TUGAS VI
UJI KLT DENGAN BERBAGAI ELUEN
KELAS / KELOMPOK : E / 5
1. SEPTIA ALFIONIKA 201210410311045 2. RATNA PUSPITA SARI 201310410311062 3. KHAIRUN NISA 201310410311100 4. M. RYZKY MUKHLISH 201310410311165 5. PRIMADONA P. OGAWA 201310410311255 6. RISA PUSPITA ISWANDARI 201310410311266
PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG
2016
Mahasiswa mampu menjelaskan tentang kaitan antara polaritas eluen dengan harga Rf. 2. PRINSIP TEORI
A. Kolesterol
Kolesterol ( C27H45OH ) adalah alkohol steroid yang ditemukan dalam lemak hewani / minyak, empedu, susu, kuning telur. Kolesterol sebagian besar disintesiskan oleh hati dan sebagian kecil diserap dari diet. Keberadaan kolesterol dalam pembuluh darah yang kadarnya tinggi akan membuat endapan / kristal lempengan yang akan mempersempit / menyumbat pembuluh darah ( Sutejo A.Y. 2006 ).
Kolesterol adalah lipida struktural (pembentuk struktur sel) yang berfungsi sebagai komponen yang dibutuhkan dalam kebanyakan sel tubuh. Kolesterol merupakan bahan yang menyerupai lilin, sekitar 80% dari kolesterol diproduksi oleh hati dan selebihnya diperoleh dari makanan yang kaya kandungan kolesterol seperti daging, telur dan produk berbahan dasar susu. Kolesterol sangat berguna dalam membantu pembentukan hormon, vitamin D, lapisan pelindung sel syaraf, membangun dinding sel, pelarut vitamin (vitamin A, D, E, K) dan mengembangkan jaringan otak pada anak-anak (Silalahi, 2006).
Biosintesis kolesterol dapat dibagi menjadi 5 tahap, yaitu: (a) Sintesis mevalonat dari asetil-CoA. (b) Unit isoprenoid dibentuk dari mevalonat melalui pelepasan CO2. (c) Enam unit isoprenoid mengadakan kondensasi untuk membentuk senyawa antara skualen. (d) Skualen mengalami siklisasi untuk menghasilkan senyawa steroid induk, yaitu lanosterol. (e) Kolesterol dibentuk dari lanosterol setelah melewati beberapa tahap lebih lanjut, termasuk pelepasan tiga gugus metil (Murray, 2003).
Kromatografi lapis tipis adalah salah satu contoh kromatografi planar. Fase diamnya (Stationary Phase) berbentuk lapisan tipis yang melekat pada gelas/kaca, plastik, aluminium. Sedangkan fase geraknya (Mobile Phase) berupa cairan atau campuran cairan, biasanya pelarut organik dan kadang-kadang juga air. Fase diam yang berupa lapisan tipis ini dapat dibuat dengan membentangkan /meratakan fase diam (adsorbent=penjerap=sorbent) diatas plat/lempeng kaca plastik ataupun aluminium.
Fase diam
Sifat fase diam yang satu dengan fase diam yang lain berbeda karena strukturnya, ukurannya, kemurniannya, zat tambahan sebagai pengikat dll. Fasa diam yang digunakan TLC tidak sama dengan yang digunakan untuk kromatografi kolom, terutama karena ukuran dan zat yang ditambahkan. Fase diam dijual dengan spesifikasi tertentu, iaitu ukuran (diameter) dalam mesh atau j^m dan untuk kegunaannya (mis: untuk TLC atau kromatografi kolom). Beberapa fase diam yang banyak dijual dipasaran:
Silika gel
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan pada TLC. Dalam perdagangan dijual dengan variasi ukuran (diameter) 10-40μm. Makin kecil diameter akan makin lambat kecepatan alir fase geraknya dengan demikian mempengaruhi kualitas pemisahan. Luas permukaan silica gel bervariasi dari 300-1000 m2/g. Bersifat higroskopis, pada kelembaban relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%.
Alumina
Banyak digunakan setelah silika gel, alumina termasuk kelompok fase diam yang beraktifitas tinggi. Alumina yang digunakan TLC bersifat sedikit basa (pH 9), ada juga yang bersifat netral (pH 7) dan alumina yang bersifat asam (pH 4). Juga digunakan CaSO4 sebagai pengikat yang dapat menurunkan bebasaan pada tingkat tertentu. Sepertihalnya Silica gel, alumina dikenal dengan atau tanpa pengikat dan bahan indicator. Pemberian namapun identik dengan silika gel dengan code G.H.P.F.
Selulosa
Menggunakan selulosa sebagai fase diam maka mekanisme pemisahannya sama seperti mekanisme pemisahan pada kromatografi kertas. Perbedaannya hanya serat selulosenya pada TLC/KLT lebih pendek dari pada serat selulosa kromatografi kertas. Panjang serat bervariasi 2-20 μ. Serat lebih pendek menyebabkan difusi rendah selama elusi dan menghasilkan bercak yang sempit (lebih kecil). Selulosa untuk TLC terdapat dim bentuk selulosa serat asli (contohnya MN 300) dan selulosa mikrokristal (contohnya Avicel). Fase diam selulosa biasanya digunakan senyawa yang bersifat polar.
Yang digunakan sebagai fase gerak biasanya adalah pelarut organik (tabel 1). Dapat digunakan satu macam pelarut organic saja ataupun campuran. Bilamana fase gerak merupakan campuran pelarut organik dengan air maka mekanisme pemisahan adalah partisi. Pemilihan pelarut organic ini sangat penting karena akan menentukan keberhasilan pemisahan. Pendekatan polaritas adalah yang paling sesuai untuk pemilihan pelarut. Senyawa polar akan lebih mudah terelusi oleh fase gerak yang bersifat polar dari pada fase gerak yang non polar. Sebaliknya, senyawa non polar lebih mudah terelusi oleh fase gerak non polar dari pada fase gerak yang polar.
Tabel 1 : Pelarut organik yang sering digunakan sebagai fase gerak (deret eluotropik)
(elisa.ugm.ac.id)
C. Konstanta dielektrik
Kepolaran pelarut tergantung dari nilai konstanta dielektriknya. Nilai konstanta dielektrik beberapa pelarut dapat dilihat pada tabel 2.
Pelarut heksana, eter, petroleum eter, dan kloroform digunakan untuk mengambil senyawa dengan kepolaran rendah sedangkan pelarut yang lebih polar misalnya alkohol dan etil asetat digunakan untuk mengambil senyawa yang lebih polar (Rusdi, 1990).
Kloroform
Terpenoid lakton diperoleh dengan ekstraksi berturut-turut dari n-heksana, kloroform dan metanol dengan konsentrasi aktivitas tertinggi dalam fraksi kloroform. Kadang-kadang tanin dan terpenoid akan ditemukan dalam fase polar, tetapi tanin dan terpenoid lebih sering diperoleh dengan pelarut semi polar (Tiwari, et al., 2011).
Etil asetat
Etil asetat adalah pelarut yang paling populer dan merupakan pelarut yang penting untuk konsentrasi dan pemurnian antibiotik. Etil asetat juga digunakan sebagai perantara dalam pembuatan berbagai obat. Etil asetat biasanya digunakan untuk mengekstraksi senyawa semi polar.
n-heksana
Nama lain dari n-heksana (hexane) adalah kaproil hidrida, metil n-butil metan dengan rumus molekul CH3(CH2)B4CH3. n-Heksana mempunyai karakteristik sangat tidak polar, volatil, mempunyai bau khas yang dapat menyebabkan pingsan. Berat molekul n-heksana adalah 86,2 gram/mol dengan titik leleh -94,3 sampai -95,3°C. Titik didih n-heksana pada tekanan 760 mmHg adalah 66 sampai 71°C (Daintith, 1994). n-Heksana adalah pelarut yang memiliki banyak kegunaan dalam industri kimia dan makanan, baik dalam bentuk murni atau sebagai komponen dari campuran n-heksana komersial. n-Heksana digunakan sebagai pelarut dalam ekstraksi secara sokletasi yang bertujuan untuk menghilangkan lemak. Ikatan pada n-heksana yang tunggal dan sifat yang kovalen menjadikan n-heksana tidak reaktif sehingga sering digunakan pelarut inert pada reaksi organik.
Metanol
Metanol adalah senyawa alkohol dengan 1 rantai karbon. Rumus kimia CH3OH, dengan berat molekul 32. Titik didih 640 -650 C (tergantung kemurnian), dan berat
jenis 0,7920-0,7930 (juga tergantung kemurnian). Secara fisik metanol merupakan cairan bening, berbau seperti alkohol, dapat bercampur dengan air, etanol, chloroform dalam perbandingan berapapun, hygroskopis, mudah menguap dan mudah terbakar dengan api yang berwarna biru (Spencer,1988).
Metanol merupakan pelarut yang bersifat universal sehingga dapat melarutkan analit yang bersifat polar dan nonpolar. Metanol dapat menarik alkaloid, steroid, saponin, dan flavonoid dari tanaman (Thompson, 1985). Penelitian Suryanto dan Wehantouw (2009) menunjukkan bahwa metanol mampu menarik lebih banyak jumlah metabolit sekunder yaitu senyawa fenolik, flavonoid, dan tanin dalam daun Artocarpus altilis F. dibandingkan dengan etanol.
D. Faktor yang mempengaruhi KLT
Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
Sifat dari penyerap dan derajat aktifitasnya.
Biasanya aktifitas dicapai dengan pemanasan dalam oven, hal ini akan menge-ringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap.
Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat.
Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak.
Kemurnian dari pelarut yang digunakan sebagai fase bergerak dalam kromatografi lapisan tipis sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan.
Derajat kejenuhan dan uap dalam bejana pengembangan yang digunakan.
Teknik percobaan.
Arah pelarut bergerak di atas plat. (Metoda aliran penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan).
Jumlah cuplikan yang digunakan.
Penetesan cuplikan dalam jumlah yang berlebihan memberikan hasil penyebaran noda-noda dengan kemungkinan terbentuknya ekor dan efek tak kesetimbangan
lainnya, hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf.
Suhu.
Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase.
Kesetimbangan.
Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis lebih penting dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana jenuh dengan uap pelarut
E. Pemisahan kromatografi kolom
Kromatografi kolom termasuk kromatografi cairan, adalah metoda pemisahan yang cukup baik untuk sampel lebih dari 1 gram. Pada kromatografi ini sampel sebagai lapisan terpisah diletakkan diatas fase diam. Biasanya sampel dihomogenkan dengan fase diam sehingga merupakan serbuk kering, diatas lapisan ini dapat diletakkan pasir untuk menjaga tidak terjadinya kerusakan waktu ditambahkan fase gerak diatas lapisan sampel. Fase diam dan sampel ini berada di dalam kolom yang biasanya dibuat dari gelas, logam ataupun plastik. Selama elusi fase gerak dialirkan dari atas, mengalir karena gaya gravitasi atau ditekan dan juga disedot dari arah bawa. Komponen sampel akan terpisah selama bergerak dibawa fase gerak didalam kolom (fase diam). Komponen yang paling tidak tertahan oleh fase diam akan keluar lebih dahulu dan diikuti oleh komponen lain. Semuanya ditampung sebagai fraksi, volume tiap fraksi tergantung besarnya sampel (kolom) (elisa.ugm.ac.id)
3. BAHAN DAN ALAT 1) Ekstrak kolesterol 2) n-Heksana
3) Kloroform 4) Etil asetat 5) Methanol
6) Anisaldehida asam sulfat 7) Hotplate
8) Plat KLT 9) Vial
10) Beaker glass 11) Chambe
Daftar pustaka
Sutedjo, A.Y. (2006). Mengenal Penyakit Melalui Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Jakarta: Amara Books.
Murray, R.K., dkk. (2003). Biokimia Harper. Edisi 25. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Elisa.ugm.ac.id
Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, Penerjemah : Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung.
Tiwari, P. Kumar, B. Kaur, G. Kaur H. 2011. Phytochemical screening and extraction: A Review. Internationale Pharmaceutica Sciencia. Vol.I, Issue,I.
Rusdi, 1990, Tetumbuhan Sebagai Sumber Bahan Obat. Pusat Penelitian Universitas Andalas, Padang.
Thompson, E. B. 1985. Drug Bioscreening. America: Graceway Publishing Company, Inc. Suryanto, E. dan F. Wehantouw. 2009. Aktivitas Penangkapan Radikal Bebas dari Ekstrak
