Kromatografi Kolom
I. TujuanI.1. Untuk melakukan dan menjelaskan teknik – teknik dasar kromatografi kolom.
I.2. Dapat menjelaskan prinsip dasar pada kromatografi.
I.3. Dapat melakukan isolasi campurn senyawa sampai pemurniannya secara kromatografi kolom.
II. Prinsip
II.1. Berdasarkan pada perbedaan migrasi dan distribusi senyawa ion – ion tersebut di dalam dua fase yang berbeda, (fase diam dan fase gerak).
II.2. Berdasarkan pada affinitas kepolaran analit dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam.
III. Reaksi -IV. Teori Dasar
Tanpa teknik kromatografi, sintesis senyawa murni (atau hampir murni) akan sangat sukar, dan dalam banyak kasus, hampir tidak mungkin. Pada umumnya sebelum suatu senyawa diidentifikasi dan dapat di ukur kadarnya perlu dipisahkan dari matriknya. Oleh karena itu, pemisahan merupakan langkah penting dalam analisis kualitatif. Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran. Terdapat banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik yang paling banyak di gunakan. Salah satunya yaitu kromatografi kolom.
Kromatografi kolom bertujuan untuk urifikasi dan isolasi komponen dari suatu campurannya. Metode pembuatan kolom terbagi menjadi 2 yaitu untuk metode kering, kolom pertama diisi dengan kering fase diam bubuk, diikuti dengan pembasahan fase mobile.
Sedangkan, metode basah sevuah bubur disiapkan dari eluent dengan fase diam bubuk dan kemudian dengan hati – hati dituangkan ke dalam kolom. Lapisan ini biasanya ditutupi dengan lapisan pasir kecil atau dengan kapas atau wol kaca untuk melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan baru ditambahkan eluent. Eluent perlahan – lahan melewati kolom untuk memajukan bahan organik.
Kromatografi kolom digolongkan ke dalam kromatografi cair – padat (KCP) kolom terbuk. Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal yang pertama kali dilakukan oleh seorang D.T.Navy untuk membedakan komposisi dari suatu minyak bumi.
Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair – padat. Pemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen – komponen campuran dengan affinitas berbeda – beda terhadap permukaan fase diam.substrat padat (adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak arut dalam fase cair. Fase geraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom.
Pemisahan pada kromatografi kolom tergantung pada kesteimbangan yang terbentuk pada bidang antar muka di antara butiran butiran adsorban dan fase gerak serta kelarutan relatif. Komponen pada fase gerak, antara molekul – molekul kmponen dan pelarut terjadi adanya suatu kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan suatu proses yang dinamis.
Pada saat terjadinya adsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase gerak yang ditambahkan secara kontinyu. Akibatnya, hanya komponen yang mempnyai affinitas lebih besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan. Komponen dengan affinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat untuk mengikuti aliran pelarut.
Pada suatu proses pemisahan kromatografi partisi sangat miri[ dngan kromatografi kolom adsorpsi. Perbedaan utamanya adalah terletak pada sifat dari penyerap yang digunakan. Pada kromatografi kolom partisi penyerapnya berupa materi padatan berpori seperti
kieselguhr, selulosa atau silika gel yang permukaannya dilapisi zat cair (biasanya air). Dalam hal ini zat padat hanya berperan sebagai penyangga (penyokong) dan zat cair sebagai fase diamnya.
Dalam kromografi partisi fase geraknya dapat berupa zat cair dn gas yang mengalir membawa komponen – komponen campuran sepanjang kolom. Jika fase geraknya dari zat cair, akan diperoleh kromatografi partisi cair – cair. Teknik ini banyak digunakan untuk pemisahan senyawa – senywa organik maupun anorganik.
Resin penukar ion adalah suatu bahan padat yang memiliki bagian (ion positif atau negatif) tertentu yang bisa dilepas dan ditukar dengan bahan kimia lain dari luar. Berdasarkan jenis ion atau muatan yang diperlukan resin dapat dibagi menjadi 2 yaitu resin penukar kation adalah ion positif yang dipertukarkan dan resin penukar anion adalah ion negatif yang dipertukarkan.
Besarnya nilai kapasitas penukar dari resin penukar ion tergantung pada jumlah gugus ion yang dapat ditukarkan yang terkandung dalam setiap gram bahan resin tersebut. Semakin besar jumlah gugus-gugus tersebut, maka semakin besar pula nilai kapasitas resinnya. Besarnya nilai kapasitas resin diketahui agar dapat memperkirakan berapa banyaknya resin yang diperlukan dalam analisa kimia dengan menggunakan metode kromatografi kolom.
Apabila resin telah mengikat jumlah ion yang sama dengan kapasitas maksimumnya maka resin tersebut dikatakan telah “exchausted”. Dalam keadaan demikian resin dapat dikembalikan ke keadaan semula dengan jalan menuangkan larutan asam yang agak pekat ke dalamnya sehingga terjadi reaksi kebalikan dari reaksi penukaran ion. Resin penukar anion dapat berupa ko-polimer stiren dan divinil benzen tetapi tidak mengandung gugusan-gugusan amin yang bersifat basa dengan resin penukar anion terjadi pengubahan yang jumlahnya ekuivalen
Parameter yang digunakan dalam mengevaluasi kinerja kolom stelah mengoptimalkan efisiensi pemisahan secraa kromatografi mutu kromatografi dapat dikendalikan dengan menrepakan uji kesesuaian sistem tertentu. Salah satu diataranya adalah perhitugan peat teoritis
untuk suatu kolom dan terdapat dua parameter utama lainnya untuk menilai kinerja.
Pola kecepatan arus elutor pada tiap irisan kolom yang dipilih harus sama, keseragaman ini dicapai dengan memilih adsorban yang ukuran butir – butirnya sama (diayak) dan dengan cara peryaratan yang baik. Semakin kecil ukuran butir aadsorban maka semakin cepat keseimbangan adosorpsi akan dicapai, dan makin besar pula kecepatan elusi yang dipergunakan.
Apabila kecpatan arus cairan semakin rendah, maka baik akibatnya bagi tercapainya keseimbangan adsorpsi dan akan semakin baik pula pada proses pemisahannya. Kecepatan arus yang erlalu rendah dapat memnimbulkan efek difusi axial dalam fase mobile yang harus dihindarkan sejauh mungkin.
Sifat adsorben dan pelarut harus memiliki luas permukaan besar internal. Kecepatan adsorpsi akan semakin bertambah dengan semakin kecilnya ukuran diameter adsorban. Pemilihan suatu pelarut tergantung dari sifat kelarutannya, akan tetapi lebih baik untuk memilih suatu pelarut yang tidak bergantung pada kekuatan elusi sehingga zat – zat elusi yang lebih kuat apat dicoba kekuatan dari zat elusi adalah daya penyerapan pada penyerap dalam kolom.
Mendeteksi suatu komponen yang dipisahkan melalui krmatografi kolom yang konvensional tidak dilengkapi detektor, namun dapat digunakan dengan mengalirkan eluent pada detektor untuk mendeteksi adanya suatu komponen.
Alat pada kromatografi kolom sederhana, terdiri dari kolom kaca yang terdapat krannya. Umumnya, panjang kolom minimum 10x diameter pipa kaca yang digunakan dan labu erlenmeyer sebagai penampung eluent. Fase diam yang digunakan berupa adsorben yang tidak larut di dalam fase gerak. Ukuran partikel fase diam harus seragam. Adanya suatu pengotor pada fase diam dapat menyebabkan adsorbsi tidak reversible.
Kromatografi cair yang dilakukan di dalam suatu kolom besar menggunakan metode kromatografi terbaik untuk pemisahan campuran dengan jumlah yang besar. Kromatografi kolom ini memiliki kelebihan
karena dapat digunaan untuk analisis dan aplikasi perapartive. Digunakan untuk menentukan jumlah komponen suatu campuran, digunakan untuk menentukan jumlah komponen sutu campuran, digunakan untuk memisahkan dan purifikasi substansi. Sedangka, kekurangan pada romatografi kolom dibutuhkan suatu kempuan teknik dan manual metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama.
Metode pada pemishan kromatografi ini memerluka bahan kimia yang cukup banyak yang digunakan sebagai fase diam dan fase gerakbergantung pada suatu ukuran dari kolom gelas tersebut. Hasil pemisahan kurang jelas artinya kadang – kadang sukar mendapatkan suatu pemisahan secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan komponen lainnya.
Keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi adalah : a. Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil
b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organic multi komponen
c. Proses pemisahan dapat dilakukan dalam waktu yang singkat d. Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak
memerlukan alat yang mahal dan rumit
V. Alat dan Bahan
V.1. Alat – alat : 1. Kolom gelas 2. Penyangga 3. Kapas 4. Beaker glass V.2. Bahan – bahan : 1. Ekstrak daun singkong 2. Bubur selulosa
3. wash benzen 4. Aseton
VI. Prosedur
VI.1. Pembuatan ekstrak pigmen plastid
Dikeringkan daun ingkong di dalam oven. Ditunbuk halus atau gerus dalam mortis, lalu diayak. Ditimbang 5g serbuk halus dari zat tersebut ditambahkan 15 ml aseton dan digerus dalam
mortir diatas es (mortir terlebih dahulu didinginkan di dalam lemari es). Saring dan dipindahkan ke dalam corong pemisah yang kering. Ditambah 20 ml petrolatum benzene dan 50 ml akuadest. Dikocok dan dibiarkan selama 20 – 30 menit. Lapisan bawah dibuang lapisan atas (ekstrak pigmen) diambil dan disimpan dalam botol coklat yang berisi K2SO4 anhidrat.
VI.2. Prosedur Kromatografi Kolom
Dibuat bubur selulosa dengan menggunakan pelarut wah benzen lalu dimasukkan langsung ke dalam kolom, akan tetapi, sebelum dimasukkan bubur selulosa dimasukkan terlebih dahulu kapas ke dalam kolom tersebut. Dan diusahakan agar bubur selulosa tersebut tidak pecah – pecah. Dielusi dengan menggunakan petroleum benzene sampai diperoleh masa yang kompak dengan tetesan yang konstan. Dimasukkan secukupnya ekstrak daunsingkong secara perlahan – lahan secukupnya dan tunggu hingga semua ekstrak meresap ke dalam kolom selulosa. Dielusi kembali dnegan menggunakan PB sampai warna kuning pertama turun (karoten) eluar dari kolom. Kemudian, elusi dilanjutkan kembali sampai warna kuning kedua (xantofil) keluar dari kolom. Setelah fraksi karoten dan xantofil keluar semua, eluent diganti dengan campuran PB : aseton (12:1). Kolom dielusi ampa semua fraksi hijau biru (klorofil A) keluar dari kolom. Elus diteruskan sampai warna kuning hijau (klorofil B) semua kaluar. Masing – masing fraksi ditampung dalam tabung reaksi tersendiri.
VII. Data Pengamatan
Warna ke-1 : kunimg (karoten) Warna ke-2 : hijau klorofil (klorofil)
VIII. Pembahasan
Pada praktikum kali ini tentang kromatografi kolom dengan menggunakan suatu sample yaitu dari daun singkong yang telah dihaluskan. Tujuan untuk kromatografi kolom ini untuk memisahkan suatu senyawa dari campurannya yang didasarkan pada suatu pemisahan daya adsorbsi dengan memakai kolom, dengan menggunakan suatu bantuan yaitu pelarut yang sesuai dengan menggunakan suatu fase dim berupa selulosa.
Prinsip pada kromatografi kolom ini berdasatkan pada migrasi dan distribusi suatu komponen – komponen yang berada dalam fase diam dan fase gerak, dan juga berdasarkan pada affinitas kepolaran analit dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam.
Selulosa yang digunakan pada fase diam ini adalah molekul yang terdiri dari karbon, hydrogen, dan oksigen sehingga dapat dikatakan bahwa sellulosa adalah polimer alam dengan rantai panjang yang dibuat dengan menghubungkan molekul yang lebih kecil.
Pada kromatografi kolom ini ada dua metode yaitu dengan menggunakan suatu cara kering dan juga dengan menggunakan suatu cara basah. Akan tetapi, pada praktikum kromatgrafi kolom ini digunakan suatu metode yaitu dengan metode kromatografi kolom secara basah yaitu dengan cara membuat bubur selolusa yang ditambahkan dengan pelarut petroleum benzen dan dimasukkan secara hati – hati ke dalam suatu kolom. Akan tetapi, sebelum dimasukkan bubur selulosa tersebut ke dalam suatu kolom harus disumbat terlebih dahulu dengan menggunakan suatu kapas tujuannya agar proses
pemisahannya berjalan dengan baik dan senyawa yang akan dipisahkan lolos dari kapas tersebut dan zat yang partikelnya besar akan tertahan pada kapas tersebut.
Pada kromatografi kolom ini, teknik pada saat pembuatan kolom dengan bubur selulosa dan juga pelarut yang ditambahkan, dan pada kolom tidak boleh sampai retak, dan harus pada keadaan padat dengan arti tidak boleh adanya suatu ruang udara ataupun gelembung yang terdapat dalam kolom tersebut karena hasilnya akan jelek mempengaruhi pada proses pemisahannya.
Apabila pada saat pembuatan kolom tersebut bubur selulosa belum memadat dan konstan maka dibantu dengan menambahkan sutu pelarut petroleum benzen hingga konstan tidak lagi terjadi perubahan dan kolom tersebut memadat tidak adanya suatu ruang atau keretakan antara kolom.
Apabila pada pembuatan kolom tersebut telah didapatkan kolom yang baik tidak adanya keretakan dan sudah memadat antara ruangnya maka dimasukkan suatu sample yang akan dipisahkan suatu senyawanya.
Pada saat pemisahan ini terjadi, komponen – komponen yang dipisahkan memiliki kecepatan yang berbeda – beda untuk turun dan melewati kolom tersebut hal ini dikarenakan dipengaruhi salah satunya oleh suatu pelarut yang ditambahkan, karena ketika saat pelarut tersebut sudah dalam keadaan tidak bisa menarik suatu komponen yang berada dalam sample tersebut maka perlu diganti lagi dengan suatu pelarut dengan perbandingan yang lain hingga suatu pelarut tersebut mampu untuk menarik komponen yang berada pada sample tersebut turun untuk melewati kolom tersebut.
Pelarut yang digunakan untuk memisahkan suatu komponen warna kuning pertama (karoten) digunakan pelarut petroleum benzene. Akan tetapi, pada saat memisahkan suatu senyawa yang berwarna hijau (klorofil) maka digunakan suatu pelarut yaitu petroleum benzene : aseton dengan perbandingan 12 : 1. Hal ini dikarenakan kepolaran dari
suatu senyawa atau komponen untuk turun berbeda – beda. Warna kuning yang pertama kali keluar atau turun sifatnya lebih polar.
IX. Kesimpulan
Metode kromatografi kolom yang digunakan pada praktikum kali ini dengan metode basah, prinsipnya berdasarkan pada migrasi dan distribusi pada komponen – komponen yang berada pada fase gerak dan fase diam. Dilihat dari tingkat kepolaran suatu senyawa pada fase gerak maupun sample dapat mempengaruhi cepat atau lambatnya suatu komponen tersebut turun melalui kolom menggunakan fase diam berupa selulosa.
X. Daftar Pustaka
Sudjadi. 1988. Metode Pemisahan. Konsius. Yogyakarta
Watson, G David. 2005. Analisis Farmasi edisi 2. Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.
Keenan, Charles W. dkk. 2002. Kimia Untuk Universitas Jilid 2. Erlangga: Jakarta.
Available online at : www.scribd.com (diakses pada tanggal 13 April 2015)
