iv Universitas Kristen Maranatha ABSTRAK
ANALISIS MUTASI GEN PENGEKSPRESI DOMAIN B DAN C DNA POLIMERASE HBV
DARI PASIEN YANG TERINFEKSI DENGAN TITER TINGGI
Anton Mulyono., 2003 ; Pembimbing I: Johan Lucianus, dr, M.Si.
Pembimbing II: Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D.
Ratusan juta orang di dunia ini telah mengalami infeksi kronik oleh virus hepatitis B (HBV). Infeksi kronik ini dapat mengakibatkan sirosis hati dan karsinoma sel hati. HBV merupakan suatu virus DNA yang bereplikasi lewat RNA intermediet dengan menggunakan enzym reverse transcriptase. Reverse transcriptase diketahui memiliki kekurangan pada fungsi proofreading. Akibatnya, HBV memiliki kecepatan mutasi yang 10 kali lebih besar daripada virus DNA lainnya. Mutan HBV dapat menunjukkan kenaikan virulensi, yang antara lain ditunjukkan dengan adanya kenaikan replikasi HBV dan resistensi terhadap antivirus. Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mengetahui adanya pola mutasi DNA polimerase HBV domain B dan C. DNA HBV diambil dari pasien dengan titer DNA HBV antara 106- 107 IU/mL. Sampel-sampel tersebut diamplifikasi dengan menggunakan PCR dengan memakai primer yang spesifik, yaitu HBVDNAPolBC fwd2 dan HBVDNAPolBCRev dan menghasilkan fragmen DNA sekitar 200-300 pb. Fragmen ini kemudian dimurnikan, lalu disekuensing. Hasilnya dibandingkan dengan database NCBI. Hasilnya adalah tidak ditemukan mutasi pada sampel-sampel tersebut.
v Universitas Kristen Maranatha ABSTRACT
ANALYSIS MUTATIONS OF B AND C DOMAIN OF DNA POLYMERASE GENE FROM THE PATIENTS WITH HIGHLY INFECTED
Anton Mulyono., 2003; First tutor: Johan Lucianus, dr, M.Si.
Second tutor: Ernawati Arifin Giri Rachman, Ph.D.
Several hundreds million people throughout the world are chronically infected with hepatitis B virus (HBV). The chronic infection leads to liver cirrhosis and hepaticellular carcinoma. HBV is a DNA virus which replication is through an RNA replicative intermediate requiring an active viral reverse transcriptase / polymerase enzyme. The reverse transcriptase is lack of proofreading function. Therefore, the mutation rate of HBV more than 10-fold higher than other DNA viruses. HBV Mutant can display enhanced virulence with an increased levels of HBV replication and resistance to antiviral therapies. The aim of this study were to elucidate the mutation pattern on the B and C domain HBV DNA polymerase gene. The HBV DNA was extracted from patients with HBV DNA titer between 106- 107 IU/mL, and amplified by PCR using the HBV specific sequence forward and reverse primers, namely HBVDNA PolBCfwd2 and HBVDNAPolBCRev, respectively, and resulted in 200-300 bp DNA fragment. These fragments were subsequently purified, sequenced and compared with the reported sequence at NCBI databases. The result is that there are no mutations on those sampels.
viii Universitas Kristen Maranatha DAFTAR ISI
Halaman
LEMBAR PERSETUJUAN ...ii
SURAT PERNYATAAN ...iii
ABSTRAK... iv
ABSTRACT... v
KATA PENGANTAR... vi
DAFTAR ISI ...viii
DAFTAR TABEL ... x
DAFTAR GAMBAR ...xi
BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang ... 1
1.2. Identifikasi Masalah ... 2
1.3. Maksud dan Tujuan ... 3
1.4. Manfaat Penelitian... 3
1.5. Metode Penelitian... 3
1.6. Lokasi dan Waktu Penelitian ... 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Epidemiologi Hepatitis B ... 4
2.2. Patologi Hepatitis B ... 4
2.3. Spektrum dari Penyakit Hati... 5
2.3.1. Hepatitis Akut... 5
2.3.2. Hepatitis Kronis... 6
2.4. Cara Penularan ... 7
2.5. Virus Hepatitis B... 8
2.6. Genom HBV ... 9
2.7. Gen Polimerase HBV ... 10
2.8. Siklus Hidup HBV ... 11
2.9. Mutasi Virus ... 13
2.10. Pengobatan Hepatitis B kronis... 13
2.10.1. Interferon... 14
2.10.2. Lamivudine... 15
2.10.3. Adefovir Dipivoxil... 17
BAB III ALAT, BAHAN, DAN METODE PENELITIAN 3.1. Subjek Penelitian... 19
3.2. Alat dan Bahan... 19
3.2.1. Alat-Alat yang Digunakan ... 19
3.2.2. Bahan-Bahan yang Digunakan... 20
3.3. Metode Penelitian... 21
3.4. Cara Kerja ... 21
ix Universitas Kristen Maranatha
3.4.2. Pemurnian ... 22
3.4.3. Sekuensing dan Analisis Hasil Sekuensing ... 22
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. PCR ... 23
4.2. Pemurnian ... 27
4.3. Analisis Hasil Sekuensing ... 27
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1. Kesimpulan ... 28
5.2. Saran ... 28
DAFTAR PUSTAKA... 29
x Universitas Kristen Maranatha DAFTAR TABEL
xi Universitas Kristen Maranatha DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1. Gambaran Laboratorium pada Hepatitis B Akut... 6
Gambar 2.2. Gambaran Laboratorium Hepatitis B Kronik... 7
Gambar 2.3. Bentuk HBV ... 9
Gambar 2.4. Genom HBV... 10
Gambar 2.5. Gen Polimerase HBV... 11
Gambar 2.6. Siklus Hidup HBV... 12
Gambar 2.7. Struktur Lamivudine ... 17
Gambar 4.1. PCR Menggunakan Primer HBVDNAPolBCFwd dan HBVDNAPolBCRev Disertai Primer P1 dan P2... 24
Gambar 4.2. PCR Menggunakan Primer HBVDNAPolBCFwd2 dan HBVDNAPolBCRev ... 25
1 Universitas Kristen Maranatha BAB I
PENDAHULUAN
1.1Latar Belakang
Di zaman modern ini tentu kita sudah tidak asing lagi dengan penyakit hepatitis
B. Penyakit ini disebabkan oleh virus hepatitis B. Infeksi virus hepatitis B dapat
menyebabkan penyakit hepatitis akut dan kronis, termasuk hepatitis fulminan, sirosis,
dan kanker sel hati (Ono-Nita et al., 1998).
Prevalensi penyakit hepatitis B di dunia diperkirakan 350 juta kronik karier,
dengan prevalensi yang berbeda-beda di tiap negara. Sedangkan di Indonesia
menunjukkan 14-16 juta orang Indonesia terinfeksi tiap tahunnya dan 200.000
meninggal setiap tahunnya (Achmadi, 2002; Akbar et al., 2004).
Sekarang telah banyak obat-obat antivirus yang dapat digunakan, antara lain:
interferon-α, lamivudine, dan adefovir dipivoxil (Kasper et al., 2005), tetapi sampai
sekarang masih belum ada pengobatan antivirus yang efektif pada pasien dengan
infeksi HBV kronik. Meskipun terapi interferon banyak memberi keuntungan pada
pasien, tetapi respon keseluruhan kurang dari 40% dan interferon juga mempunyai
efek samping yang berhubungan dengan dosis. Karena replikasi DNA HBV terjadi
melalui reverse transcriptase dari pregenom RNA intermediet, penggunaan reverse
transcriptase inhibitor sebagai antivirus untuk hepatitis B menjadi pilihan menarik
(Ono-Nita et al., 1998).
Lamivudine atau (-)-β-L-2,3-dideoxy-3-thiacytidine (3TC), merupakan salah satu
dari obat yang dapat menghambat proses reverse transkripsi dan mempunyai aktivitas
antivirus melawan HIV dan HBV (Ono-Nita et al., 1998). Analog nukleosida ini
sekarang banyak digunakan secara luas sebagai terapi pilihan pertama pada infeksi
hepatitis B kronik. Respon klinik awal sangat memuaskan, dengan kecepatan tinggi
dalam menekan HBV, normalisasi serum alanine transaminase (ALT), dan hilangnya
Universitas Kristen Maranatha
2
Terapi jangka panjang diperlukan pada mayoritas untuk menjaga efek supresif
dari lamivudine. Sementara itu, terapi jangka panjang pada kebanyakan pasien dapat
menyebabkan menurunnya respon secara bertahap berhubungan dengan timbulnya
drugs resistent HBV (Nakanishi et al., 2005). Hal ini dimungkinkan karena
timbulnya resistensi akibat dari replikasi HBV yang mengalami mutasi. HBV
mereplikasi genomnya melalui reverse transcriptase dan kesalahan yang terjadi
secara spontan pada reverse transcriptase dapat menghasilkan produksi mutasi yang
dapat terjadi selama infeksi (Seigneres et al., 2000). Reverse transcriptase diketahui
memiliki kekurangan fungsi proofreading yang umum terdapat pada polimerase
lainnya. Akibatnya, HBV memiliki kecepatan mutasi 10 kali lebih besar dari virus
DNA lainnya, dan diperkirakan rata-rata mutasinya adalah 1 nukleotida/10.000
basa/tahun infeksi (Blum et al., 1995). Mutan HBV dapat menunjukkan kenaikan
virulensi, yang antara lain ditunjukan dengan adanya resistensi terhadap antivirus
(Hunt et al., 2000). HBV yang resisten terhadap lamivudine telah dilaporkan terjadi
substitusi YMDD motif (tirosin-metionin-aspartat-aspartat) pada RNA-dependent
DNA polimerase (Ono-Nita et al.,1998).
Timbulnya mutasi pada DNA polimerase HBV membuat penulis ingin
mengetahui apakah ada pola mutasi lain pada domain B dan C dari DNA polimerase
virus hepatitis B pada pasien di Indonesia dengan titer DNA HBV sampai 106-107
IU/mL.
1.2Identifikasi Masalah
Apakah terdapat mutasi gen DNA polimerase virus pada pasien dengan titer DNA
Universitas Kristen Maranatha
3
1.3Maksud dan Tujuan
Maksud: Melihat pola mutasi DNA polimerase HBV pada pasien di Indonesia
untuk mengembangkan metode deteksi yang berguna untuk melihat kemungkinan
adanya resistensi.
Tujuan: Mendeteksi adanya mutasi DNA polimerase domain B dan C dari HBV
pada pasien dengan titer DNA HBV antara 106-107 IU/mL.
1.4Manfaat Penelitian
Penelitian ini akan berguna untuk melihat pola mutasi pada DNA polimerase
HBV, yang dalam jangka panjang akan digunakan untuk mengembangkan suatu
metode deteksi HBV untuk memantau adanya resistensi pengobatan.
1.5 Metode Penelitian
Strategi yang digunakan untuk mendapatkan informasi urutan nukleotida pada
domain B dan C DNA polimerase HBV, meliputi beberapa tahapan, yaitu: (1) PCR
polimerase HBV pada domain B dan C, (2) pemurnian hasil PCR untuk mendapatkan
DNA yang murni dan bebas kontaminan dari reagen PCR, (3) sekuensing untuk
mendeteksi urutan nukleotidanya, dan (4) analisis hasil sekuensing.
1.6 Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di:
1. LP2IKD dan Laboratorium Mikrobiologi FK UKM
2. Pusat Ilmu Hayati ITB dengan kolaborasi dengan grup HBV-Debbie S.
Retnoningrum.
28 Universitas Kristen Maranatha BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Dari hasil sekuensing, tidak didapatkan mutasi pada DNA polimerase domain B
dan C darivirus hepatitis B.
5.2 Saran
Penelitian ini merupakan bagian kecil dari penelitian besar yang mempunyai
banyak keterbatasan informasi, karena tidak tersedianya data klinis dari pasien yang
diteliti. Penelitian serupa perlu dilakukan dengan sample yang lebih banyak sehingga
kemungkinan untuk memperoleh pola mutasi juga semakin besar. Apabila pada
penelitian selanjutnya ketersediaan data klinis sudah terpenuhi, sampel dapat
29 Universitas Kristen Maranatha DAFTAR PUSTAKA
Anonimus I. 2000. www.brown.edu/courses/bio_160/projects2000/HepatitisB/path. html. 8 November 2006.
Anonimus II. 2005. http://www.stanford.edi/group/virus/hepadna/2005/lamivudine. gif. 8 November 2006.
Anonimus III. http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/HBV.html. 8 November 2006.
Anonimus IV. Pathmicro.med.sc.edu/virol/hepatitis-virus.htm. 8 November 2006.
Achmadi, U.F. (2002). “The Epidemiology of Communicable Diseases in Indonesia and Its Realtion to The Importance of Vaccine Development.” One-day Seminar on the occasion of 112th Bio Farma Anniversary.
Akbar, S.M., Furukawa, S., Horiike, N., Onji, M. (2004). Vaccine therapy for hepatitis B virus carrier. Curr Drug Targets Infect Disord. Jun; 4(2): 93-101
Blum H.E.A.1995. Variants of hepatitis B, C, and D viruses; molecular biology and clinical significance. Digestion;56: 85-95.
Chang K., Chisari F. 1999. Immunopathogenesis of hepatitis B virus infection. In: Lee W, ed Hepatitis B. Philadelphia: WB Saunders Company: 221-239.
Flint S.J., Enquist L.W., Krug R.M., Racaniello., Skalka A.M. 2000. Reverse Transcription and Integration.: Virology molekular biology, pathogenesis, and control. Washington DC: ASM Press. p. 765-767.
Glaxo Wellcome. Zeffik coated tablets. 2001. Summary of product characteristic.
GlaxoSmithKline. Epivir-HBV. 2001. US product information.
Universitas Kristen Maranatha
30
Kasper., Braunwald., Fauci., Hauser., Longo., Jameson. 2005. Harrison’s principles of internal medicine. 16th ed. United Stated in America: The McGraw-Hill companies. p1285-1286, 1829-1830, 1844-1848.
Khouri M.E., Santos, V.A.D. 2004. Hepatitis B: epidemiological, imunollogical, and serological consideration emphasizing mutation, Rev. Hosp. Clin. Vol 59 no 4. Sao Paulo
Mims C., Playfair J., Roitt I., Wakelin D., William R. 1998. Gastrointestinal tract infections. In: Crowe L, ed. Medical Microbiology 2nd ed. London: Mosby: 253-286.
Nakanishi H., Kurosaki M., Asahina Y., Onuki Y., Ueda K., nishimura Y., et al. 2005. Polymerase Domain B mutation is associated with hepatitis relapse during long term Lamivudine therapy for chronic hepatitis B, intervirology; 48: 381-388.
Ono-nita S.K., Kato N., Shiratori Y., Tsutomu M., Lan K.H., Carilho F.J., et al. 1998. YMDD motif in hepatitis B virus DNA polymerase influences on replication and lamivudine resistance: a study invitro full length viral DNA transfection. Hepatology; 29: 939-945.
Paar David. 2001. Hepatitis B virus: transmission, prevention, treatment and HIV co-infection. http://www.thebody.com/hepp/jun_jul01/hbv.html, 8 November 2006.
Rosenberg P, Dienstag J. 1999. Therapy with nucleoside analogues for hepatitis B virus infection. In: Lee W, ed. Hepatitis B. Philadelphia: WB Saunders Company. p 349-361.
Seigneres B., Pichoud C., Ahmed S.S., Hantz O., Trepo C., Zoulim F. 2000. Evolution of hepatitis B virus polymerase gene sequencing during famciclovir therapy for chronic Hepatitis B. JID;181: 1221.
Universitas Kristen Maranatha
31
Suk-Fong Lok A., Hussain M., Cursano C., Margotti M., Gramenzi A., Grazi G.L., et al., 2000. Evolution of Hepatitis B Virus Polimerase Gene Mutations in Hepatitis B e Antigen-Negative Patients Receiving Lamivudine Therapy, Hepatology; 32: 1145-1153.
Suwandi Widjaja. 1999. Virus hepatitis B, C, dan G. Jakarta: Grasindo. p1-6.
Yokosuka O., Tagawa M., Omata M. 1993. PCR detection of hepatitis B virus. In: Persing D.H., Smith T.F., Temovef., White T.J. Diagnostic Molecular Microbiology principles and applications. Washington. D.C: American Society for Microbiology. P 322-325.
Yuen M.F., Sablon E., Hui C.K., Yun H.J., Decraemer H., Lai C.L., 2001. Factor associated woth hepatitis B virus DNA breaktrough in patients receiving prolonged Lamivudine therapy. Hepatology; 34: 785-791.
