DISERTASI
AKTIVITAS SENYAWA TERPENOID JAMUR DEWA (Agaricus blazei Murill) SEBAGAI ANTIKANKER SEL MCF-7
DENGAN MEKANISME KERJA INDUKSI APOPTOSIS
MISGIATI
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2021
DISERTASI
AKTIVITAS SENYAWA TERPENOID JAMUR DEWA (Agaricus blazei Murill) SEBAGAI ANTIKANKER SEL MCF-7
DENGAN MEKANISME KERJA INDUKSI APOPTOSIS
MISGIATI
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA 2021
ii
AKTIVITAS SENYAWA TERPENOID JAMUR DEWA (Agaricus blazei Murill) SEBAGAI ANTIKANKER SEL
MCF-7 DENGAN MEKANISME KERJA INDUKSI APOPTOSIS
DISERTASI
Untuk memperoleh Gelar Doktor dalam Program Studi Doktor Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
dan telah dipertahankan di hadapan Panitia Ujian Disertasi Terbuka pada Hari Selasa
Tanggal 9 Februari 2021
Oleh
MISGIATI NIM 051317097302
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
2021
Disertasi ini telah diuji pada Ujian Terbuka Disertasi Tanggal 9 Februari 2021
PANITIA PENGUJI TERBUKA DISERTASI
Ketua : Prof. apt. Junaidi Khotib, S.Si., M.Kes., Ph.D.
Anggota :
1. Prof. Dr. apt. Sukardiman, M.S 2. Dr. apt. Aty Widyawaruyanti, M.Si 3. Prof. Dr. apt. Siswandono, M.S 4. Prof. Dr. apt. Roiha Mutia, M.Biomed
5. Dr. apt. Bilal Subchan Agus Santoso, M.Farm 6. Dr. Sentot Joko Rahardjo, M.Si
7. apt. Tutik Sri Wahyuni, S.Si., M.Si., Ph.D.
8. Dr. apt. Juni Ekowati, M.Si 9. Dr. apt. Retno Sari., M.Sc
Ditetapkan dengan Surat keputusan Dekan Fakultas Farmasi Universitas airlangga
Nomor: 14/UN3.I.5/2021
UCAPAN TERIMA KASIH
Alhamdulillah, segala puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan Rahmat dan HidayahNya, sehingga kami dapat menyelesaukan disertasi ini dengan judul AKTIVITAS SENYAWA TERPENOID JAMUR DEWA (Agaricus blazei Murill) SEBAGAI ANTIKANKER SEL MCF-7 DENGAN MEKANISME KERJA INDUKSI APOPTOSIS. Disertasi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mendapat gelar Doktor di Program Pascasarjana Ilmu Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Airlangga. Penulis berharap bahwa penelitian ini dapat memberikan sumbangsih dalam pengobatan kanker, meskipun hanya sebagian kecil saja. Selesainya disertasi ini tidak lepas dari dukungan berbagai pihak yang memperlancar proses studi maupun penelitian. Untuk itu penulis mengucapkan terimakasih kepada:
Prof. Dr. apt. Sukardiman, M.S., sebagai promotor yang telah membimbing dengan penuh kesabaran dan keikhlasan serta selalu memberi semangat untuk menyelesaikan program doktor. Beliau senantiasa meluangkan waktu, memberikan tauladan dalam mengembangkan diri agar menjadi pribadi yang ulet dalam bekerja dan berani menerima tantangan
Dr. apt. Aty Widyawaruyanti, M.S., sebagai ko-promotor yang telah membimbing dan menuntun saya dalam menyelesaikan disertasi. Beliau telah
mengajari saya untuk menjadi pribadi yang kuat dan mandiri dan penuh semangat dalam menghadapi segala macam tantangan
Rektor Universitas Airlangga, Prof Dr. apt. Fasichul Lisan (2010- 2015) dan Prof Dr. apt. Mohammad Nasih, S.E., M.T., Al., CMA. (2015-sekarang) telah memberi kesempatan bagi penulis untuk menempuh program Studi S3 Ilmu Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
Ketua Umum Yayasan Putera Indonesia Malang, M.Wahyudi, S.E yang telah memberi ijin kepada penulis untuk menempuh program S3 yang kedua
Dekan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Prof. Dr. apt. Umi Athiyah, M.S (2010-2020) dan Prof. apt. Junaidi Khotib, S.Si, M.Kes., Ph.D yang telah memberikan kesempatan dan arahan bagi penulis dalam menempuh Program Studi S3
Ketua Program Studi Ilmu Farmasi, Prof. Dr. apt. Siswandono, M.S. (2010- 2020) dan Prof. Dr. apt. Djoko Agus Purwanto, M.Si, (2020- sekarang) yang selalu dengan sabar dan telaten memberikan motivasi dan semangat kepada saya agar segera menyelesaikan program Doktor.
Seluruh tim penguji Prof. Dr. apt. Sukardiman, M.S.; Dr. apt. Aty Widyawaruyanti, M.S.; Prof. Dr. apt. Siswandono, M.S.; Prof. Dr. apt. Bambang Prajoga E.W., M.S.; Prof Dr. apt. Suko Hardjono, M.S.; Prof. Dr. apt. Mangestuti Agil, M.S.; apt. Suciati, S.Si, M.Phil, Ph.D.; apt. Rr. Retno Widyowati, M.Pharm., Ph.D, Dr Awik Puji Dyah Nurhayati, M.Si
Rekan rekan di NPMRD (Kelompok Studi Herbal Medicine) Lembaga Penyakit Tropik Universitas Airlangga, apt. Lidya Tumewu, M.Farm.; Hikatul Ilmi,
M.Si.; Fendi M.Farm; dan rekan-rekan di laboratorium parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gajahmada Yogjakarta Bu Atin dan Mas Farid, terimakasih atas waktu, diskusi dan bantuannya selama menyelesaikan penelitiannya.
PT Agaricus Sido Makmur Sentosa Lawang yang telah memberikan bahan baku Jamur dewa kering
Kedua almarhum orang tua saya, kakak kakakku, dan ibu mertua yang telah mendidik saya, bantuan doa dan memberi bekal kepada penulis hingga bisa sampai pendidikan doktor yang kedua ini.
Suami Mohammad Faizin Dahlan, S.Pd yang selalu memberikan motivasi, doa, dukungan dan pastinya selalu memberikan ijin untuk menempuh jenjang pendidikan lanjut.
Nahda Aqila Faiza, Gabhiella Ghina Faiza, dan Ghibra Maheera Faiza, anak- anakku tercinta, yang menjadi penyemangat, pendukung dan penghibur saya dalam menyelesaikan pendidikan doktor.
Teman-teman Program Doktor Dr. apt. Triwidiadani, Sp.FRS.; Dr. apt. Yudi, M.S., Dr. apt. Sahad Saragih, M.S.; Dr. apt. Suzana, M.S.; Dr. apt. Agriana Mansur, M.Farm.; apt. Nuri, M.Farm.; dan Dra. apt. Endang Susilowati, M.Farm.Klin.
Teman-teman di Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang, Anggraeni In Oktavia, M.Ling.; Ayu Ristamaya Yususf, S.T.; Ratna Kristiawati, A.Md. Farm.; dan Dr. Sentot Joko Rahardjo, M.Si, atas dukungan dan bantuannya selama menempuh pendidikan doktor
Sahabat-sahabat terbaikku yang selalu memberikan motivasi dalam menyelesaikan pendidikan doktor.
Teman-teman yang tidak bisa saya sebutkan di sini satu persatu, terimakasih atas motivasi dan doanya untuk penulis dalam menyelesaikan program doktor.
Terimakasih atas segala perhatian dan dukungan bapak/ ibu kepada saya selama ini, Semoga Allah SWT memberikan balasan terbaikNya kepada bapak/ibu sekalian. Akhir kata saya ucapkan terimakasih dan penelitian ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu farmasi khususnya bagi masyarakat secara umum
RINGKASAN
AKTIVITAS SENYAWA TERPENOID JAMUR DEWA (Agaricus blazeii Murill) SEBAGAI ANTIKANKER SEL MCF-7 DENGAN MEKANISME
KERJA INDUKSI APOPTOSIS
Misgiati
Bahan alam dapat digunakan dalam pengembangan pengobatan antikanker untuk penanganannya. Hal ini dikarenakan pengobatan kanker melalui proses kemoterapi, pembedahan, radioterapi belum bisa menanggulangi secara efektif terhadap penyakit tersebut. Kegagalan pengobatan disebabkan karena rendahnya selektivitas dalam pengobatan kanker, misalnya pada pengobatan kemoterapi atau radioterapi, sel normal juga mengalami kematian. Strategi pengobatan kanker yang tepat adalah penggunaan bahan alam dengan target molekuler yang spesifik. Bahan alam umumnya mempunyai aktivitas menghambat pertumbuhan kanker melalui mekanisme cell cycle arrest, induksi apoptosis, ataupun menghambat ekspresi protein yang berperan dalam Multi Drug Resistance.
Jamur dewa (Agaricus blazei Murill) adalah salah satu tumbuhan tingkat rendah yang merupakan pangan fungsional dan berpotensi sebagai antikanker baik diuji secara in vitro maupun in vivo. Berdasarkan penelitian pendahuluan terhadap ekstraksi bertingkat dari beberapa pelarut, yaitu n-heksana, diklorometana, kloroform, etil asetat, butanol, metanol, dan air. Proses ekstraksinya dengan ultrasonic selama 30 menit. Hasil identifikasi dengan KLT terdapat terpenoid pada ekstrak n-heksana, diklorometana, kloroform, dan etil asetat. Uji aktivitas dari ekstrak n-heksana, diklorometan, kloroform, etil asetat, dan butanol terhadap sel kanker MCF-7 diperoleh hasil IC50 berturut-turutsebesar 24,72 µg/mL; 22,70 µg/mL;
21,56 µg/mL; 23,49 µg/mL; dan 50,08 µg/mL. Aktivitas ini termasuk dalam kategori strong cytotoxicity. Sedangkan ekstrak etanol dan ekstrak air nilai IC50 lebih dari 500 µg/mL. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lanjutan terhadap masing-masing ekstrak terkait senyawa aktif yang terkandung dalam ekstrak n-heksana.
Tujuan penelitian adalah mendapatkan senyawa aktif antikanker sel MCF-7 dari golongan senyawa terpenoid yang terkandung dalam ekstrak jamur dewa berdasarkan Bioactivity Guided Isolation. Menetapkan mekanisme kerja hasil senyawa yang terdapat dalam ekstrak jamur dewa dengan mekanisme kerja induksi apoptosis.
Bioactivity Guided Isolation dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa aktif antikanker sel MCF-7 dari ekstrak n-heksana jamur dewa. Produksi senyawa aktif dimulai dengan proses ekstraksi, fraksinasi, dan isolasi. Ekstraksi dengan metode maserasi pelarut n-heksana. Ekstrak kemudian difraksinasi dengan metode Vacuum Liquid Chromatography (VLC) menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat secara gradien (100%-0%) dan menghasilkan 3 fraksi (FH1-FH3). Ekstrak dan semua
fraksi diuji aktivitas antikanker sel MCF-7. Nilai IC50 ekstrak n-heksana 15,09 µg/mL. Nilai IC50 fraksi FH1 28,62 µg/ml, FH2 18,31 µg/mL, dan FH3 13,35 µg/mL.
FH3 dipisahkan dengan metode dekantasi pelarut methanol panas, dihasilkan subfraksi SFH3.1 dan SFH3.2. Subfraksi diuji aktivitas antikanker sel MCF-7 nilai IC50 19.21 µg/mL (SFH3.1) dan 19,72 µg/mL (SFH3.2).
SFH3.2 dipisahkan dengan metode Kromatografi Cepat Kinerja Tinggi (KCKT) dihasilkan 5 isolat (SFH3.1.1-SFH3.1.5). Isolat diuji aktivitas antikanker sel MCF-7 nilai IC50 43,12 µg/mL (SFH3.1.2), 211 µg/mL (SFH3.1.3), dan 128,21 µg/mL (SFH3.1.5), untuk SFH3.1.1 dan SFH3.1.4 jumlahnya tidak bisa ditimbang.
Hasil SFH3.1.2 pada penelitian ini diperoleh senyawa berbentuk serbuk amorf berwarna putih, memiliki spektrum UV maks 262, 271, 282, dan 293 nm.
Berdasarkan proton spektrum 1H-NMR, (i) terdapat sinyal proton alifatik yang tumpang tindih pada daerah 0,50-2,50 bpj yang menandakan ciri khas terpenoid, (ii) terdapat enam sinyal metil pada geseran δ 0,93 (3H, s, H-18); 0,62 (3H, s, H-19);
1,03 (3H, d, J=6,5 Hz, H-21); 0,92 (3H, d, J=6,5Hz, H-28); 0,84 (3H, d, J=6,6 Hz, H- 26); 0,82 (3H, d, J=6,6 Hz, H-27) bpj, (iii) terdapat sinyal khas pada geseran kimia 3,62 bpj yang muncul sebagai multiplet menjadi ciri khas dari adanya OH yang terikat pada posisi C-3, (iv) terdapat sinyal khas pada geseran kimia 5,38-5,57 bpj yang muncul sebagai multiplet menunjukkan adanya ikatan rangkap. Berdasarkan spektrum 13C-NMR, (i) terdapat 28 sinyal karbon, (ii) satu sinyal karbon teroksigenasi pada 70,5 bpj yang berkorelasi dengan sinyal khas multiplet pada geseran kimia 3,62 bpj (multiplet-1H) (1H-NMR) yang juga menunjukkan adanya OH yang terikat pada karbon (C3) yang teroksigenasi, (iii) terdapat geseran kimia pada 116,4 – 141,5 bpj yang menandakan adanya ikatan rangkap pada posisi C-6 dan C-7, C-21 dan C-22. Dari data 1H-NMR dan 13C-NMR, diketahui senyawa SFH3.1.2 merupakan struktur ergosterol dengan 28 atom karbon, 44 atom proton, dan 1 atom O, yang sesuai dengan data spektrofotometer massa yang menunjukkan hasil m/z 397, 23 [M+-H] yang konsisten dengan rumus molekul C28H44O. Profil spectrum baik proton maupun karbon tersebut sesuai dengan penelusuran pustaka dari ergosterol.
Isolat dari ekstrak n-heksana jamur dewa yang teridentifikasi sebagai ergosterol mempunyai IC50 108,55µM mampu meningkatkan induksi apoptosis sel kanker MCF-7 dengan peningkatan early apoptosis 30,4%, late apoptosis 16,4 %, dan penurunan nekrosis 7,4%. Peningkatan ini berkorelasi dengan akumulasi sel pada siklus sel fase G2/M pada 9,9%.
Berdasarkan penelitian ini dapat disimpulkan bahwa telah diperoleh senyawa aktif hasil isolasi ekstrak n-heksan berupa senyawa aktif anti MCF-7 golongan terpenoid yaitu identik dengan ergosterol [(3)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol]. Senyawa tersebut dapat menghambat pertumbuhan sel kanker MCF-7 dengan mekanisme induksi apoptosis dan menghambat siklus sel pada fase G2/M.
Saran yang dapat diberikan adalah (i) senyawa ergosterol memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa marker dari ekstrak n-heksana jamur dewa.
Dalam hal ini untuk pengembangan fitofarmaka dari ekstrak etanol 96% jamur dewa, (ii) Perlunya ditelusuri lebih lanjut untuk ergosterol dengan mekanisme kerja terkait mekanisme kerja molekulernya, (iii) perlunya ditelusuri lebih lanjut tentang penemuan senyawa aktif antikanker lainnya dari ekstrak diklometana dan ekstrak
etilasetat dari jamur dewa, (iv) perlu pengujian ergosterol terkait isomer ruang/
adanya ikatan rangkap dan isomer optis/ adanya atom C kiral.
SUMMARY
ANTICANCER ACTIVITY OF TERPENOID COMPOUNDS FROM JAMUR DEWA (Agaricus blazei Murill) ON MCF-7 CELLS WITH
APOPTOSIS INDUCTION WORK MECHANISM
Misgiati
Natural ingredients can be used in the development of anticancer treatments for treatment. This is because cancer treatment through chemotherapy, surgery, radiotherapy has not been able to deal with the disease effectively. Treatment failure is due to low selectivity in cancer treatment, for example in chemotherapy or radiotherapy treatment, normal cells also experience death. The right cancer treatment strategy is the use of natural ingredients with specific molecular targets.
Natural ingredients generally have the activity of inhibiting cancer growth through cell cycle arrest mechanisms, induction of apoptosis, or inhibiting the expression of proteins that play a role in Multi Drug Resistance.
The jamur dewa (Agaricus blazei Murill) is a lower plant which is a functional food and has the potential to be an anticancer, both tested in vitro and in vivo. Based on preliminary research on multistage extraction of several solvents, namely n- hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, butanol, methanol, and water.
The extraction process is ultrasonic for 30 minutes. The results of identification with TLC contained terpenoids in the extracts of n-hexane, dichloromethane, chloroform, and ethyl acetate. The activity test of n-hexane, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, and butanol extracts against MCF-7 cancer cells obtained IC50 results of 24.72 g/mL, respectively; 22.70 µg / mL; 21.56 g/mL; 23.49 g/mL; and 50.08 g/mL.
This activity is included in the strong cytotoxicity category. While the ethanol extract and water extract IC50 values were more than 500 µg / mL. Therefore it is necessary to carry out further research on each extract related to the active compound contained in the n-hexane extract.
The study was to obtain the active compound anticancer MCF-7 cells from the terpenoid compound group contained in the jamur dewa extract based on Bioactivity Guided Isolation. Determine the mechanism of action of the compounds contained in the extract of the jmaur dewa with the mechanism of action of apoptosis induction.
Bioactivity Guided Isolation was carried out to identify the anticancer active compound of MCF-7 cells from the n-hexane extract of jamur dewa. The production of active compounds begins with the extraction, fractionation, and isolation processes. Extraction with n-hexane solvent maceration method. The extract was then fractionated using the Vacuum Liquid Chromatography (VLC) method, using n- hexane and ethyl acetate as solvent gradient (100%-0%) and obtained 3 fractions (FH1-FH3). Extracts and all fractions were tested for anticancer activity of MCF-7 cells. The IC50 value of n-hexane extract was 15.09 µg / mL. The IC50 value of FH1 fraction was 28.62 g/ml, FH2 18.31 g/mL, and FH3 13.35 g/mL.
FH3 was separated by hot methanol solvent decantation method, resulting in SFH3.1 and SFH3.2 subfractions. The subfraction was tested for anticancer activity of MCF-7 cells with IC50 values of 19.21 g/mL (SFH3.1) and 19.72 g/mL (SFH3.2).
SFH3.2 separated by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method resulted in 5 isolates (SFH3.1.1-SFH3.1.5). Isolates were tested for the anticancer activity of MCF-7 cells with IC50 values of 43.12 µg / mL (SFH3.1.2), 211µg/mL (SFH3.1.3), and 128.21 µg/ mL (SFH3.1.5), for SFH3.1.1 and SFH3.1.4 the amount cannot be weighed.
The results of SFH3.1.2 in this study obtained a compound in the form of a white powder. The results of the UV spectrum on SFH3.1.2 showed the absorption at λmax
262, 271, 282, and 293 nm. Based on the 1H-NMR spectrum, (i) there is an overlapping aliphatic proton signal in the 0.50-2.50 bpj region which indicates the characteristic of terpenoids, (ii) there are six methyl signals at δ 0.93 (3H, s, H-18);
0.62 (3H, s, H-19); 1.03 (3H, d, J = 6.5 Hz, H-21); 0.92 (3H, d, J = 6.5Hz, H-28);
0.84 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-26); 0.82 (3H, d, J = 6.6 Hz, H-27) bpj, (iii) there is a distinctive signal in the chemical shift of 3.62 bpj (1H) which appears as a multiplet which is characteristic of the presence of OH bound to the C-position 3, (iv) there is a typical signal in the chemical shear of 5.38-5.57 ppm which appears as a multiplet indicating the presence of a double bond. The spectrum profile is in accordance with the literature search of ergosterol. Based on the 13C-NMR spectrum, (i) there are 28 carbon signals, (ii) one oxygenated carbon signal at 70.5 bpj which correlates with the multiplet typical signal at 3.62 bpj chemical shift (1H-NMR) which also indicates the presence of OH bonded to oxygenated carbon, (iii) there is a chemical shift at 116.4 - 141.5 ppm which indicates the presence of a double bond at positions C-6, C- 7, C-21 and C-22. From the 1H-NMR and 13C-NMR data, it is known that the SFH3.1.2 compound is an ergosterol structure with 28 carbon atoms, 44 proton atoms, and 1 O atom, which is in accordance with the mass spectrophotometer data showing the results of m/z 397, 23 [M+-H] which is consistent with the molecular formula C28H44O. The spectrum profile of both protons and carbon is in accordance with the literature search of ergosterol.
The isolate from the n-hexane extract of the jamur dewa which was identified as ergosterol has an IC50 of 108.55µM which was able to increase the induction of apoptosis in MCF-7 cancer cells with an increase in early apoptosis of 30.4%, late apoptosis by 16.4%, and a decrease in necrosis of 7.4%. This increase correlated with cell accumulation in the cell cycle G2 / M phase at 9.9%.
Based on this research It can be concluded that there are active compounds from the isolation of hexane extract, namely the terpenoid group, ergosterol [(3)-Ergosta- 5,7,22-trien-3-ol]. These compounds can inhibit the growth of MCF7 cancer cells by inducing apoptosis and inhibiting the cell cycle in the G2 / M phase.
Suggestions that can be given that (i) the ergosterol compound has the potential to be developed as a marker compound from the n-hexane extract of the jamur dewa. In this case, for the development of phytopharmaca from the 96%
ethanol extract of jamur dewa, (ii) It needs to be further explored for ergosterol with its mechanism of action related to its molecular mechanism of action, (iii) it is necessary to further explore the discovery of other anticancer active compounds from diclomethane extract and ethylacetate extract from the jamur dewa, (iv) it is necessary
to test for ergosterol isomers related to space isomers / presence of double bonds and optical isomers / the presence of chiral C atoms.
