat memiliki hasil yang negatif atau non-motil. Uji motilitas dapat dilihat dengan melihat area tujukan isolat pada media agar. Bakteri asam laktat akan tumbuh diarea tusukan tanpa mebentuk benjolan-benjolan seperti pada Gambar 7 yang merupakan bakteri non-motil.

Gambar 7. Hasil Uji Motilitas : Isolat T1C9 sebagai Bakteri Nonmotil (a); dan Isolat S3C37 sebagai Bakteri Motil (b) (lihat tanda panah) (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017)

3.3.4. Uji Katalase

Uji katalase dilakukan dengan mereaksikan 1 ose isolat dengan larutan H2O2 3%. Isolat yang memiliki karakteristik sebagai katalase positif akan menghasilkan gelembung ketika diuji, sedangkan yang termasuk dalam katalase negatif tidak akan muncul gelembung pada saat diuji. Bakteri asam laktat termasuk dalam katalase negatif, sehingga saat diuji tidak akan menghasilkan gelembung seperti pada Gambar 8.

(9)

Gambar 8. Hasil Uji Katalase Negatif dari Isolat T1C3, T1C8, dan T1C18 (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017)

3.3.5. Uji Produksi Gas

Uji produksi gas digunakan untuk mengetahui karakteristik bakteri atau isolat yang diuji. Bakteri asam laktat dibedakan menjadi 2 jenis berdasarkan produk fermentasinya, yaitu bakteri asam laktat homofermentatif (tidak memproduksi gas) dan heterofermentatif (memproduksi gas). Metode uji produksi gas menggunakan tabung durham. Jika pada tabung durham tidak terdapat gelembung atau rongga udara maka isolat yang diuji merupakan isolat yang memproduksi gas, sedangkan yang tidak terdapat rongga udaranya maka merupakan bakteri yang tidak memproduksi gas seperti pada Gambar 9.

Gambar 9. Hasil Uji Produksi Gas; Isolat S3C20 sebagai Bakteri yang Memproduksi Gas (a); Isolat T2C12 sebagai Bakteri yang Tidak Memproduksi Gas (b) (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017)

(a) (b)

Gelembung udara

(10)

3.4. Identifikasi Genus Bakteri Asam Laktat dengan Uji Pertumbuhan pada Kadar Garam, Suhu, dan pH Berbeda

Hasil identifikasi genus bakteri asam laktat hasil fermentasi dengan kadar garam 5% dapat dilihat pada Tabel 3.

Tabel 3. Hasil Identifikasi Genus Isolat dari Fermentasi dengan Kadar Garam 5%

Isolat NaCl (%) Suhu (˚C) pH Genus

6,5 18 10 45 4,4 9,6

S1C1 + - + + + - Lactobacillus

S1C3 - - - - + + Lactobacillus*

S1C4 - - + - + + Lactobacillus*

S1C5 + - + - + - Lactobacillus

S1C10 - - + - + + Lactobacillus*

S3C2 + - + - + + Lactobacillus*

S3C3 + - + + + + Lactobacillus*

S3C7 + - - + + + Lactobacillus*

S3C15 + - + - + - Lactobacillus

S3C20 - - + + + + Lactobacillus*

Keterangan : (+) : tumbuh (-) : tidak tumbuh

(11)

Berdasarkan Tabel 3 dapat dilihat bahwa pada kadar garam 6,5% dari 27 isolat yang diuji sebanyak 21 isolat dapat bertahan dan bertumbuh, sedangkan pada kadar garam 18% seluruh isolat yang diuji tidak dapat tumbuh. Pada hasil uji pertumbuhan terhadap suhu, didapatkan bahwa sebanyak 25 isolat dapat tumbuh pada suhu 10˚C dan sebanyak 16 isolat dapat tumbuh pada suhu 45˚C. Hasil uji pertumbuhan terhadap pH menunjukkan bahwa seluruh isolat dapat tumbuh pada pH 4,4 dan hanya 3 isolat yang tidak dapat tumbuh pada pH 9,6. Hasil tersebut sebanyak 3 isolat menunjukkan karakteristik genus Lactobacillus, sedangkan 24 lainnya sebagai genus Lactobacillus

yang dapat beradaptasi.

Hasil identifikasi genus bakteri asam laktat hasil fermentasi dengan kadar garam 7,5% dapat dilihat pada Tabel 4.

Tabel 4. Hasil Identifikasi Genus Bakteri Asam Laktat dari Fermentasi dengan Kadar Garam 7,5%

Isolat NaCl (%) Suhu (˚C) pH Genus

6,5 18 10 45 4,4 9,6

T1C2 - - - - + + Lactobacillus*

T1C4 + - - - + + Lactobacillus*

T1C7 + - - + + + Lactobacillus*

T1C17 - - - + + + Lactobacillus*

T1C18 + - - + + + Lactobacillus*

T1C24 + - + - + + Lactobacillus*

T1C25 + - + + + + Lactobacillus*

T1C26 - - - + + + Lactobacillus*

(12)

Lanjutan Tabel 4.

T3C3 + - + - + - Lactobacillus

Keterangan : (+) : tumbuh (-) : tidak tumbuh

(*) : Genus Lactobacillus yang dapat beradaptasi

Berdasarkan Tabel 4 didapat sebanyak 21 isolat dari 27 isolat dapat tumbuh pada kadar garam 6,5%, sedangkan pada kadar garam 18% seluruh isolat tidak dapat tumbuh. Pada hasil uji suhu didapatkan sebanyak 14 isolat dapat tumbuh pada suhu 10˚C dan sebanyak 9 isolat dapat tumbuh pada suhu 45˚C. Seluruh isolat yang diuji memiliki kemampuan bertumbuh pada pH 4,4, sedangkan pada pH 9,6 terdapat 1 isolat tidak dapat tumbuh. Berdasarkan hasil tersebut, didapatkan 1 isolat yang memiliki karakteristik sebagai genus Lactobacillus, sedangkan 26 isolat lainnya sebagai genus

Lactobacillus yang dapat beradaptasi.

3.5. Uji Potensi Aktivitas Probiotik Bakteri Asam Laktat

3.5.1. Uji Aktivitas Probiotik

(13)

Tabel 5. Uji Aktivitas Probiotik pada Bakteri Asam Laktat dari Hasil Fermentasi dengan Kadar Garam 5% dan 7,5%

Isolat

Antimikroba Ketahanan Asam Ketahanan

Garam Empedu

Escherichia coli

FNCC 0091(mm)

Staphylococcus aureus

FNCC 0047 (mm)

pH 3 pH 7

S1C1 7,45±0,39 6,43±0,29 + + +

S1C3 7,54±0,39 6,01±0,15 + + +

S1C4 8,30±0,82 6,60±0,76 + + +

S1C5 9,06±0,53 6,52±0,89 + + +

S1C10 7,54±0,64 5,67±0,29 + + +

S3C2 8,47±1,63 5,50±0,53 + + +

S3C3 8,21±1,80 5,93±0,29 + + +

S3C4 6,01±0,53 7,62±1,34 + + +

S3C7 8,81±0,59 7,45±0,29 + + +

S3C10 7,54±0,15 7,03±0,15 + + +

S3C11 8,21±0,39 8,38±0,25 + + +

S3C13 6,69±1,49 6,10±0,51 + + +

S3C15 5,16±1,03 6,43±0,78 + + +

S3C20 7,20±0,78 5,84±0,25 + + +

S3C22 7,45±0,29 5,59±1,55 + + +

S3C23 5,50±0,15 6,94±0,73 + + +

S3C26 8,13±0,88 7,28±0,15 + + +

S3C27 8,72±0,64 6,52±0,89 + + +

S3C28 4,49±0,64 6,18±0,39 + + +

S3C31 7,37±1,02 6,60±0,51 + + +

S3C32 - 7,37±0,25 + + +

S3C33 8,30±0,82 6,94±0,53 + + +

S3C34 6,18±0,39 6,94±0,82 + + +

S3C35 5,93±0,82 6,94±0,53 + + +

S3C38 6,69±1,17 7,37±0,44 + + +

S3C39 7,62±1,02 7,37±1,27 + + +

S3C40 - 7,28±0,73 + + +

T1C2 - 6,35±0,00 + + +

T1C4 7,11±1,41 7,54±0,89 + + +

T1C7 7,03±0,89 8,21±0,39 + + +

T1C8 - 8,04±0,39 + + +

T1C10 8,72±0,39 7,79±0,53 + + +

T1C13 - 9,57±0,15 + + +

T1C15 - 7,11±0,25 + + +

T1C17 5,16±0,15 9,06±0,59 + + +

T1C18 4,74±0,29 5,84±0,25 + + +

(14)

Lanjutan Tabel 5.

T1C24 7,79±1,40 7,28±0,29 + + +

T1C25 - 7,03±1,06 + + +

T1C26 5,84±0,88 5,84±0,67 + + +

T1C28 6,43±1,15 10,08±0,53 + + +

T1C29 8,21±0,78 5,93±0,53 + + +

T1C30 6,35±0,25 7,20±0,96 + + +

T2C1 8,55±0,15 5,50±0,15 + + +

T2C2 9,31±0,82 9,06±0,78 + + +

T2C7 7,62±1,41 6,27±0,15 + + +

T2C8 9,91±0,44 7,54±0,29 + + +

T2C10 10,16±1,16 8,64±0,44 + + +

T2C13 9,99±1,15 9,31±0,64 + + +

T2C14 - 8,30±0,59 + + +

T2C15 9,82±0,59 9,65±0,92 + + +

T3C3 6,69±0,96 7,03±0,29 + + +

T3C4 9,82±0,39 7,79±0,15 + + +

T3C5 7,20±0,29 7,20±0,29 + + +

Pada hasil uji antimikroba (Tabel 5) menunjukkan bahwa seluruh isolat memiliki hasil positif pada uji ketahanan asam (pH 3 dan pH 7) dan garam empedu 0,3%. Oleh sebab itu, seluruh isolat memiliki ketahanan terhadap pH 3, pH 7, dan garam empedu 0,3%. Hasil uji aktivitas antimikroba terdapat 8 isolat yang tidak menghasilkan zona bening (zona hambat) pada uji antimikroba dengan Escherichia coli yang terdiri atas 2 isolat dari hasil fermentasi dengan kadar garam 5% (kode S) dan 6 isolat dari fermentasi dengan kadar garam 7,5% (kode T). Seluruh isolat yang diuji menggukan

Staphylococcus aureus menghasilkan zona bening. Zona bening terbesar pada uji antimikroba dengan Escherichia coli FNCC 0091 adalah pada isolat T2C10 dengan diameter 10,16±1,16 mm, sedangkan zona bening terbesar pada Staphylococcus aureus

FNCC 0047 adalah isolat T1C28 yaitu 10,08±0,53 mm.

a. Uji Ketahanan terhadap Asam

(15)

laktat dapat bertahan terhadap kondisi asam (pH 3 dan pH7) seperti pada Gambar 11.

Gambar 10. Hasil Uji Ketahanan Asam pada Isolat T1C30 terhadap pH 3 pada Jam ke 0 (a.1); 1,5 (b.1); dan 3 (c.1); serta pH 7 pada Jam ke 0 (a.2); 1,5 (b.2); dan 3 (c.2) yang Ditunjukkan dengan Adanya Titik-Titik didalam Media

(Dokumentasi Pribadi, 2017)

b. Uji Ketahanan terhadap Garam Empedu

Uji ketahanan terhadap garam empedu keseluruhan isolat yang terdiri dari 27 isloat dari hasil fermentasi dengan kadar garam 5% dan 27 isolat dari fermentasi dengan kadar garam 7,5% didapatkan bahwa seluruhnya dapat tumbuh pada uji ketahanan garam empedu pada jam ke 0, 2, dan 4. Hasil pengamatan menampilkan adanya titik-titik didalam media MRS A yang menunjukkan bahwa bakteri asam laktat yang diuji dapat bertahan terhadap garam empedu 0,3% seperti pada Gambar 10.

a.1 _b.1 c.1

(16)

Gambar 11. Hasil Uji Ketahanan Garam Empedu pada Isolat S3C33 pada Jam ke 0 (a); 2 (b); dan 4 (c) (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017)

c. Uji Aktivitas Antimikroba

Uji aktivitas antimikroba dilakukan dengan menggunakan metode sumuran, yaitu mendifusikan filtrat yang dihasilkan bakteri asam laktat kedalam lubang-lubang pada media MRS A yang telah terdapat bakteri Escherichia coli FNCC 0091 yang mewakili bakteri Gram negatif dan Staphylococcus aureus

FNCC0047. Bakteri asam laktat yang mampu menghasilkan senyawa antimikroba akan membentuk zona bening seperti yang ditunjukkan pada Gambar 12.

Gambar 12. Hasil Uji Aktivitas Antimikroba pada Isolat T2C8 menggunakan

Escherichia coli FNCC 0091 (a); Staphylococcus aureus FNCC 0047 (b) (Sumber : Dokumentasi Pribadi, 2017).

a b _c