i
UJI AKTIVITAS ANTIPROLIFERATIF EKSTRAK DAN FRAKSI n-HEKSAN TUMBUHAN PAKU Dryopteris marginalis
(L) Grav TERHADAP KULTUR SEL KANKER PAYUDARA MCF-7 DENGAN MTT ASSAY
SKRIPSI
Oleh:
NITA TRINOVITASARI 12613208
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
YOGYAKARTA DESEMBER 2016
ii
UJI AKTIVITAS ANTIPROLIFERATIF EKSTRAK DAN FRAKSI n-HEKSAN TUMBUHAN PAKU Dryopteris marginalis
(L) Grav TERHADAP KULTUR SEL KANKER PAYUDARA MCF-7 DENGAN MTT ASSAY
SKRIPSI
Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat mencapai gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Universitas Islam Indonesia Yogyakarta
Oleh:
NITA TRINOVITASARI 12613208
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
YOGYAKARTA DESEMBER 2016
iii
iv
v
vi
KATA PENGANTAR
Assalamu’alaikum Wr.Wb
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini yang berjudul “Aktivitas Antiproliferatif Ekstrak dan Fraksi n-heksan Tumbuhan Paku Dryopteris marginalis (L) Grav terhadap Kultur Sel Kanker Payudara MCF- 7 dengan MTT Assay”. Penulisan skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk mendapatkan gelar sarjana di jurusan Farmasi Universitas Islam Indonesia. Tanpa adanya bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak penulisan skripsi ini tidak dapat diselesaikan oleh penulis. Oleh karena itu, penulis ingin menyampaikan rasa terima kasih kepada:
1. Kedua orang tuaku tercinta yang selalu memberikan semangat, kasih sayang, nasehat, serta doa yang tiada hentinya untuk kelancaran dan kesuksesan studi penulis.
2. Dr. Ir. Harsoyo, Msc., selaku Rektor Universitas Islam Indonesia.
3. Drs. Allwar, M.Sc., Ph.D., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Islam Indonesia.
4. Pinus Jumaryatno, M.Phil., Ph.D., Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi di Fakultas MIPA Universitas Islam Indonesia.
5. Annisa Fitria, M.Sc., Apt dan Rochmy Istikharah, M.Sc., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah banyak membantu dengan meluangkan waktu, pikiran, serta tenaga untuk membimbing penulis dalam menyusun skripsi ini.
6. Prof. Dr. Ediati Sasmito, SE., Apt dan Hady Anshory, M.Sc., Apt., selaku dosen penguji yang telah memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.
7. Rumbiwati, dan seluruh laboran yang telah banyak membantu selama penelitian.
8. Teman seperjuangan skripsi Karina Savitri dan Maya Aulia terima kasih untuk segala masukan, semangat, dan dukungan selama penelitian hingga penyusunan skripsi ini terselesaikan.
vii
9. Asri Tunjung Sari dan Galur Rani Tama terima kasih untuk segala dukungan, saran, dan motivasi yang telah diberikan.
10. Teman-teman seperjuangan semasa kuliah Farmsi C, Injectio 2012, terima kasih untuk segala kisah dan pelajaran hidup yang telah diberikan.
11. Sahabat-sahabatku yang berbeda raga tapi satu jiwa yang selalu mendukung, memberikan semangat serta doa.
12. Serta semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan namanya satu persatu yang telah banyak membantu.
Penulis menyadari skripsi ini masih memiliki banyak kekurangan sehingga penulis mengharapkan dan akan menerima dengan lapang dada segala saran dan masukan yang diberikan. Akhir kata Penulis berharap semoga kebaikan dan amalan Bapak/Ibu/Saudara(i) sekalian dapat dibalas dengan lebih baik oleh Allah SWT.
Yogyakarta, Desember 2016
Nita Trinovitasari
viii
HALAMAN PERSEMBAHAN
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat, karunia, dan hidayahNya sehingga penelitian ini dapat terselesaikan.
Terima kasih penulis ucapkan untuk segala bantuan, dukungan, perhatian, serta kasih sayang yang telah diberikan kepada penulis dari orang-orang tersayang dan terkasih :
Bapak Harsid, SE., Msi dan ibu Dra. Zatna, bapak dan ibuku tercinta yang selalu memberikan dukungan, motivasi, kasih sayang, nasehat serta doa yang tiada hentinya hingga dapat terselesaikannya penulisan skripsi ini.
Togar Haryopranoto S.Farm., Apt, Ikhsan Hadisaputra S.Kom., kedua kakakku tersayang, dan Agrian Persada Gama adikku tersayang yang selalu memberikan doa, dukungan dan motivasi kepada penulis.
Saudara, sahabat, teman-teman seperjuangan, dan orang terkasih yang namanya tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah memberikan doa, bantuan, dukungan dan motivasi kepada penulis, serta telah menjadi potongan kisah indah untuk penulis.
ix DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL………. ii
HALAMAN PERSETUJUAN……….. iii
HALAMAN PENGESAHAN……….. iv
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS………. v
KATA PENGANTAR………..………... vi
HALAMAN PERSEMBAHAN……….………. viii
DAFTAR ISI……… ix
DAFTAR GAMBAR……… xii
DAFTAR TABEL……… xiii
DAFTAR LAMPIRAN……… xiv
INTISARI……… xv
ABSTRACT………. xvi
BAB I PENDAHULUAN………... 1
1.1 Latar Belakang Masalah……… 1
1.2 Rumusan Masalah……….. 3
1.3 Tujuan Penelitian………... 3
1.4 Manfaat Penelitian………. 3
BAB II STUDI PUSTAKA……… 4
2.1 Tinjauan Pustaka……… 4
2.1.1 Dryopteris marginalis (L) Grav………... 4
2.1.2 Senyawa Steroid sebagai Antikanker……….. 5
2.1.3 Kanker……….. 5
2.1.4 Kanker Payudara………. 6
2.1.5 Sel Kultur………. 6
2.1.6 Sel Kanker Payudara MCF-7………... 7
2.1.7 Sel Vero……… 7
2.1.8 Metode Maserasi dan Fraksinasi……….. 8
2.1.9 Aktivitas Antiproliferatif……….. 8
2.1.10 MTT-Assay………. 8
x
2.1.11 Kerangka Teori Penelitian………. 10
2.2 Landasan Teori……….. 11
2.3 Hipotesis……… 11
BAB III METODE PENELITIAN……… 12
3.1 Jenis Penelitian………. 12
3.2 Lokasi Penelitian……….. 12
3.3 Subjek Penelitian……….. 12
3.4 Objek Penelitian……… 12
3.5 Instrumentasi Penelitian……… 12
3.6 Cara Kerja………. 13
3.6.1 Ekstraksi Tumbuhan Paku……….. 13
3.6.2 Fraksinasi Ekstrak Tumbuhan Paku……… 13
3.6.3 Uji Fitokimia Fraksi Aktif……….. 14
3.6.4 Analisis Kandungan Sisa Pelarut……… 14
3.6.5 Pembuatan Seri Kadar………. 15
3.6.6 Kultur Sel……… 15
3.6.7 Panen Sel……… 15
3.6.8 Uji Antiproliferatif Ekstrak dan Fraksi n-heksan……… 16
3.6.9 Metode Analisa Hasil………. 17
3.7 Kerangka Umum Penelitian………. 18
3.8 Kerangka Konsep Penelitian……… 19
BAB IV PEMBAHASAN……….. 20
4.1 Hasil Kaji Etik Penelitian………. 20
4.2 Hasil Identifikasi Tumbuhan……… 20
4.3 Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi……….. 21
4.4 Hasil Uji Sisa Pelarut Ekstrak……… 26
4.5 Hasil Uji Antiproliferatif Ekstrak dan Fraksi……… 28
4.6 Hasil Uji Kandungan Fraksi Aktif……… 33
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN……… 36
xi
5.1 Kesimpulan………... 36
5.2 Saran……….. 36
DAFTAR PUSTAKA……….. 37
LAMPIRAN………. 39
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Tumbuhan Paku Dryopteris marginalis……… 4
Gambar 2.2 Sel MCF-7 dan Sel Vero……….. 7
Gambar 2.3 Reaksi Pembentukan Kristal formazan………. 9
Gambar 2.4 Kerangka Teori Penelitian……… 10
Gambar 3.1 Kerangka Umum Penelitian……….. 18
Gambar 3.2 Kerangka Konsep Penelitian………. 19
Gambar 4.1 Ekstrak n-heksan………...……… 21
Gambar 4.2 Proses Fraksinasi………..… 22
Gambar 4.3 Hasil Identifikasi Fraksi……… 23
Gambar 4.4 Hasil Identifikasi Fraksi 10-13……….. 24
Gambar 4.5 Hasil Kromatogram Standar………. 27
Gambar 4.6 Hasil Kromatogram Ekstrak………. 27
Gambar 4.7 Kultur Sel MCF-7 dan Sel Vero………... 29
Gambar 4.8 Grafik Kematian Sel MCF-7……… 31
Gambar 4.9 Hasil Identifikasi Senyawa Fraksi ………... 34
xiii
DAFTAR TABEL
Tabel 3.1 Perbandingan Pelarut Ekstraksi……….. 14 Tabel 4.1 Fraksi Yang Dihasilkan dari Proses Fraksinasi…….. 22 Tabel 4.2 Hasil Rf, hRf, dan Penggabungan Fraksi………... 25 Tabel 4.3 Bobot Fraksi Yang Dihasilkan……… 26 Tabel 4.4 Hasil Uji Antiproliferatif Sel MCF-7 Sampel……… 30 Tabel 4.5 Hasil Uji Antiproliferatif Sel MCF-7………. 31 Tabel 4.6 Hasil Uji Antiproliferatif Sel Vero………. 32 Tabel 4.7 Nilai hRf Hasil Identifikasi Senyawa……….. 35
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Ethical Clearance………... 39
Lampiran 2 Hasil Identifikasi Tumbuhan………. 40
Lampiran 3 Hasil Kromatografi GC-MS……….. 41
Lampiran 4 Bobot Hasil Fraksinasi Ekstrak………. 45
Lampiran 5 Plate Sel MCF dan Sel Vero……….. 46
Lampiran 6 Tabel Absorbansi, Persentase Kematian dan Grafik Sel MCF-7……… 47
xv
Uji Aktivitas Antiproliferatif Ekstrak dan Fraksi n-Heksan Tumbuhan Paku Dryopteris marginalis (L) Grav terhadap Kultur Sel Kanker Payudara MCF-
7 dengan MTT Assay
Nita Trinovitasari Program Studi Farmasi
INTISARI
Dryopteris marginalis (L) Grav, merupakan salah satu tumbuhan paku yang banyak ditemukan di Indonesia. Spesies tumbuhan paku ini memiliki senyawa steroid yang dapat digunakan untuk menghambat pertumbuhan sel kanker payudara. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antiproliferatif ekstrak dan fraksi n-heksan tumbuhan paku Dryopteris marginalis terhadap kultur sel kanker payudara MCF-7, dan toksisitasnya terhadap kultur sel Vero sebagai sel normal. Metode yang digunakan untuk menarik ekstrak adalah dengan cara maserasi menggunakan pelarut n-heksan, setelah itu ekstrak difraksinasi dengan kromatografi cair vakum menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, metanol dan campuran pelarut tersebut. Potensi aktivitas antiproliferatif ekstrak dan fraksi n- heksan daun tumbuhan paku Dryopteris marginalis terhadap sel kanker payudara MCF-7, serta toksisitasnya terhadap sel Vero (sel normal), dapat dilihat dari kemampuan ekstrak dan fraksi untuk membunuh sel kanker menggunakan MTT assay. Analisa hasil dilakukan dengan menentukan konsentrasi ekstrak dan fraksi terpilih yang mampu membunuh 50% sel kanker (IC50) berdasarkan hasil pembacaan nilai absorbansi. Nilai IC50 diperoleh dengan menggunakan persamaan regresi linier dengan menghubungkan nilai konsentrasi sampel sebagai X dan nilai persentase kematian sel sebagai Y. Hasil identifikasi senyawa fraksi F, fraksi I, dan fraksi C mengandung senyawa steroid. Fraksi yang memiliki aktivitas antiproliferatif paling baik adalah fraksi F dengan nilai IC50 765,92ppm dan tidak berbahaya bagi sel Vero sebagai sel normal dengan nilai IC50 NA (Not Available).
Kata Kunci : Dryopteris marginalis, Kanker Payudara, MCF-7, MTT Assay
xvi
Antiproliferative Activity Test of n-Hexane Extract and Fraction of Fern Dryopteris marginalis (L) Grav to MCF-7 Breast Cancer Cell with MTT
Assay
ABSTRACT
Dryopteris marginalis (L) Grav, is one species of ferns that is often found in Indonesia. This species of fern have steroid compound that can be used to inhibit growth of breast cancer cells. The purpose of this research is to describe about antiproliferative activity of Dryopteris marginalis n-hexane extract and fraction to MCF-7 breast cancer culture cell, and its toxicity to Vero culture cell as normal cell.
The method used to obtain the extract is by maceration using n-hexane, after that the extract fractionated by vacuum liquid chromatography using n-hexane, etil acetat, methanol, and gradient of the solven. Potential antiproliferative activity of n-hexane extract and fraction of Dryopteris marginalis leaf on breast cancer cells MCF-7, and its toxicity on Vero cells (normal cells), could be determined from its ability to kills cancer cells using MTT assay. Analysis is done by determination of concentration value of chosen extract and fraction that kills 50% cancer cells showed by it absorbance value. The IC50 value is obtained from regression linier equation by relating the concentration value as X value and death cell percentage value as Y value. The result of identification are fraction F, fraction I, and fraction C have steroid compound. Fraction that has good antiproliferative activity is fraction F with IC50 value of 765,92ppm and safe for Vero cells as normal cell with IC50 value NA (Not Available).
Key Words : Dryopteris marginalis, breast cancer, MCF-7, MTT Assay
1 BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Masalah
Indonesia sangat dikenal dengan kekayaan alam nabatinya yang berlimpah ruah. Salah satu tumbuhan yang banyak hidup di Indonesia adalah jenis paku- pakuan (Pteridophyta). Tumbuhan paku memiliki daya adaptasi yang tinggi sehingga mampu tumbuh dimana saja(1). Dari sekitar 10.000 spesies tumbuhan paku yang ada di dunia, 3.000 spesies diantaranya tumbuh di Indonesia. Pemanfaatan tumbuhan paku sebagai bahan obat tidak terlepas dari kemampuan tumbuhan paku memproduksi senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid, terpenoid, steroid, saponin, flavonoid, dan lain-lain(2).
Berdasarkan hasil uji bioaktivitas suatu penelitian, beberapa metabolit sekunder dari tumbuhan paku menunjukkan aktivitas biologis yang dapat dimanfaatkan antara lain sebagai antikanker(2). Senyawa yang berperan sebagai agen antikanker adalah senyawa phytosteroid diantaranya adalah β-sitosterol, stigmasterol, dan kampesterol. Adapun beberapa penelitian sebelumnya yang berhubungan dengan hal ini antara lain adalah uji aktivitas antikanker ekstrak n- heksan tumbuhan paku Christella arida yang mengandung senyawa phytosteroid menunjukkan hasil potensial sebagai antikanker(3). Pada penelitian Grattan (2013) membuktikan bahwa β-sitosterol dapat berikatan dengan reseptor α dan β dari estrogen yang merupakan mediator kanker(4). Stigmasterol yang diisolasi dari tumbuhan paku Navicula incerta menunjukkan sitotoksisitas yang ampuh dalam melawan hepatocarcinoma (HepG2)(5), dan yang terakhir pada penelitian Ali et al (2015) menunjukkan bahwa stigmasterol yang dikombinasikan dengan croton oil memiliki efikasi yang baik untuk melawan kanker kulit(6).
Dryopteris marginalis (L) Grav merupakan salah satu tumbuhan paku yang termasuk kedalam genus Dryopteris. Tumbuhan paku dengan genus Dryopteris memiliki kandungan metabolit sekunder diantaranya adalah: alkaloid, steroid, triterpenoid, flavonoid, tannin, dan lain-lain(7). Pada penelitian sebelumnya beberapa spesies tumbuhan paku dari family Dryopteridaceae telah terbukti memiliki aktivitas sebagai antikanker(8). Telah dilakukan penelitian uji aktivitas antikanker dari tumbuhan Dryopteris marginalis (L) Grav sebelumnya. Akan tetapi
2
penelitian untuk tumbuhan spesies ini masih sangat minim. Penelitian yang telah dilakukan sebelumnya juga belum sampai pada tahap pengujian fraksi dari ekstrak tumbuhan paku tersebut. Oleh sebab itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.
Kanker atau yang disebut juga dengan neoplasma, secara harfiah berarti pertumbuhan baru. Neoplasma adalah masa abnormal jaringan yang pertumbuhannya berlebihan dan tidak terkoordinasi walaupun rangsangan yang memicu pertumbuhan tersebut terhenti(9). Kanker payudara merupakan salah satu penyakit mematikan yang masih banyak terjadi. Menurut laporan WHO berdasarkan data statistic IARC (International Agency for Research on Cancer) angka kejadian kanker payudara di dunia hingga tahun 2012 ada 1,7 juta wanita yang mengalami kanker payudara dan 521 ribu wanita yang mengalami kematian karena kanker payudara(10,11), sedangkan angka kejadian kanker payudara di Indonesia hingga tahun 2014 wanita yang positif kanker payudara sebanyak 48.998 dan wanita yang mengalami kematian karena kanker payudara sebanyak 19.731(12). Masih banyaknya kejadian kanker payudara menyebabkan penemuan obat baru terkait terapi pengobatannya masih sangat dibutuhkan. Adanya sumberdaya alam yang potensial untuk dijadikan antikanker salah satunya tumbuhan paku spesies Dryopteris marginalis (L) Grav, melatar belakangi peneliti untuk melakukan penelitian ini. Pada penelitian ini dilakukan uji aktivitas antiproliferasi ekstrak dan fraksi n-heksan terhadap jenis sel kanker MCF-7, yaitu sel kanker yang umum ditemui pada pasien kanker payudara karena memiliki beberapa karakteristik yang sama dengan epitel payudara terkait kemampuan memproses estrogen dalam bentuk estradiol melalui reseptor estrogen di dalam sitoplasma(13). Hal ini erat hubungannya dengan mekanisme pengaturan estrogen pada senyawa steroid dalam ekstrak dan fraksi Dryopteris marginalis (L) Grav. Selain itu, pada penelitian ini dilakukan juga uji terhadap sel Vero sebagai sel normal, untuk mengetahui toksisitas efek antiproliferasi ekstrak dan fraksi dalam membunuh sel kanker.
Berdasarkan latar belakang yang telah dipaparkan, diharapkan melalui penelitian ini dapat diketahui potensi ekstrak dan fraksi n-heksan daun Dryopteris marginalis sebagai agen antiproliferatif pada sel kanker payudara MCF-7, serta toksisitasnya terhadap sel Vero (sel normal), sehingga penelitian ini dapat berkontribusi dalam penemuan obat pada terapi kanker payudara.
3
1.2 Rumusan Masalah
1. Apakah ekstrak dan fraksi n-heksan dari tumbuhan paku Dryopteris marginalis memiliki aktivitas antiproliferatif terhadap kultur sel kanker payudara MCF-7?
2. Apakah ekstrak dan fraksi n-heksan dari tumbuhan paku Dryopteris marginalis memiliki toksisitas sebagai antiproliferatif terhadap kultur sel Vero (sel normal)?
1.3 Tujuan Penelitian
1. Mengetahui aktivitas antiproliferatif ekstrak dan fraksi n-heksan dari tumbuhan paku Dryopteris marginalis terhadap kultur sel kanker payudara MCF-7.
2. Mengetahui toksisitas ekstrak dan fraksi n-heksan dari tumbuhan paku Dryopteris marginalis terhadap kultur sel Vero (sel normal).
1.4 Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi hasil penelitian mengenai potensi ekstrak dan fraksi n- heksan dari tumbuhan paku Dryopteris marginalis terhadap sel kanker payudara MCF-7 beserta toksisitasnya terhadap sel Vero (sel normal).
2. Membantu dan ikut berkontribusi dalam proses penemuan obat baru untuk terapi kanker payudara.
4 BAB II STUDI PUSTAKA 2.1 TINJAUAN PUSTAKA
2.1.1 Dryopteris marginalis (L) Grav
Tumbuhan paku Dryopteris marginalis atau yang dikenal juga dengan nama perisai pakis marjinal atau pakis kayu marjinal memiliki daun berwarna hijau terang sampai gelap atau hijau kebiruan dengan bentuk lonjong lanset dan bergerigi yang terasa kasar, dengan panjang daun 15-20 inch (gambar 2.1). Pada belakang daun terdapat spora dengan sorus terletak ditepi atau margin dari sisi bawah pinnule.
Tumbuhan paku ini memiliki tinggi sekitar 1,5-2 feet, tumbuh pada daerah lembab, maupun daerah berbatuan yang tidak mengandung kapur(14).
Klasifikasi tumbuhan:(15) Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta Division : Pteridophyta Class : Filicopsida Order : Polypodiales Family : Dryopteridaceae Genus : Dryopteris
Spesies : Dryopteris marginalis (L.) Grav
Gambar 2.1 Tumbuhan paku Dryopteris marginalis
5
Dryopteris marginalis (L) Grav merupakan salah satu tumbuhan paku yang termasuk kedalam genus Dryopteris. Tumbuhan paku dengan genus Dryopteris memiliki kandungan metabolit sekunder diantaranya adalah: alkaloid, steroid, triterpenoid, flavonoid, tannin, dan lain-lain(7). Pada penelitian sebelumnya beberapa spesies tumbuhan paku dari family Dryopteridaceae telah terbukti memiliki aktivitas sebagai antikanker(8). Senyawa yang berperan sebagai agen antikanker adalah senyawa phytosteroid diantaranya adalah β-sitosterol, stigmasterol, dan kampesterol.
2.1.2 Senyawa Steroid sebagai Antikanker
Steroid merupakan salah satu bentuk triterpena termodifikasi berupa senyawa organik, lemak sterol tidak terhidrolisis. Senyawa steroid yang berperan sebagai agen antikanker diantaranya adalah β-sitosterol, stigmasterol, dan kampesterol. Beberapa penelitian sebelumnya yang berhubungan dengan hal ini antara lain adalah uji aktivitas antikanker ekstrak n-heksan tumbuhan paku Christella arida yang mengandung senyawa phytosteroid menunjukkan hasil potensial sebagai antikanker(3). Pada penelitian Grattan (2013) membuktikan bahwa β-sitosterol dapat berikatan dengan reseptor α dan β dari estrogen yang merupakan mediator kanker(4). Stigmasterol yang diisolasi dari tumbuhan paku Navicula incerta menunjukkan sitotoksisitas yang ampuh dalam melawan hepatocarcinoma (HepG2)(5), dan yang terakhir pada penelitian Ali et al (2015) menunjukkan bahwa stigmasterol yang dikombinasikan dengan croton oil memiliki efikasi yang baik untuk melawan kanker kulit(6).
2.1.3 Kanker
Kanker merupakan suatu pertumbuhan sel yang tidak normal. Secara normal sel akan membelah saat dibutuhkan dan mengalami apoptosis saat terjadi kerusakan ataupun tidak dibutuhkan lagi. Pada sel kanker terjadi perubahan pada DNAnya sehingga walaupun sel mengalami kerusakan tidak akan terjadi apoptosis.
Lambat laun sel kanker yang terus membelah ini akan membentuk suatu jaringan baru yang abnormal dan ganas, yang dapat melakukan invasi hingga metastasis(16). Terdapat beberapa hal yang dapat menjadi faktor risiko kanker diantaranya adalah faktor genetik, gaya hidup, lingkungan, dan hormonal. Faktor genetik yang menjadi salah satu faktor risiko kanker adalah perubahan genetik yang dapat terjadi
6
karena faktor bawaan dari orangtua. Faktor gaya hidup yang tidak sehat seperti merokok ataupun mengkonsumsi minuman beralkohol merupakan salah satu faktor risiko terjadinya kanker. Faktor lingkungan yang menjadi faktor risiko kanker adalah cemaran senyawa kimia yang bersifat karsinogen, polusi dari kendaraan bermotor, dan paparan sinar UV. Faktor hormonal yang sering menjadi faktor risiko kanker adalah hormon estrogen dan progesterone, hormon ini telah banyak diteliti dapat menyebabkan kanker payudara ataupun ovarium(17).
2.1.4 Kanker Payudara
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang banyak terjadi di dunia maupun di Indonesia. Kanker payudara bisa berawal dari beberapa bagian payudara seperti pada duktus, lobus, ataupun jaringan diantara keduanya. Kanker ini tidak hanya terjadi pada wanita saja tetapi bisa juga terjadi pada laki-laki(18). Menurut laporan WHO berdasarkan data statistik IARC (International Agency for Research on Cancer) angka kejadian kanker payudara di dunia hingga tahun 2012 ada 1,7 juta wanita yang mengalami kanker payudara dan 521 ribu wanita yang mengalami kematian karena kanker payudara(10,11), sedangkan angka kejadian kanker payudara di Indonesia hingga tahun 2014 wanita yang positif kanker payudara sebanyak 48.998 dan wanita yang mengalami kematian karena kanker payudara sebanyak 19.731(12). Walaupun kasus kanker payudara yang terjadi pada wanita lebih banyak dibandingkan dengan laki-laki, menurut data US breast cancer pada tahun 2016 terdapat 246.660 kasus baru yang terjadi pada wanita dan 2.600 kasus baru yang terjadi pada laki-laki(19).
2.1.5 Sel Kultur
Sel kultur merupakan suatu sel yang diambil dari hewan atau tumbuhan yang dikembangkan dan ditumbuhkan pada media kultur secara in vitro yang digunakan dalam penelitian. Selain dari jaringan asal, sel kultur juga dapat diperbanyak dengan menggunakan sel yang sudah ada. Proses dari kultur sel harus selalu terkontrol dan terjaga aseptiknya. Sel kultur telah banyak digunakan untuk penelitian uji senyawa atau ekstrak obat baru seperti uji senyawa antikanker secara in vitro karena penanganannya mudah, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi serta mudah diganti dengan frozen stock jika terjadi kontaminasi(20).
7
2.1.6 Sel Kanker Payudara MCF-7
Sel MCF-7 atau Michigan Cancer Foundation-7 merupakan sel kanker payudara yang mengekspresikan reseptor estrogen (ER+) dengan wild type p53 sehingga sensitif terhadap agen kemoterapi. Sel MCF-7 dapat memproses estrogen dalam bentuk estradiol melalui reseptor estrogen dalam sitoplasma sel.
Pertumbuhan dari sel MCF-7 dapat dihambat dengan tumor necrosis factor alpha (TNFα) dan senyawa antiestrogen (senyawa yang dapat menghalangi ikatan estrogen dengan reseptornya). Pada saat pertama kali diisolasi sel MCF-7 ini memiliki kariotipe yang mengandung 85 kromosom, kemudian saat ini dikurangi 16 kromosom. Sehingga saat ini sel MCF-7 memiliki kariotipe yang mengandung 69 kromosom(13,21). Sel MCF-7 dilihat di bawah mikroskop (perbesaran 100 kali) berbentuk bulat dan bergerombol (gambar 2.2 a).
(a) (b)
Gambar 2.2 Kultur sel MCF-7 (a) dan kultur sel Vero (b)
2.1.7 Sel Vero
Sel Vero merupakan sel monolayer yang termasuk jenis epithelial-like, yang berasal dari ginjal monyet hijau Afrika. Sel Vero banyak digunakan dalam penelitian biologi molekuler, mikrobiologi, bahan pembuatan vaksin, dan penelitian antikanker. Sel Vero banyak digunakan dalam penelitian karena dapat bereplikasi secara cepat dan tidak terbatas pada suatu media secara in vitro. Sel ini menempel dengan kuat pada lapisan substrat yang berbahan polistiren dan membentuk ikatan kovalen(22). Sel Vero dilihat di bawah mikroskop (perbesaran 100 kali) berbentuk pipih dan menempel pada permukaan plate (gambar 2.2 b).
8
2.1.8 Metode Maserasi dan Fraksinasi
Maserasi merupakan salah satu proses ekstraksi yang digunakan untuk menyari senyawa atau metabolit dari suatu tumbuhan dengan menggunakan prinsip like disolve like. Pada saat maserasi pelarut akan berdifusi ke dalam sel simplisia, yang lama kelamaan akan menjadi jenuh di dalam sel simplisia dan akhirnya sel mengalami lisis (pecah). Selama proses maserasi dilakukan pengojokan atau pengadukan berulang-ulang, upaya ini dilakukan untuk menjamin keseimbangan konsentrasi bahan ekstraksi. Setelah proses maserasi berakhir, selanjutnya ampas dari maserasi akan dimaserasi kembali dengan pelarut yang berbeda yang biasa disebut dengan remaserasi(9).
Fraksinasi merupakan suatu proses pemisahan senyawa hasil ekstraksi yang dilakukan untuk mendapatkan sekelompok senyawa tertentu. Pemisahan ekstrak dengan metode fraksinasi dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut bergradien, dengan menggunakan bantuan kromatografi cair vakum. Proses fraksinasi ini dilakukan agar mendapatkan kandungan senyawa yang lebih sedikit (spesifik)(23).
2.1.9 Aktivitas Antiproliferatif
Proliferasi merupakan suatu pertumbuhan atau perkembangbiakan sel untuk menghasilkan jaringan baru, bagian sel, maupun keturunan yang berlangsung secara cepat. Suatu senyawa yang dapat menghentikan proses pertumbuhan tersebut melalui berbagai mekanisme disebut sebagai senyawa yang memiliki aktivitas antiproliferatif. Aktivitas antiproliferatif dari suatu senyawa dapat dilihat berdasarkan jumlah sel yang masih hidup setelah pemberian senyawa tersebut.
Salah satu metode yang dapat digunakan untuk menghitung jumlah sel hidup yang masih tersisa adalah metode kolorimetrik yaitu MTT-Assay(9).
2.1.10 MTT-Assay
MTT-Assay merupakan suatu teknik yang sering digunakan untuk menghitung jumlah sel yang masih hidup setelah diberikan senyawa antiproliferatif, teknik ini menggunakan perubahan warna garam tetrazolium atau 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromide (MTT) yang berwarna kuning yang akan dimetabolisme oleh enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat pada mitokondria sel hidup menjadi kristal formazan berwarna ungu. Kristal formazan
9
yang berwarna ungu yang terbentuk akan terlarut dengan penambahan bahan seperti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate). Selanjutnya absorbansi dari larutan kristal formazan dibaca pada panjang gelombang 550-600nm. Intensitas warna yang terbentuk berbanding langsung dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme. Reaksi pembentukan kristal formazan dapat dilihat pada gambar 2.3(9).
Gambar 2.3 Reaksi Pembentukan Kristal formazan(24)
10
2.1.11 Kerangka Teori Penelitian
Gambar 2.4 Kerangka Teori Penelitian Pengembangan Bahan Alam Indonesia
Indonesia memiliki beraneka ragam tumbuhan, salah satunya tumbuhan paku Dryopteris marginalis
Potensi Penelitian :
Dryopteris marginalis merupakan salah satu tumbuhan paku yang banyak ditemukan di Indonesia. Penelitian sebelumnya membuktikan bahwa
tumbuhan ini mengandung senyawa steroid
Banyak penelitian tentang aktivitas antiproliferatif tumbuhan paku melalui kandungan steroid yang terkandung didalamnya
Aktivitas steroid cukup erat hubungannya dengan terjadinya kasus kanker payudara
Uji aktivitas antiproliferatif ekstrak dan fraksi n-heksan tumbuhan paku (Dryopteris marginalis) terhadap kultur sel kanker payudara MCF-7 dan
sel Vero dengan melihat jumlah sel kanker yang masih hidup setelah pemberian ekstrak dan fraksi n-heksan menggunakan metode MTT-Assay
Analisa probid digunakan untuk mengolah data yang diperoleh sehingga didapatkan nilai IC50 yang menunjukkan seberapa jauh potensi antiproliferatif senyawa steroid dari ekstrak dan fraksi n-heksan tumbuhan
paku Dryopteris marginalis
11
2.2 LANDASAN TEORI
Telah banyak penelitian pemanfaatan kandungan metabolit sekunder tumbuhan paku yang dapat dijadikan sebagai bahan baku obat baru. Salah satu tumbuhan paku yang telah banyak diteliti adalah Dryopteris marginalis.
Kandungan metabolit sekunder tumbuhan paku ini memiliki aktivitas antiproliferatif. Kandungan senyawa tersebut merupakan senyawa steroid yaitu β- sitosterol, stigmasterol, kampesterol. Aktivitas antiproliferatif dapat menghambat pertumbuhan sel kanker yang terjadi secara cepat dan tidak terkendali yang akan membentuk jaringan baru yang abnormal hingga ganas.
Pada suatu penelitian diketahui bahwa β-sitosterol dapat berikatan dengan reseptor α dan β dari estrogen yang merupakan mediator kanker. Pada penelitian lainnya diketahui bahwa senyawa stigmasterol dapat menghambat pertumbuhan sel kanker payudara MCF-7. Sel ini merupakan salah satu jenis sel adenokarsinoma payudara manusia yang telah banyak digunakan pada penelitian terkait aktivitas reseptor estrogen, karena kemampuannya untuk memproses estrogen dalam bentuk estradiol melalui reseptor estrogen di sitoplasma sel. Kandungan steroid pada tumbuhan paku Dryopteris marginalis diduga memiliki kandungan senyawa yang sama dan aktivitas yang serupa terhadap sel kanker.
Pada penelitian aktivitas ekstrak n-heksan tumbuhan paku Dryopteris marginalis telah dibuktikan memiliki aktivitas antiproliferatif terhadap sel kultur kanker payudara MCF-7 dan tidak memiliki toksisitas terhadap sel Vero sebagai sel normal. Jadi, untuk mendapatkan senyawa yang lebih spesifik dan memiliki aktivitas antiproliferatif yang lebih baik digunakan fraksi n-heksan dari ekstrak tumbuhan tersebut. Fraksi digunakan karena memiliki jumlah senyawa yang lebih sedikit dibandingan dengan ekstrak. Fraksinasi juga dilakukan karena diharapkan senyawa yang mungkin mengganggu kerja steroid dapat dipisahkan.
2.3 HIPOTESIS
Berdasarkan landasan teori yang telah dipaparkan, dapat disimpulkan sebuah hipotesa bahwa ekstrak dan fraksi n-heksan tumbuhan paku Dryopteris marginalis yang mengandung steroid memiliki aktivitas antiproliferatif terhadap kultur sel kanker payudara MCF-7, dan tidak memiliki toksisitas sebagai antiproliferatif terhadap kultur sel Vero.
12 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini bersifat eksperimental karena menguji aktivitas antipoliferatif dari ekstrak dan fraksi n-heksan daun tumbuhan paku (Dryopteris marginalis) pada sel kanker payudara MCF-7 dan sel Vero.
3.2 Lokasi Penelitian
Penelitian uji antipoliferatif ini dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Program Studi Farmasi, Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta dan Laboratorium Parasitologi, Gedung Radiopoetra, Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.
3.3 Subjek Penelitian
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak dan fraksi n- heksan dari ekstrak tumbuhan paku (Dryopteris marginalis) sebagai senyawa antiproliferatif.
3.4 Objek Penelitian
Objek penelitiannya adalah sel kanker payudara MCF-7 dan sel Vero.
3.5 Instrumentasi Penelitian a. Alat Penelitian
Alat-alat gelas steril, autoklaf, inkubator CO2 (Inc Memmert), tangki nitrogen cair (Cryolab 35), laminar air flow cabinet (LAF), inverted microscop (Olympus), tissue culture flask (Nunclone), timbangan elektrik (Sartorius), mikropipet (Socorex), microplate 96 well (Nunclone), microfilter 0,22 (Pall), microtiter plate reader, tabung konikal (Nunclone), Haemocytometer, kromatografi cair vakum, kromatografi lapis tipis (KLT), rotary evaporator, lampu UV portable, oven, linomat, chamber, sentrifugator, penangas air.
b. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : bahan uji (Tumbuhan paku Dryopteris marginalis; sel uji yang digunakan dalam uji antipoliferatif ini adalah sel kanker payudara MCF-7 dan sel Vero; bahan kimia yang digunakan yaitu akuades, asam klorida (HCl), DMSO (Sulfoxide
13
Dimetil) 0,2%, etanol 70%, FBS (Fetal Bovine Serum), fungison (Gibco), kalium fosfat (KH2PO4), kalium klorida (KCl), media pertumbuhan DMEM (Dulbecco’s Modified Eagel’s Medium), media pertumbuhan M199, reagen MTT, n-heksan, etil asetat, metanol, silika gel GF254, natrium bifosfat (Na2HPO4), natrium bikarbonat (NaHCO3), natrium klorida (NaCl), pereaksi semprot Lieberman-burchard, pereaksi semprot AlCl3, pereaksi semprot dragendrof, PBS (phosphate buffer saline), SDS (sodium dodecyl sulphate) 10% dalam HCl 0,01N, tripsin 0,025%, blue tip, yellow tip(24). 3.6 Cara Kerja
3.6.1 Ekstraksi Tumbuhan Paku
Tumbuhan paku yang telah dikeringkan selama beberapa hari selanjutnya ditimbang untuk diekstraksi. Ekstraksi tumbuhan paku dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut n-heksan. Sebanyak 140g serbuk simplisia kering dimaserasi dengan menggunakan pelarut n-heksan sebanyak 1,5L. Ekstraksi dilakukan selama 3 hari dengan melakukan penggojokan setiap harinya. Ekstraksi ini dilakukan berulang hingga ekstrak yang dihasilkan warnanya menjadi bening dengan pelarut yang sama. Hasil ekstraksi disatukan kemudian dipekatkan dengan cara menguapkan pelarut menggunakan rotary evaporator selama beberapa jam.
Hasil dari ekstraksi didapatkan ekstrak n-heksan. Ekstrak yang didapatkan selanjutnya ditimbang agar dapat dihitung nilai rendemennya(24).
3.6.2 Fraksinasi Ekstrak Tumbuhan Paku
Ekstrak yang memiliki aktivitas antiproliferatif difraksinasi menggunakan kromatografi cair vakum untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung di dalamnya. Sebanyak 1 gram ekstrak ditambahkan dengan serbuk silika sebanyak 1 gram dan diaduk sampai terbentuk serbuk yang kering. Fase diam yang digunakan adalah silika gel GF254 dan fase gerak yang digunakan adalah campuran dari pelarut n-heksan:etil asetat dengan perbandingan volume yang tertera pada tabel 3.1 serta metanol 100%. Eluat yang dihasilkan ditampung dengan flakon dan diuapkan, lalu diperiksa dengan menggunakan KLT (Kromatografi Lapis Tipis). Selanjutnya fraksi yang dihasilkan ditotolkan pada plat silika gel GF254 lalu dielusi dengan menggunakan fase gerak n-heksan:etil asetat (7:3). Fraksi dengan pola pita yang
14
sama digabungkan, kemudian dikeringkan dan ditimbang bobotnya untuk dihitung nilai rendemennya.
Tabel 3.1 Perbandingan Pelarut Fraksinasi
No. n-heksan (mL) Etil Asetat (mL) Metanol (mL)
1. 10 0 0
2. 8 2 0
3. 7 3 0
4. 5 5 0
5. 3 7 0
6. 2 8 0
7. 0 10 0
8. 0 0 10
3.6.3 Uji Fitokimia Fraksi Aktif
Fraksi aktif dielusi kembali dengan menggunakan plat silika gel GF254
dengan menggunakan perbandingan pelarut yang sesuai. Kemudian plat hasil elusi disemprot dengan menggunakan pereaksi semprot yaitu Lieberman-burchard, AlCl3, dan Dragendrof, selanjutnya plat dikeringkan selama 1 menit di dalam oven pada suhu 50°C. Dilihat perubahan warna yang terjadi untuk setiap plat(25).
3.6.4 Analisis Kandungan Sisa Pelarut
Ekstrak kental sebanyak 100mg dilarutkan dengan pelarut etil asetat sebanyak 5mL. Kemudian larutan ekstrak diambil dengan jarum injeksi kromatografi gas sebanyak 1µL. Setelah itu alat kromatografi gas dipastikan siap untuk digunakan. Terakhir ditekan tombol start untuk menjalankan alat kromatografi gas.
Pengujian sisa pelarut ekstrak menggunakan kromatografi gas dengan tambahan detektor spektrofotometer massa, menggunakan fase diam Rtx-5Ms dengan fase gerak helium. Tekanan kolom yang digunakan adalah 12kPa. Panjang kolom yang digunakan adalah 30m dengan diameter 0,25mm. Suhu injektor yang digunakan adalah 300°C dan suhu oven yang digunakan adalah 70°C.
15
3.6.5 Pembuatan Seri Kadar
Dibuat dua larutan uji DMEM untuk sel MCF-7 dan M199 untuk sel Vero, dengan cara: Ekstrak dan Fraksi kental Dryopteris marginalis ditimbang sebanyak 10mg dan dilarutkan menggunakan pelarut DMSO 100% sebanyak 0,1mL, sehingga diperoleh larutan induk dengan konsentrasi 100.000 μg/mL. Selanjutnya dilakukan pengenceran terhadap 20µL larutan induk dengan 980µL DMEM untuk sel MCF-7 dan M199 untuk sel Vero sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 2000µg/mL. Kemudian dilakukan pengenceran bertingkat 2:1 dari 1000µL larutan dengan konsentrasi 2000µg/mL. Diperoleh seri konsentrasi 2000μg/mL, 1000μg/mL, 500μg/mL, 250μg/mL, 125μg/mL, 62,5μg/mL, untuk larutan uji dengan media DMEM yang akan diujikan terhadap sel MCF-7 dan untuk larutan uji dengan media M199 yang akan diujikan terhadap sel Vero sampai dengan konsentrasi 31,25μg/mL(24).
3.6.6 Kultur Sel
Sel yang inaktif dalam wadah ampul diambil dari tangki nitrogen cair dan segera dicairkan pada suhu 37°C. Ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam tabung konikal steril yang berisi media masing-masing sel (sel kanker payudara MCF-7 dan sel Vero). Suspensi sel disentrifgasi 2000 rpm selama 5 menit, kemudian bagian supernatan dibuang, endapan putih yang terdapat di dasar konikal adalah koloni sel. Setelah supernatan dibuang, diganti media yang baru kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel disentrifugasi lagi selama 5 menit, supernatan dibuang, pellet ditambah pada 1 mL media penumbuh dengan FBS 10%, diresuspensikan perlahan hingga homogen. Selanjutnya sel ditumbuhkan dalam beberapa tissue culture flask kecil (3-4 buah), diinkubasikan dalam inkubator CO2
5% dengan suhu 37°C. Dilihat 2-3 hari, media diganti dan sel ditumbuhkan lagi hingga konfluen (sel telah memenuhi flask) dan jumlahnya cukup untuk penelitian(24).
3.6.7 Panen Sel
Setelah jumlah sel cukup, media dibuang dan sel konfluen dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali sampai bersih dari media, lalu larutan tersebut dibuang.
Ditambahkan 1mL tripsin 0,025%, didiamkan 5 menit dalam inkubator CO2 5%, kemudian diamati dibawah mikroskop inverted dengan perbesaran 100 kali sampai
16
terlihat sel terlepas. Dilakukan resuspensi untuk membantu sel terlepas dari dinding plate. Dipindahkan sel ke tabung konikel, dihentikan kerja tripsin dengan media kultur 2mL dan ditambahkan PBS 1 x 10 mL. Disentrifugasi dengan kecepatan 1.500rpm selama 15 menit, kemudian supernatan dibuang. Ditambahkan 1mL media M199 untuk sel Vero dan media DMEM untuk sel MCF-7, diresuspensi sampai pellet terlepas. Jumlah sel dihitung dengan cara:
𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑠𝑒𝑙 𝑑𝑎𝑙𝑎𝑚 4 𝑏𝑖𝑙𝑖𝑘 × 104 𝑠𝑒𝑙/𝑚𝐿 4
Jumlah sel yang telah diketahui kemudian dibuat untuk 10.000 sel/sumuran(24). 3.6.8 Uji Antipoliferatif Ekstrak dan Fraksi n-Heksan
Masing-masing suspensi sel dalam media kultur (M199 untuk sel Vero dan DMEM untuk sel MCF-7) sebanyak 100μL dimasukkan pada masing-masing microplate 96 lubang sumuran. Setelah itu ditambahkan larutan uji pada berbagai konsentrasi ekstrak dan fraksi masing-masing sebanyak 100μL kecuali pada sumuran kontrol media dan kontrol sel. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37°C dalam inkubator CO2 5% selama 24 jam. Ke dalam masing-masing sumuran ditambahkan 100μL larutan 1 mg/ml MTT, diinkubasi selama 3 - 4 jam pada suhu 37°C, dalam inkubator CO2 5%. Setelah 3-4 jam terlihat adanya endapan ungu kristal formazan. Reaksi MTT dihentikan dengan menambahkan 100μL SDS 10%.
Selanjutnya serapan dibaca dengan microtiter plate reader pada panjang gelombang 595 nm. Pada metode MTT, persentase kematian sel merupakan selisih absorbansi kontrol media dengan absorbansi sampel dibagi selisih absorbansi kontrol sel dengan kontrol media dikalikan 100%. Perhitungan persen penghambatan (inhibisi) sel menggunakan metode MTT menggunakan rumus berikut:
Persentase sel hidup (%)
= 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑢𝑗𝑖 – 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘 (𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑎𝑛 𝑀𝑇𝑇)
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑠𝑒𝑙 – 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘 (𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑎𝑛 𝑀𝑇𝑇)× 100%
Persen kematian sel (%)
= 100% − 𝑝𝑒𝑟𝑠𝑒𝑛𝑡𝑎𝑠𝑒 𝑠𝑒𝑙 ℎ𝑖𝑑𝑢𝑝
17
Uji antipoliferatif ini dilakukan baik pada sel MCF-7 maupun sel Vero dengan mekanisme kerja yang sama(24).
3.6.9 Metode Analisa Hasil
Hasil persentase penghambatan (inhibisi) digunakan untuk menentukan persentase hidup sel yang akan dipakai untuk menghitung harga IC50 dengan menggunakan persamaan regresi linier. Berdasarkan data yang didapatkan dibuat regresi linier hubungan antara konsentrasi sebagai X dengan nilai persentase kematian sebagai nilai Y, selanjutnya ditarik garis lurus yang paling baik melalui titik–titik yang ada (berdasarkan penglihatan) dan konsentrasi pada garis ini yang menyatakan 50% kematian sel (probit-5). Didapatkan persamaan regresi linier dari grafik yang dibentuk yaitu y=bx+a. Kemudian dengan menggunakan persamaan ini nilai IC50 dihitung dengan memasukkan nilai y=50(24).
18
3.7 Kerangka Umum Penelitian
Gambar 3.1 Kerangka Umum Penelitian
Koleksi sampel tumbuhan paku D. marginalis dari Jl. Kaliurang KM 20
Determinasi sampel
Penyortiran, pencucian dan pengeringan sampel
Ekstraksi sampel
Pembuatan ekstrak kental dengan rotary evaporator
Pembuatan fraksi dengan kromatografi cair vakum
Pembuatan reagen uji dan larutan uji
Kultur sel kanker payudara MCF-7 dan sel Vero
Panen sel
Uji antiproliferatif ekstrak dan fraksi tumbuhan Dryopteris marginalis terhadap sel kanker payudara MCF-7 dan sel Vero
Analisa data
19
3.8 Kerangka Konsep Penelitian
Gambar 3.2 Kerangka Konsep Penelitian
Variabel Independen Variabel Dependen
Perlakuan
Penambahan ekstrak dan fraksi
n-heksan D.
marginalis
Tanpa penambahan ekstrak dan fraksi
n-heksan D.
marginalis
Efek antiproliferatif (+)
Efek antiproliferatif (-)
Nilai Absorbansi
Nilai Absorbansi
20 BAB IV PEMBAHASAN
4.1 Hasil Kaji Etik Penelitian
Sebelum penelitian ini dimulai dilakukan kaji etik terlebih dahulu apakah penelitian ini boleh dilakukan atau tidak. Kaji etik penelitian dilakukan oleh Komite Etik Penelitian Kedokteran dan Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Islam Indonesia. Dari hasil kaji etik penelitian ditetapkan bahwa penelitian ini telah lulus kaji etik berdasarkan surat keputusan nomor: 24/Ka.Kom.Et/70/KE/V/2016 (Lampiran 1). Dengan diberikannya surat keterangan lulus kaji etik penelitian ini berarti penelitian yang akan dilakukan ini sudah sesuai dengan kaidah penelitian yang seharusnya. Kaidah penelitian yang dimaksud adalah intervensi ataupun cara perlakuan peneliti terhadap subjek uji yang nantinya akan dilakukan, serta penelitian ini telah memenuhi etika ilmiah suatu penelitian. Penelitian ini juga membutuhkan kaji etik karena objek yang digunakan merupakan bagian dari sel kanker, sehingga diharapkan tidak terjadinya kontaminasi terhadap diri sendiri maupun lingkungan jika metode dan etika yang dilakukan telah lulus dalam kaji etik penelitian.
4.2 Hasil Identifikasi Tumbuhan
Penelitian ini dimulai dengan mengumpulkan tumbuhan paku dari daerah Kaliurang KM 20. Sebelum dilakukan pengumpulan ini terlebih dahulu dilakukan identifikasi tumbuhan paku Dryopteris marginalis di Laboratorium Sistematika Tumbuhan, Fakultas Biologi, Universitas Gadjah Mada untuk memastikan kebenaran tumbuhan paku yang digunakan. Jika tumbuhan paku yang digunakan merupakan spesies yang berbeda kandungan ataupun efektivitasnya akan memberikan hasil yang berbeda. Hal ini dikarenakan setiap tumbuhan memiliki kandungan ataupun efektivitas yang berbeda-beda. Dari hasil identifikasi tumbuhan paku yang diperoleh menunjukkan bahwa tumbuhan paku yang digunakan merupakan tumbuhan paku yang benar yaitu Dryopteris marginalis (Lampiran 2).
Hal ini berarti tumbuhan paku yang digunakan dalam penelitian sudah tepat dan merupakan spesies Dryopteris marginalis, sehingga tumbuhan yang digunakan dalam penelitian benar-benar merupakan tumbuhan paku yang ingin diteliti.
21
4.3 Hasil Ekstraksi dan Fraksinasi
Tumbuhan paku yang telah dikumpulkan memiliki berat basah seberat 820g dan setelah dikeringkan menjadi seberat 150g. Tumbuhan paku yang telah dikeringkan selanjutnya diserbuk dengan menggunakan filler dan menghasilkan serbuk seberat 140g yang selanjutnya diekstraksi dengan metode maserasi.
Ekstraksi tumbuhan paku sebanyak 140g serbuk yang dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut n-heksan sebanyak 1,5L selama 3 hari dan diremaserasi sebanyak dua kali menghasilkan ekstrak sebanyak 9,62g (gambar 4.1).
Didapatkan rendemen ekstrak sebesar 6,87%. Nilai rendemen yang didapatkan menggambarkan berapa banyak senyawa yang tersari dari serbuk simplisia yang digunakan pada saat proses maserasi.
Gambar 4.1 Ekstrak n-heksan
Ekstrak kental ini selanjutnya difraksinasi menggunakan Kromatografi Cair Vakum (KCV) dengan menggunakan pelarut n-heksan:etil asetat dan metanol dengan beberapa perbandingan pelarut yang sesuai (tabel 4.1) dan 20 gram serbuk silika sebagai medianya. Serbuk silika yang dimasukkan ke dalam suatu kromatografi cair vakum haruslah benar-benar rapat dan tidak memiliki rongga lagi.
Jika masih ada rongga antar partikel silika, pemisahan yang dilakukan tidak akan sempurna. Hal ini dikarenakan memungkinkan adanya senyawa yang lebih dulu mencapai dasar kolom dan hal ini akan membuat pita yang terbentuk tidaklah lurus.
Pemisahan senyawa berdasarkan pita-pita yang terbentuk akan sulit dilakukan.
Proses fraksinasi yang dilakukan dapat dilihat pada gambar 4.2, dari kiri ke kanan menunjukkan proses pemisahan yang dilakukan berdasarkan pita-pita yang
22
terbentuk dan dilakukan hingga tidak ada lagi senyawa yang dapat disari oleh pelarut. Jadi, dapat dikatakan bahwa pemisahan yang dilakukan sudah baik karena fraksi dipisahkan berdasarkan pita yang terbentuk dan dilakukan hingga tidak ada lagi senyawa yang dapat dipisahkan.
1 2 3 4 Gambar 4.2 Proses fraksinasi dengan kromatografi cair vakum
Keterangan: proses fraksinasi ekstrak n-heksan tumbuhan paku Dryopteris marginalis dengan menggunakan kromatografi cair vakum dilakukan berdasarkan pita yang terbentuk pada silika, yang menggunakan campuran pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol. Pita yang terbentuk ditunjukkan pada gambar dengan panah berwarna biru. Pemisahan dilakukan hingga tidak ada lagi pita yang terbentuk.
Tabel 4.1 Fraksi Yang Dihasilkan dari Proses Fraksinasi
Perbandingan Pelarut Fraksi yang dihasilkan n-heksan (mL) etil asetat (mL) metanol (mL)
10 0 0 1
8 2 0 2 dan 3
7 3 0 4, 5, 6
5 5 0 6, 7, 8, 9
3 7 0 9 dan 10
2 8 0 10
0 10 0 -
0 0 10 11, 12, 13
Keterangan: Fraksi yang dihasilkan dengan pelarut etil asetat 100% tidak memiliki nilai rendemen sehingga dianggap tidak ada.
Pada tabel 4.1 dapat dilihat hasil dari proses fraksinasi yang telah dilakukan menghasilkan sebanyak 13 fraksi. Fraksi 1 dihasilkan dengan hanya menggunakan pelarut n-heksan, fraksi 2 hingga 10 dihasilkan dari perbandingan pelarut n-heksan dan etil asetat, dan yang terakhir fraksi 11 hingga 13 dihasilkan dengan hanya menggunakan pelarut metanol. Dari tabel juga dapat dilihat bahwa satu perbandingan pelarut dapat menghasilkan beberapa pita atau fraksi. Semua fraksi
23
yang dihasilkan selanjutnya diuji dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) untuk mengetahui fraksi-fraksi yang memiliki pola pita yang sama dengan menggunakan fase diam silika gel GF254 dan fase geraknya merupakan perbandingan pelarut n- heksan:etil asetat (7:3). Hasil elusi dapat dilihat pada gambar 4.3 dan 4.4 serta nilai Rf dan hRfnya dapat dilihat pada tabel 4.2.
(a)
(b)
(c)
Gambar 4.3 Hasil identifikasi fraksi dengan eluen n-heksan : etil asetat (7:3)
Keterangan : (a) Hasil elusi fraksi 1-13 pada sinar tampak; (b) Hasil elusi fraksi 1-13 pada sinar UV 254; (c) Hasil elusi fraksi 1-13 pada sinar UV 366. Pada gambar c dapat dilihat spot-spot fraksi yang dihasilkan pada lingkaran berwarna orange.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
24
Berdasarkan hasil elusi pada gambar 4.3 fraksi 10 hingga 13 belum dapat diidentifikasi dengan menggunakan fase gerak tersebut, sehingga keempat fraksi tersebut diidentifikasi kembali dengan menggunakan fase gerak n-heksan:etil asetat (2:8) agar proses penggabungan fraksi yang dilakukan tepat dan merupakan hasil yang merepresentasikan fraksi secara tepat. Berdasarkan hasil elusi yang dapat dilihat pada gambar 4.3 dan gambar 4.4 beberapa fraksi masih memiliki spot yang sama seperti fraksi 3 dan 4, fraksi 5 dan 6, fraksi 7 dan 8, serta fraksi 12 dan 13 yang dapat dilihat dengan nilai Rf dan hRf yang sama, yang dimiliki oleh fraksi- fraksi tersebut. Fraksi-fraksi tersebut kemudian disatukan karena masih ada beberapa fraksi yang memiliki spot yang sama. Setelah fraksi dengan spot yang sama disatukan, fraksi yang didapatkan ada sebanyak 9 fraksi. Berdasarkan hasil elusi ini juga dapat dilihat bahwa pemisahan atau fraksinasi yang dilakukan berhasil karena spot-spot yang dihasilkan oleh tiap fraksi berbeda-beda. Hal ini juga dapat diartikan bahwa tiap-tiap fraksi mengandung beberapa senyawa yang berbeda yang menandakan pemisahan senyawa yang dilakukan sudah baik.
(a) (b) (c)
Gambar 4.4 Hasil identifikasi fraksi dengan eluen n-heksan : etil asetat (2:8)
Keterangan : (a) Hasil elusi fraksi 10-13 pada sinar tampak; (b) Hasil elusi fraksi 10-13 pada sinar UV 254; (c) Hasil elusi fraksi 10-13 pada sinar UV 366. Pada gambar c dapat dilihat spot-spot fraksi yang dihasilkan pada lingkaran berwarna orange.
Sembilan fraksi tersebut selanjutnya dikeringkan untuk dihitung bobotnya sehingga dapat diketahui berapa persen rendemen yang dimiliki oleh fraksi (Lampiran 4). Fraksi B merupakan fraksi dengan bobot terbesar yaitu sebesar 0,2664 gram dengan nilai rendemen sebesar 26,64% sedangkan fraksi F yang memiliki senyawa paling banyak hanya memiliki nilai rendemen sebesar 14,72%
(tabel 4.3).
10 11 12 13 10 11 12 13 10 11 12 13
25
Tabel 4.2 Hasil Rf, hRf, dan penggabungan fraksi
Fraksi Spot Rf hRf Penggabungan
Fraksi
Nama Fraksi
1 2 0,10
0,95
100
95 1 A
2 1 0,99 99 2 B
3 4
0,96 0,87 0,81 0,71
96 87 81
71 3,4 C
4 4
0,96 0,87 0,80 0,70
96 87 80 70
5 5
0,87 0,80 0,67 0,57 0,51
87 80 67 57
51 5,6 D
6 5
0,87 0,80 0,67 0,57 0,51
87 80 67 57 51
7 3
0,84 0,78 0,61
84 78
61 7,8 E
8 3
0,84 0,78 0,61
84 78 61
9 10
0,85 0,77 0,65 0,61 0,56 0,47 0,42 0,35 0,28 0,22
85 77 65 61 56 47 42 35 28 22
9 F
10 3
0,75 0,64 0,55
75 64 55
10 G
11 2 0,76
0,61
76
61 11 H
12 3
0,79 0,74 0,60
79 74
60 12,13 I
13 3
0,80 0,74 0,60
80 74 60
26
Tabel 4.3 Bobot Fraksi Yang Dihasilkan
Fraksi Bobot Fraksi (g) Rendemen (%)
A 0,0849 8,49
B 0,2664 26,64
C 0,1617 16,17
D 0,0883 8,83
E 0,0604 6,04
F 0,1472 14,72
G 0,0382 3,82
H 0,0366 3,66
I 0,0216 2,16
Jumlah 0,9053 90,53
4.4 Hasil Uji Sisa Pelarut Ekstrak
Pelarut n-heksan yang digunakan dalam penelitian ini merupakan salah satu pelarut organik yang dapat menyebabkan kematian pada sel(26). Oleh sebab itu dilakukan pengujian sisa pelarut ekstrak untuk memastikan bahwa hasil kematian sel yang didapatkan bukanlah dari pelarut yang digunakan melainkan berasal dari aktivitas senyawa yang telah diekstrak sehingga hasil yang didapatkan tidak bias dan merupakan hasil aktivitas yang sesungguhnya. Pengujian sisa pelarut ini dapat dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Gas karena sifat yang dimiliki dari pelarut n-heksan yang mudah menguap dengan titik didih 69°C(26). Hal ini juga sesuai dengan prinsip dari penggunaan Kromatografi Gas yaitu memisahkan senyawa berdasarkan volatilitasnya(27). Pengujian sisa pelarut ini tidak hanya menggunakan kromatografi gas saja melainkan ditambahkan dengan pengujian menggunakan spektrofotometri massa. Penambahan penggunaan spektrofotometri massa ini bertujuan untuk mengetahui senyawa dari pelarut yang digunakan, karena dengan kromatografi gas hanya didapatkan berapa banyak jumlah senyawa yang terkandung dalam larutan tersebut. Dipadukannya kedua metode ini diharapkan hasil yang didapatkan menjadi lebih akurat, karena beberapa senyawa dapat memiliki peak yang sama. Hal ini akan membuat hasil yang didapatkan sulit untuk dipastikan dan hanya dapat dibandingkan dengan literatur.
27
(a)
(b)
Gambar 4.5 Hasil Kromatogram standar n-heksan. Kromatogram Gas Chromatography (GC) (a) dan Kromatogram Mass Spectrophotometry (b).
(a)
(b)
Gambar 4.6 Hasil Kromatogram ekstrak n-heksan tumbuhan paku D. marginalis.
Kromatogram Gas Chromatography (a) dan Kromatogram Mass Spectrophotometry (b)
Keterangan: etil asetat yang terbaca pada kromatogram merupakan pelarut yang digunakan untuk melarutkan ekstrak pada saat pengujian dengan kromatografi gas.
28
Berdasarkan hasil penguajian didapatkan bahwa sampel ekstrak yang digunakan tidak mengandung pelarut n-heksan (Lampiran 3). Hasil ini membuktikan bahwa ekstrak yang digunakan untuk fraksinasi sudah tidak mengandung pelarut n-heksan lagi. Serta ekstrak yang digunakan dalam pengujian aktivitas antiproliferatif terhadap kultur sel kanker payudara MCF-7 merupakan efektivitas dari ekstrak tersebut bukanlah efek dari kandungan pelarut n-heksan yang digunakan dalam proses ekstraksi. Hal ini dapat dilihat pada kromatogram (gambar 4.5a dan gambar 4.6a) yang dihasilkan memiliki peak yang berbeda yaitu 2,365 untuk waktu retensi standar n-heksan dan 2,393 untuk waktu retensi ekstrak.
Berdasarkan nilai peak dari kedua larutan uji dapat dilihat bahwa nilai yang dihasilkan tidak terlalu jauh berbeda sehingga dilakukan pembacaan senyawa dengan spektrofotometer massa agar dapat dipastikan senyawa tersebut berbeda walaupun memiliki nilai peak yang tidak jauh berbeda. Berdasarkan hasil pembacaan dengan spektrofotometer massa pada gambar 4.5b dan gambar 4.6b dapat dilihat bahwa pelarut yang terkandung dalam standar merupakan n-heksan dan yang terkandung dalam ekstrak merupakan etil asetat. Jadi, dapat disimpulkan bahwa ekstrak yang digunakan tidak mengandung pelarut n-heksan.
4.5 Hasil Uji Antiproliferatif Ekstrak dan Fraksi
Pada penelitian ini dilakukan pengujian sampel terhadap dua sel yaitu sel MCF-7 sebagai sel kanker payudara dan sel Vero sebagai sel normal. Pengujian sampel terhadap sel MCF-7 dilakukan untuk mendapatkan aktivitas antiproliferatif dari ekstrak dan fraksi sedangkan pengujian sampel terhadap sel Vero dilakukan untuk mengetahui toksisitas dari ekstrak dan fraksi. Sel MCF-7 merupakan sel kanker payudara yang mengekspresikan reseptor estrogen (ER+) dengan wild type p53 sehingga sensitive terhadap agen kemoterapi. Sel MCF-7 dapat memproses estrogen dalam bentuk estradiol melalui reseptor estrogen dalam sitoplasma sel.
Pertumbuhan dari sel MCF-7 dapat dihambat dengan tumor necrosis factor alpha (TNFα) dan senyawa antiestrogen (senyawa yang dapat menghalangi ikatan estrogen dengan reseptornya)(13,22). Sel MCF-7 pada penelitian ini terlihat dari mikroskop (perbesaran 100 kali) berbentuk bulat dan bergerombol (gambar 4.7 a).
Sel Vero banyak digunakan dalam penelitian karena dapat bereplikasi secara cepat dan tidak terbatas pada suatu media secara in vitro. Sel ini menempel dengan kuat
29
pada lapisan substrat yang berbahan polistiren dan membentuk ikatan kovalen(23). Sel Vero pada penelitian ini terlihat dari mikroskop (perbesaran 100 kali) berbentuk pipih dan menempel pada permukaan plate (gambar 4.7 b). Terlihat dari mikroskop bahwa sel yang memiliki kualitas baik dan dapat digunakan dalam penelitian, adalah sel yang terlihat menempel pada dinding tissue culture flask.
(a) (b)
Gambar 4.7 Kultur sel MCF-7 (a) dan kultur sel Vero (b) dibawah mikroskop perbesaran 100 kali (tanda selnya yg mana)
Pengujian aktivitas antiproliferatif terhadap kultur sel kanker payudara MCF-7 yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan sebanyak 10 larutan uji.
Salah satunya merupakan ekstrak n-heksan tumbuhan paku D. marginalis dan sisanya merupakan fraksi yang dihasilkan dari ekstrak n-heksan. Kemudian untuk pengujian toksisitasnya dalam membunuh sel hanya digunakan 4 larutan uji yang memiliki aktivitas antiproliferatif paling baik. Pengujian aktivitas antiproliferatif larutan uji dilakukan dengan membuat 6 seri kadar yaitu 62,5ppm, 125ppm, 250ppm, 500ppm, 1000ppm, 2000ppm sedangkan untuk pengujian toksisitasnya dilakukan dengan membuat 7 seri kadar dimulai dari 31,25ppm. Semua seri kadar dilakukan pengulangan atau replikasi sebanyak 3 kali, yang disusun dalam plate 96 sumuran (Lampiran 5).
Uji aktivitas ekstrak dan fraksi tumbuhan paku Dryopteris marginalis sebagai agen antiproliferatif dilakukan dengan menggunakan metode MTT-assay.
MTT-Assay merupakan suatu teknik yang sering digunakan untuk menghitung jumlah sel yang masih hidup setelah diberikan senyawa antiproliferatif. Teknik ini menggunakan garam tetrazolium atau MTT yang berwarna kuning yang akan
