Lampiran 1 Daftar Vaksin Avian Influenza Terdaftar di Indonesia

(1)

LAMPIRAN

(2)

Lampiran 1

Daftar Vaksin Avian Influenza Terdaftar di Indonesia

No Nama Vaksin Produsen/Importir M

1 Afluvet Pusvetma A/Chicken/Lego

2 Vaksiflu AI PT Vaksindo Satwa Nusantara A/Chicken/Lego

3 Medivac AI PT Medion Farma Jaya A/Chicken/Lego

4 Caprivac AI-K PT Caprifarmindo laboratories A/CK/WJ/PWT-

5 Avian Influenza Vaccine PT. Avindo Perdana Bahtera Mulia /Laboratorio Avi-Mex, SA de CV

Mexico A/Chicken/Mexi

6 Volvac AI PT. Boehringer Ingelheim Vetmedica Indonesia/Boehringer Ingelheim Vetmedica AS de CV Mexico

A/Chicken/Mexi 7 Optimune AIV PT. Agrinusa Unggul Jaya/Biomune de Mexico SA de CV Mexico A/Chicken/Mexi 8 Nobilis Influenza H5 PT. Intervet Indonesia/Intervet International bv, Netherlands A/Chicken/Mexi

9 Gallimune Flu H5N9 PT. Romindo Primavetcom /Merial, Italy A/Turkey/Wisco

10 Inactivated vaccine of Avian

Influenza (H5N2) PT. Lito Prima Mandiri/Qian Yuan Hao Biological Co Ltd, RRC A/Turkey/Englan 11 Inactivated AI VAC Oil Emulsion PT. Bio Farma/Qilu Animal Health Products Fact, RRC A/Turkey/Englan 12 Avian Influenza Vaccine,

Inactivated (H5N2 subtype) PT. Farmadika Sejahtera Indonesia/Harbin Weike Bio Technology

Development Company, China A/Turkey/Englan

13 Portek AI Kill Vacc PT. Biotek Indonesia/Yebio Bioengineering Co, Ltd. Of Qindao, China A/Turkey/Englan 14 DHN of avian Influenza

Inactivated Vaccine PT. Cakar Mas/Zaoqing Da Hua Nong Biology Medicine Co Ltd,

China A/Turkey/Englan

15 Medivac AI N2 PT Medion A/Turkey/Englan

16 Vaksiflu N2 PT Vaksindo Satwa Nusantara A/Turkey/Englan

17 Medivac ND-AI N2 PT Medion Lasota- A/Turkey

18 Newcastle Disease Avian Influenza

PT. Avindo Perdana Bahtera Mulia/Laboratorio Avi-Mex, SA de CV Mexico DF

Lasota- A/Chick (H5N2)

19 Nobilis Influenza H5 + ND PT. Intervet Indonesia/Intervet International bv, Netherlands A/Chicken/Mexi Lasota

20 Vaksipes N2 PT Vaksindo Satwa Nusantara A/Turkey/Englan

21 Afluvet H5N2 Pusvetma A/Turkey/Englan

22 Caprivac ND-AIK PT Caprifarmindo laboratories ITA- A/CK/WJ/P

23 Bird Close 5.1 PT IPB Shigeta Animal Pharmaceuticals A/IPB-SGT-KU/

24 Trovak AIV H5 PT. Romindo Primavetcom/Merial-Select, USA ODCEP25/CEP6

.AI:H5N8.vFP89 Sumber: Ditjennak 2009

(3)

Lampiran 2

Hasil Pengujian Titer Antibodi Anti Anti-idiotipe (Ab3)terhadap Antigen AI H5N1 Strain Legok (2003) dengan uji HI

Waktu Imunisasi

I II III IV

Pre 1

2

3

4

5

<2 < 2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 GMT 1 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 GMT 2 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 4 4 64 64 4 <2 64 32 16 16 32 GMT 3 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 12.13 64 64 64 64 16 27.86 64 64 128 128 128 GMT 4 mgg pi 1

2

3

4

5 GMT

<2

48.50 64 32 32 32 8 27.86

97.00 128 256 256 256 256 222.86

I = Kelompok Kontrol; II = Kelompok Ig G Kontrol; III = Kelompok Ab2; IV = Kelompok Vaksin AI H5N1; mgg pi = minggu post imunisasi; GMT= Geometric Mean Titer

Lampiran 3

(4)

Hasil Pengujian Titer Antibodi Anti Anti-idiotipe (Ab3)terhadap Antigen AI H5N1 IPB (2007) dengan Uji HI

Waktu imunisasi

I II III IV

Pre 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 GMT 1 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 GMT 2 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 4 4 8 8 4 <2 8 16 8 16 8 GMT 3 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 5.28 16 16 16 16 16 10.56 64 64 128 128 64 GMT 4 mgg pi 1

2

3

4

5 GMT

<2

16 64 64 64 64 32 55.72

84.49 128 128 128 128 128 128

Lampiran 4

(5)

Waktu imunisasi

I II III IV

Pre 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 GMT 1 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 GMT 2 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 4 4 8 8 8 <2 <2 4 16 8 16 GMT 3 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 6.06 64 32 32 64 32 6.96 64 64 64 64 128 GMT 4 mgg pi 1

2

3

4

5 GMT

<2

42.22 32 16 32 32 16 24.25

73.52 32 32 32 16 32 27.86

Lampiran 5

(6)

Waktu imunisasi

I II III IV

Pre 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 GMT 1 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 GMT 2 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 8 8 8 4 8 <2 8 8 16 16 16 GMT 3 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 6.96 32 16 16 32 16 12.12 16 32 16 32 32 GMT 4 mgg pi 1

2

3

4

5 GMT

<2

21.11 32 32 32 64 32 36.76

24.25 32 32 64 128

64 55.71

Lampiran 6

Hasil Pengujian Titer Antibodi Anti Anti-idiotipe (Ab3)terhadap Isolat AI H5N1 Strain Legok (2003) dengan Uji SN

Waktu I II III IV

(7)

imunisasi

Pre 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 1 mgg pi 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 2 mgg pi 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 4 4 4 8 8 5.28 32 16 8 8 16 13.93 3 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 8 16 16 32 16 32 32 64 64 32 GMT 4 mgg pi 1

2

3

4

5 GMT

<2

16 16 32 32 32 16 24.25

42.22 64 128 128 64 128 97.00

Lampiran 7

Hasil Pengujian Titer Antibodi Anti Anti-idiotipe (Ab3)terhadap Isolat AI H5N1 IPB (2005) dengan Uji SN

Waktu imunisasi

I II III IV

(8)

Pre 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 1 mgg pi 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 2 mgg pi 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 4 4 4 4 4 4 8 16 8 4 4 6.96 3 mgg pi 1

2

3

4

5

<2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 8 8 16 8 8 8 16 16 8 8 GMT 4 mgg pi 1

2

3

4

5 GMT

<2

9.18 16 16 32 16 16 18.38

10.56 16 32 32 16 16 21.11

Lampiran 8

Hasil Pengujian Titer Antibodi Anti Anti-idiotipe (Ab3)terhadap Isolat A/Goose/Bojonggenteng/IPB2-RS/2006 dengan Uji SN

Waktu imunisasi

I II III IV

(9)

Pre 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 1 mgg pi 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 2 mgg pi 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 3 mgg pi 1

2

3

4

5

GMT <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 <2 4 4 4 4 4 4 4 mgg pi 1

2

3

4

5 GMT

<2

4 4 4 4 4 4

8 8 8 8 8 8

Lampiran 9

Prosedur Polymerase Chain Reaction (PCR) Metode Konvensional 1. Isolasi RNA (Metoda TRIZOL^R LS Reagent – Invitrogen)

A. Bahan :

- Vaksin AI H5N1 inaktif Strain Legok

- TRIZOL^R LS Reagent (Invitrogen, Cat. No. 10296-010 100 ml) - Chloroform (Merck/BDH K171412141) CHCl3.

- Isoprophil Alcohol (Merck K28887934) = 2-Propanol (H3CHCOH)CH3

(10)

- Ethanol75 % (Merck K15920083) C2H5OH.

25 ml DEPC-Treated Water.

75 ml Ethanol.

- Air suling bebas Rnase.

- Diethylpyrocarbonate (DEPC) (Invitrogen, Cat. No. 10813-012) B. Alat-alat :

- Mikropipet/Single pipette 1000 μl (khusus RNA) - Mikropipet/Single pipette 200 μl (khusus RNA) - Mikropipet/Single pipette 10-20 μl (khusus RNA) - Tips 1000 μl (khusus RNA).

- Tips 100-200 μl (khusus RNA).

- Tips 10 μl (khusus RNA).

- Vortex mixer.

- Sentrifus dingin (Tomy Max 150)

- Microtube 1.8 ml (khusus RNA), harus baru dan sudah diautoclave.

- Penangas air 60⁰ C.

- Wadah berisi es

- Tempat pembuangan tips - Biosafety Cabinet Level 2.

- Sarung tangan.

- Masker C. Prosedur :

Sebanyak 250 μl vaksin dan 750 μl Trizol dimasukkan kedalam tabung eppendorf 1.8 ml, kemudian dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Larutan diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar (25–30ôC), kemudian ditambahkan 500 μl chloroform. Tabung tersebut dihomogenkan selama 15 detik dan diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit, kemudian disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8ôC selama 15 menit. Sebanyak 500 μl fase cair pada supernatan (putih bening) diambil dan dimasukkan kedalam tabung baru. Fase cair tersebut ditambahkan 500 μl isoprophil alcohol dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu kamar. Larutan selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 12.000 g pada suhu 2–8ôC selama 10 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang. Hasilnya adalah endapan RNA. Ke dalam endapan tersebut ditambahkan 1000 μl ethanol 75% dan disentrifus dengan kecepatan12.000 g selama 5 menit. Endapan RNA dikeringkan selama 7 menit di dalam laminar air flow, selanjutnya dilarutkan dengan 10 μl air suling bebas Rnase atau DEPC. Tahap akhir adalah larutan RNA diinkubasikan dalam penangas air 60ôC selama 10 menit. Larutan RNA di simpan pada suhu –20ôC sampai dilakukan RT-PCR.

2. Amplifikasi PCR MIX

Metoda Super Script^TM III One-Step RT-PCR System dengan Platinum ^R Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Cat. No. 12574-026)

Primer : 1. H5 (Invitrogen) = 55 bp

H5F: 5’AAA CAG AGA GGA AAT AAG TTG AAAA ATT’3 H5R: 5’AAA GAT AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC’3

(11)

2. N1 (Eurogentec) = 120 bp

N1F: 5'- TTG CTT GGT C(A/G)G CAA GTG C N1R: 5'- CCA GTC CAC CCA TTT GGA TCC A. Bahan-bahan :

- Reaction PCR Mix

- Super Script^TMIII /Platinum Taq

- RNA template (extraction product with Trizol) - Primer forward (H5 dan N1)

- Primer reserve (H5 dan N1) - ddH2O

- Mineral oil B. Alat-alat :

- PCR tube 0.5 ml (bebas RNA) - Single pipette 1-10 μl

- Single pipette 10-20 μl - Single pipette 10-100 μl - Tips 0.1-10 μl

- Tips 10-20 μl - Tips 10-100 μl

- Tempat pembuangan tips - Wadah berisi es

- Sarung tangan - Masker - Mesin PCR

C. Prosedur :

Reaksi PCR (PCR mix) dibuat sebanyak 50 µl dengan komposisi 25 μl 2x reaction PCR mix , 2 μl Platinum Taq, 5 μl RNA template, 1 μl Primer forward (10 µM), 1 μl Primer reverse (10 µM) dan 16 μl ddH2O (ultrapure H2O). Campuran tersebut dihomogenkan, kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR yang telah diprogram.

Program RT-PCR adalah cDNA synthesis 60ôC selama 30 menit, predenaturasi 95ôC selama 2 menit, 35 siklus terdiri dari denaturasi 95ôC selama 40 detik, penempelan 50ô– 55ôC selama 40 detik, ekstensi 72ôC selama 1 menit dan post ekstensi 72ôC selama 4 menit.

3. Elektrophoresis dan Visualisasi Produk Amplifikasi PCR A. Bahan-bahan:

1. Running Buffer → TBE Buffer (pH 8.0-8.1) (Invitrogen) 2. Agarose (Invitrogen.) 2 %:

- Agarose 3 gr

- TBE 150 ml

Larutan dimasak dalam microwave sampai larutan bening.

3. Ethidium Bromide

(12)

4. BlueJuice ^TMGel Loading Buffer (Invitrogen, Cat. No. 10816-015) 5. Marker (Invitrogen, Cat. No. 15628-019- 100 bp DNA ladder; Invitrogen,

Cat. No. 10416-014- 50 bp DNA ladder) B. Alat-alat :

- Erlenmeyer - Timbangan - Volumetric flask - pH meter

- Mini gel Electrophoresis System (Mupid 2) - Single pippette 1-10 μl

- Single pippette 10-20 μl - Tips 1-10 μl

- Tips 10-20 μl - Wadah gel - Parafilm

- Transluminator C. Prosedur :

Sebanyak 2 gram agarose dilarutkan dalam 100 ml TBE buffer, kemudian dipanaskan dalam microwave sampai larutan menjadi jernih. Ethium bromide ditambahkan ke dalam gel hangat selanjutnya gel dituangkan ke dalam dish mupid (± 50 ml kedalam dish yang besar) dan dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit. Sambil menunggu, sebanyak 250 ml TBE buffer dituangkan ke dalam mupid electrophoresis. Gel yang beku diletakkan di dalam mupid elektroforesis dengan aliran listrik negatif mengalir ke positif. Sebanyak 2 μl loading dye (BlueJuice Gel Loading) dan 8 μl produk amplifikasi PCR dicampur dan dimasukkan ke dalam lubang gel. Voltase yang digunakan sebesar 50 Volt selama 45 menit. Pita DNA yang teramplifikasi dilihat dibawah sinar ultraviolet

Lampiran 10

Prosedur Uji Agar Gel Presipitasi (Agar Gel Presipitation =AGP) A. Bahan-bahan:

- Agarose 0.4 gr

- Poly Ethylene Glycol (PEG) 6000 1.2 gr - Na azide 0.1% 0.04 gr - Larutkan dalam 25 ml PBS pH 7.4 dan 25 ml akuades pH 7.4.

B. Alat-alat:

- Gelas erlenmeyer - Gelas ukur - Gelas objek - Timbangan - Sendok - Mikrowave

(13)

- Puncher - Pipet 10 ml - Mikropipet + tips C. Prosedur:

Larutan agar dipanaskan dalam mikrowave sampai larut dan warna larutan menjadi bening. Larutan sebanyak 3.75 ml dituangkan pada gelas obyek dan ditunggu sampai mengeras, kemudian dibuat sumur-sumur dengan puncher.

Antigen sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumur tengah dan antibodi sebanyak 20 µl dimasukkan ke dalam sumur disekelilingnya.

Lampiran 11

Prosedur Uji Hambatan Hemaglutinasi (Hemaglutination Inhibitiont = HI) 1. Bahan –bahan :

A. Alsever’s

C6H12O6 (Merck Art. 8342) 20,5 gr, C6H5Na3O7 .2H2O (Merck Art. 6448) 8 gr C6H8O72H2O (Merck Art. 244) 0,55 gr

NaCl (Merck Art. 6404) 4,20 gr,

Ditambahkan dH2O 1000 ml. Stirer sampai larut, kemudian cek pH 6,1.

Autoclave pada suhu 115^oC dengan tekanan 12,5 psi selama 15 menit.

Alsever’s disimpan pada suhu 4^oC.

B. Sel darah merah ayam 1 % C. Phospate Buffer Saline (PBS) D. Antigen 4 HAU

E. Kapas alkohol 2. Alat-alat:

A. Syringe

(14)

B. Tabung sentrifus C. Sentrifus

D. Mikroplate 96 lubang dengan dasar V E. Mikropipet + tips

3. Prosedur Uji Hambatan Hemaglutinasi (HI)

A. Pembuatan Sel Darah Merah Ayam (SDM ayam) 10 %

Ayam SPF diambil darahnya dari vena brachialis (sayap) dengan perbandingan 1:1 (darah:alsever) dalam syringe, kemudian dicampur merata, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus dan disentrifus dengan kecepatan 3000 g selama 5 menit. Pembuatan SDM ayam pekat dengan cara mencuci SDM ayam dengan PBS sebanyak 3 kali. Sel darah merah sebanyak 5 ml dimasukkan ke dalam tabung 10 ml dan ditambahkan PBS, kemudian disentrifus dengan kecepatan 1000 g selama 10 menit, selanjutnya supernatan dibuang.

B. Pembuatan Sel Darah Merah Ayam (SDM ayam) 1% 10 ml

Pembuatan SDM ayam 1% dengan cara SDM ayam pekat sebanyak 1000 µl dicampur dengan PBS 10 ml. Kocok perlahan hingga larut.

C. Pembuatan Antigen 4 HAU

Prosedur uji HA adalah sebagai berikut : Antigen H5N1 diencerkan secara seri dengan kelipatan dua. Pada pengujian ini menggunakan lempeng mikrotiter 96 lubang dengan dasar V. Pada lubang pertama dengan menggunakan pipet single channel 100 dimasukkan 25 µl antigen.

Pada semua lubang dimasukkan larutan PBS, kemudian dilakukan pengenceran dengan menggunakan pipet multichanel 5 µl- 50 µl, pada lubang 11 dibuang 25 µl, lubang 12 sebagai kontrol sel darah merah.

Sebanyak 50 µl sel darah merah ayam 1% dengan menggunakan pipet multichanel 5 µl- 50 µl dimasukkan ke dalam semua lubang kemudian diinkubasikan pada suhu ruang selama 30 menit. Titer antigen 1 HAU adalah pengenceran terakhir yang dapat mengaglutinasi sel darah merah ayam. Tetapkan nilai 4 HAU untuk dipakai pada uji HI.

D. Prosedur Uji HI

Prosedur uji HI adalah sebagai berikut : Pada lubang pertama dengan menggunakan pipet single channel 100 µl dimasukkan 25 µl serum. Pada semua lubang dimasukkan pengencer Phospate Buffer Saline(PBS), kemudian dilakukan pengenceran secara seri kelipatan dua sampai lubang 11, lubang 12 sebagai kontrol sel darah merah. Antigen AI H5N1 yang telah diencerkan hingga konsentrasi 4 HA Unit sebanyak 25 µl dimasukkan pada semua lubang dengan menggunakan pipet multichannel 5 µl-50 µl. Campuran tersebut diinkubasikan pada suhu kamar selama 30 menit, kemudian dengan menggunakan pipet multichannel 5 µl-50 µl ditambahkan sel darah merah ayam 1% sebanyak 50 µl pada semua lubang dan selanjutnya diinkubasikan pada kamar selama 30 menit.

Terbentuknya aglutinasi menunjukkan bahwa serum tersebut tidak mengandung antibodi terhadap v, sirus AI, sedangkan apabila tidak terjadi aglutinasi tetapi yang terjadi adalah pengendapan sel darah merah ayam,

(15)

maka serum tersebut mengandung antibodi terhadap virus AI. Banyaknya antibodi dalam serum dinyatakan dalam titer yang dihitung sampai pengenceran keberapa terjadi pengendapan sel darah merah ayam.

Satuannya adalah HI unit .

E. Penghitungan Geometric Mean Titer (GMT) (Brugh 1978):

Log 2 GMT = (Log2t1)(S1)+(log2t2)(S2)+…. (log2tn)(Sn) N

Keterangan :

N = Jumlah contoh serum yang diamati

t = titer antibodi pada pengenceran tertinggi yang masih dapat menghambat aglutinasi sel darah merah

S = Jumlah contoh serum yang bertiter t n = Sampel ke-n

Lampiran 12

Prosedur Pemurnian Imunoglobulin G (IgG) 1. Bahan-bahan:

A. Montage Antibody purification kit & spin column with Prosep A media (Millipore).

B. Serum 2. Alat- alat:

A. Tabung sentrifus B. Sentrifus

C. Mikropipet + tips 3. Prosedur

Pemurnian Imunoglobulin G (IgG) dari serum marmut (Ab1) dan serum kelinci (Ab2) dilakukan dengan menggunakan Montage Antibody purification kit

& spin column with Prosep A media (Millipore). Prosep A dilepaskan dari tutup atas dan bawahnya kemudian dimasukkan kedalam spin kolom. Spin kolom dicuci dengan 10 ml binding buffer disentrifus dengan kecepatan 500 g selama 15 menit. Serum di filter dengan menggunakan steriflip GP filter 0,22 um. Sampel serum dilarutkan dengan binding buffer menggunakan perbandingan 1:1 v/v, lalu dimasukkan kedalam kolom spin dan disentrifus pada kecepatan 150 g selama 20 menit. Kolom spin dicuci kembali dengan 10 ml binding buffer dan disentrifus

(16)

dengan kecepatan 500 g selama 5 menit, pencucian dilakukan dua kali.

Imunoglobulin G di elusi dengan 10 ml buffer elusi langsung kedalam tube sentrifus berisi 1,3 ml buffer netral dengan kecepatan 500 g selama 5 menit.

Larutan yang ada dibawah yang ditampung dan merupakan IgG. Imunoglobulin G di desalting dengan menggunakan Amicon Ultra 15 dan disentrifus dengan kecepatan 4500 g selama 30 menit. Larutan yang ada diatas ditampung dan merupakan IgG.

Lampiran 13

Prosedur Sodium Deodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis ( SDS- PAGE)

1. Persiapan reagen SDS PAGE A. Acrylamide/Bis (30%T,2.67% C)

Acrilamide/Bis (30%T,2.67% C) 146 gr NN Methylene-bis-acrylamide 4 gr

Larutkan dalam akuabides sampai volume 500 ml, simpan pada suhu 4^o C dalam wadah gelap. Masa pakai 30 hari.

B. 1.5 M Tris- HCl pH 8.8

Tris Base 54.25 gr

Larutkan dalam akuabides sampai 150 ml, buat sampai pH 8.8 dengan Hcl kemudian tambahkan aquabides sampai volume 300 ml.

C. 0.5 M Tris-HCl pH 6.8

Tris base 6 gr

Larutkan dalam akuabides sampai 60 ml, buat sampai pH 6.8 dengan HCl kemudian tambahkan akuabides sampai volume 100 ml.

D. 10% (w/v) SDS

Larutkan 10 gr SDS dalam 60 ml akuabides dengan stirer, kemudian tambahkan akuabides sampai volume 100 ml.

E. 10% (w/v) Ammonium Persulfate

Larutkan 10 gr ammonium persulfat dalam 100 ml akuabides.

F. Sampel buffer

(17)

Akuabides 3.0 ml

0.5 M Tris-HCl pH 6.8 1.0 ml

Glyserol 1.6 ml

10% SDS 1.6 ml

ß-merkaptoetanol 0.4 ml

0.5% (w/v) bromophenol blue (dalam akuades) 0.4 ml

Encerkan sample dengan perbandingan 1:4. Panaskan pada 95^o C selama 4 menit.

Catatan: Sampel dapat diganti dengan sampel buffer komersil dengan perbandingan 1:1.

G. 5x Running buffer (1x = 25 mM Tris, 192mM glycine, 0.1% SDS pH 8.3) Tris Base 45 gr

Glycine 216 gr

SDS 15 gr

Larutkan dalam 3 liter akuabides, simpan pada suhu 4^o C. Sebelum digunakan biarkan pada suhu ruang dan buat menjadi larutan 1x.

2. Persiapan Gel

Gel Pemisah (375 M Tris, pH 8.8)

Gel Pengumpul (125 M Tris, pH

6.8) Monomer concentration

(30%T, 2.67%C)

12% 4%

Acrilamide/Bis (30% T, 2.67% C) 2.4 ml 260 µl

Akuabides 2 ml 1.22 ml

1.5 M Tris- HCl pH 8.8 1.5 ml -

0.5 M Tris-Hcl pH 6.8 - 0.5 ml

10% (w/v) SDS 60 µl 20 µl

10% (w/v) Ammonium Persulfate 30 µl 10 µl

TEMED 3 µl 2 µl

Catatan : Volume gel pemisah dan pengumpul dapat diperbesar dan diperkecil sesuai ukuran cetakan gel yang tersedia (umumnya setiap merk elektrophoresis berbeda volume) Dapat dibuat kelipatannya. Dalam penelitian ini akan digunakan elektrophoresis Sigma.

3. Persiapan Pewarnaan

Gel SDS diwarnai dengan metode pewarnaan Commasie Blue.

A. Larutan Commasie Blue

Larutkan 0.25 gr commasie brilliant blue dalam 125 ml methanol, 25 ml asam asetat glasial dan 100 ml akuabides.

B. Larutan Pemucat

(18)

Larutkan 100 ml methanol, 100 ml asam asetat glasial dan 800 ml akuabides.

4. Prosedur SDS PAGE

Penentuan berat molekul dianalisis dengan metode Sodium Deodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) (Gordon 1983).

Pengukuran berat molekul ini sesuai dengan teknik yang dilakukan oleh Laemmli (1970) dengan sistem discontinue menngunakan gel pemisah dengan konsentrasi 12 %, gel pengumpul 4 %, running buffer, larutan pewarna commasie brilliant blue dan larutan pemucat (distaining solution).

Pembuatan agar acrilamid dilakukan dengan bantuan dua lempeng kaca yang berukuran 18x15.5 cm (Pharmacia-Biotech^R) yang telah dibersihkan dengan alcohol 70%, pada kedua sisi tepi bagian dalam diberi spacer, kedua lempeng kaca dihimpitkan dan selanjutnya dijepit. Pada bagian atas lempeng kaca disisipkan sisir pembuat jalur dan kemudian diisi gel pemisah (12%

poliakrilamid) sampai 1 cm dibawah ujung sisir dengan bantuan mikropipet dan biarkan selama sekitar 30 menit kemudian diisi gel pengumpul (4% poliakrilamid) hingga mencapai permukaan lempeng kaca.

Sampel dilarutkan dengan larutan buffer sample perbandingan 1:1 dan campuran ini kemudian diinkubasi dalam penangas air 60^o C selama 5 menit sebelum dimasukkan ke dalam sumur gel electrophoresis. Sebanyak 10 µl sample dimasukkan ke dalam masing-masing sumur, kemudian perangkat electrophoresis dijalankan dengan arus 50 mA dengan voltase 100 V selama kurang lebih 3 jam.

Elektrophoresis berakhir apabila pewarna sample mencapai batas 0.5 cm dari bagian bawah gel. Setelah electrophoresis berakhir, gel diangkat dari lempeng kaca dan direndam dalam larutan pewarna commasie brilliant blue (Sigma^R Chemical Co.) selama 45 menit pada suhu ruang sambil diagitasi perlahan.

Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan merendam gel gel pada larutan pemucat methanol dan asam asetat sehingga gel berwarna bening atau pita-pita protein yang telah terbentuk terlihat jelas.

(19)

Lampiran 14

Prosedur Uji Serum Netralisasi (SN) 1. Bahan

A. Penicillin 100.000 unit

Satu flakon Penicillin (Gibco) 1 gr yang mengandung 1 juta unit .

Larutkan dengan akuabides (dH2O)steril 10 ml. Kocok hingga larut.

Simpan pada suhu 4^oC.

B. Streptomycin 100.000 unit

Satu flakon Streptomycin (Gibco) 1 gr yang mengandung 1 juta unit.

Larutkan dengan aquabides (dH2O) steril 10 ml. Kocok hingga larut.

Simpan pada suhu 4^oC.

C. Tripsin Versene EDTA (ATV)

a. Larutan A:

NaCl (Merck) 8 gr

KCl (BDH Prod.29594) 0,4 gr Glucose(Merk Art. 8432) 1,0 gr

Versene/EDTA (Sigma E-6758)0,50 gr

Tambahkan dH2O 500 ml, kemudian distirer sampai larut.

b. Larutan B:

Trypsin (Merck) 0,5 gr,

NaHCO3 (Merck Art. 6323) 0,58 gr

Tambahkan dH2O 500 ml, kemudian distirer sampai larut.

Larutan A dicampur dengan larutan B, distirer sampai larut, kemudian diautoclave pada suhu 121^oC dengan tekanan 14 psi selama 15 menit dan disaring dengan filter 0,22 µm. ATV disimpan pada suhu -20^o C.

D.MEM (Minimum Eagle Medium)(Gibco-Cat. No. 12100-061)

Pembuatan MEM dengan cara menimbang MEM sebanyak 13,37 gr,

(20)

kemudian ditambahkan dH2O sebanyak 1000 ml. Stirer sampai larut kemudian diautoclave pada suhu 121^oC dengan tekanan 14 psi selama 15 menit. MEM disimpan pada suhu 4^o C.

E. Media Biakan Jaringan 5 liter

Pembuatan media biakan jaringan 5 liter dengan cara membuat MEM (Gibco-Cat. No. 12100-061) 5 liter, kemudian ditambahkan Penicillin (100 ribu unit) 10 ml, Streptomycin (100 ribu unit) 10 ml, NaHCO3

(Merck) 5(x3,7 gr) dan Hepes (Gibco-Cat. 11344-033) 50 ml. Pembuatan dilakukan secara steril di dalam Biosafety Cabinet Level 2. Media biakan jaringan disimpan pada suhu 4^o C.

F. Media Pemelihara (Maintenance Medium = MM) 100 ml

Pembuatan MM 100 ml dengan cara mencampur media biakan jaringan sebanyak 98 ml dan fetal bovine serum (FBS) 2% (Gibco) sebanyak 2 ml.

Pembuatan dilakukan secara steril di dalam Biosafety Cabinet Level 2.

Media pemelihara disimpan pada suhu 4^o C.

G. Media Penumbuh (Growth Medium = GM)100 ml

Pembuatan GM 100 ml dengan cara mencampur media biakan jaringan sebanyak 95 ml dan fetal bovine serum (FBS) 5%(Gibco) sebanyak 5 ml.

Pembuatan dilakukan secara steril di dalam Biosafety Cabinet Level 2.

Media penumbuh disimpan pada suhu 4^o C.

H. NaHCO3 5,6%

Pembuatan NaHCO3 5,6% dengan cara menimbangNaHCO3 (Merck Art.

6323) 5,6 gr, kemudian ditambahkan dH2O 100 ml. Stirer sampai larut, kemudian diautoclave pada suhu 121^oC dengan tekanan 14 psi selama 15 menit. NaHCO3 disimpan pada suhu 4^o C.

I. PBS^- (Ca&Mg)

Pembuatan PBS ^–dengan cara menimbang NaCl (Merck Art. 6404 ) 8 gr, KCl (BDH Prod. 29594) 0,2 gr, Na2HPO4 (Merck Art. 6586) 1,15 gr, Na2HPO4.2H2O (Merck art. 6580) 1,42 gr dan KH2PO4 (Merck Art. 4873) 0,2 gr, kemudian ditambahkan 1000 ml dH2O. Stirer sampai larut, cek pH 7,2-7,4, kemudian diautoclave pada suhu 121^oC dengan tekanan 14 psi selama 15 menit. PBS^- disimpan pada suhu 4^o C.

J. Sel MDCK

2. Alat-alat:

A. Biosafety Cabinet Level II

B. Microplate 96 lubang untuk biakan jaringan C. Tabung pengencer

D. Botol media

E. Botol sel / tissue culture flask F. Pipet

G. Tabung sentrifus

H. Mikropipet (singlechannel pipette dan multichannel pipette + tips) I. Sentrifus

J. Inkubator 37^o C dan 5% CO2

(21)

3. Prosedur

A. Propagasi Biakan Jaringan Ginjal Anjing Madin Darby Canine Kidney (MDCK)

Biakan jaringan MDCK yang telah membentuk sel selapis (monolayer) pada tissue culture flask besar (75 cm²) dipropagasi dengan cara membuang media pada biakan jaringan MDCK. Umumnya biakan jaringan MDCK sudah membentuk sel selapis berumur 3 sampai 4 hari, kemudian di cuci dengan PBS^- steril sebanyak 2 kali sebelum ditambahkan 1,5 ml Tripsin Versen EDTA (ATV).

Biakan jaringan MDCK diinkubasikan pada suhu 37^oC selama 3-5 menit sambil sesekali digoyang dan dilanjutkan dengan pipeting yaitu dengan menghisap dan menyemburkan secara hati-hati suspensi tersebut menggunakan pipet 5 ml steril sehingga sel-selnya lepas. Sel-sel yang lepas akan terlihat jelas dibawah mikroskop, selanjutnya ditambahkan media penumbuh (GM) sebanyak 10 ml dan dimasukkan kedalam tabung sentrifus 50 ml, disentrifus dengan kecepatan 750 g selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet ditambahkan 40 ml media penumbuh (GM) dan dimasukkan kedalam 2 tissue culture flask besar (75 cm²) masing-masing 20 ml, kemudian diinkubasikan pada suhu 37^oC .

B.Propagasi Isolat Lokal AI

Isolat AI disimpan pada suhu -70^o C, kemudian ditumbuhkan kembali pada biakan jaringan MDCK.

Isolat lokal AI diperbanyak dalam biakan jaringan MDCK yang ditumbuhkan pada tissue culture flask kecil (25 cm²). Media biakan jaringan MDCK yang telah membentuk jaringan selapis, dibuang secara aseptis menggunakan pipet 5 ml steril, kemudian dengan menggunakan pipet single channel 1000 µl ditambahkan 300 µl isolat yang telah mengalami beku-cair sebanyak 3 kali dan diinkubasikan dalam inkubator pada suhu 37^o C selama 1 jam sebelum ditambahkan media pemelihara (MM). Sel tersebut diamati selama 5 sampai 7 hari untuk melihat ada tidaknya CPE (cytopathogenik effect), apabila CPE mencapai 80-90%, maka sel dan cairan dipanen untuk kemudian dilakukan uji kandungan virus.

C. Uji Kandungan Virus

Inokulum yang akan dititrasi dibeku-cairkan terlebih dahulu sebanyak 3 kali, kemudian disentrifus dengan kecepatan 750 g selama 10 menit. Supernatan dikoleksi untuk selanjutnya diuji kandungan virusnya.

Uji kandungan virus mengunakan microplate 96 lubang steril dengan dasar datar. Supernatan diencerkan sepuluh kali secara serial dengan pengencer media pemelihara (MM) dari 10^-1sampai 10^-8pada tabung 10 ml steril. Dengan menggunakan pipet single channel 100 µl sebanyak 50 µl per lubang dimasukkan dari masing-masing pengenceran sebanyak 4 lubang. Kontrol positif (virus 10^o) dan kontrol negatif (sel yang tidak diinokulasi) dibuat sebagai pembanding dan disertakan pada lempeng mikrotiter yang sama. Sebanyak 100 µl biakan jaringan

(22)

MDCK dalam media penumbuh dengan konsentrasi sel 2x10⁵per ml dimasukkan pada masing-masing lubang dengan meggunakan pipet multichannel 50µl-300 µl, selanjutnya diinkubasikan pada inkubator 37^oC yang mengandung 5% CO2 . Pengamatan akan terjadinya CPE dilakukan setiap hari selama 5 sampai 7 hari.

Hasil yang diperoleh dihitung dengan metoda Reed & Munch (1938).

Contoh Penghitungan Titrasi Kandungan Virus Metoda Reed & Munch (1938) Pengenceran

Virus

CPE (positif)

Kumulatif yg terinfeksi

(CPE +)

Kumulatif yg tdk terinfeksi

(CPE -)

Perbandingan Kumulatif

Presentasi Kumulatif 10^-1 5/5 12 0 12/12 100%

10-2 4/5 7 1 7/8 87,5%

10-3 2/5 3 4 3/7 43.0%

10-4 1/5 1 8 1/9 11.1%

10^-5 0/5 0 13 0/13 00%

Rumus TCID50 (Tissue Culture Infective Dose):

PD (Proportionate Distance) =

(Diatas 50% - 50%) = 87,5 - 50 = 37,5 = 0,86 (Diatas 50% - Dibawah 50%) 87,5 - 43 43,5

→ TCID50 = >50% + PD = 2 + 0,86 = 2,86 TCID50 = 10^-2,86

D. Prosedur kerja uji serum netralisasi dengan biakan jaringan

Pada lubang pertama dengan menggunakan pipet single channel 100 µl dimasukkan 25 µl serum. Pada semua lubang dimasukkan pengencer Phospate Buffer Saline (PBS), kemudian dilakukan pengenceran secara seri kelipatan dua sampai lubang 11, lubang 12 sebagai kontrol sel darah merah. Virus AI H5N1 yang telah diencerkan hingga konsentrasi 200 TCID50 sebanyak 25 µl dimasukkan pada semua lubang dengan menggunakan pipet multichannel 5 µl-50 µl. Campuran tersebut diinkubasikan pada inkubator dengan suhu 37^oC dengan 5% CO2 selama 30 menit, kemudian dengan menggunakan pipet multichannel 5 µl-50 µl ditambahkan sel MDCK sebanyak 100 µl pada semua lubang dan selanjutnya diinkubasikan pada inkubator dengan suhu 37^oC dengan 5% CO2 7 hari. Terbentuknya CPE menunjukkan bahwa serum tersebut tidak mengandung antibodi terhadap virus AI, sedangkan apabila tidak terjadi CPE, maka

(23)

serum tersebut mengandung antibodi terhadap virus AI. Banyaknya antibodi dalam serum dinyatakan dalam titer yang dihitung sampai pengenceran keberapa terjadinya CPE.

Lampiran 15

Prosedur Pembuatan Antigen AI 1. Bahan :

- Telur Ayam Berembrio (TAB) Specific Pathogen Free (SPF) umur 10 hari

- Isolat lokal AI - PBS + PSK

- Virus AI (tipe A) strain H5N1

- Sel darah merah (SDM) ayam SPF 3 % dan 1 % 2. Alat-alat :

- Safety Cabinet - Inkubator - Sentrifuse dingin - Tabung sentrifus - Tabung eppendorf

- Rak Telur

- Micropippete dan fintip - Stirer dan magnetic stirer.

- Disposible syringe - Microplate 96 well - Pipet Aid

3. Prosedur :

Telur ayam berembrio (TAB) umur 10 hari diinokulasikan dengan 0,1 ml isolat lokal AI. Telur diinkubasikan dalam inkubator 37^o C selama 3-5 hari.

Panen cairan allantois dilakukan secara steril dan dikumpulkan pada tabung sentrifus.

Selanjutnya dilakukan uji HA cepat dengan cara mencampur 1 bagian cairan alantois dan 1 bagian SDM 3 % , apabila terjadi aglutinasi maka cairan alantois tersebut disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 30 menit.

Koleksi supernatan dan dilakukan uji HA cepat kembali dan diukur titernya dengan uji HA.

(24)

Proses inaktifasi dilakukan dengan cara supernatan tersebut ditambahkkan dengan 0,2 % formalin kemudian distirer pada suhu 4^oC selama 1 malam.

Selanjutnya dilakukan titrasi antigen dengan uji HA. Supernatan didistribusikan sebanyak 1-2 ml pada tabung eppendorf dan simpan pada suhu -20 ^oC kemudian pada suhu -70 ^oC.