PENGARUH EKSTRAK KAYU SECANG (Caesalpinia sappan L.) TERHADAP ENZIM GLUTATION S-TRANSFERASE (GST) PADA SEL KANKER 4T1

EKSTRAK ETANOLIK KAYU SECANG

(

Caesalpinia sappan

L

.

)

MENUNJUKKAN EFEK SITOTOKSIK PADA SEL KANKER PAYUDARA 4T1

TETAPI TIDAK MELALUI JALUR

REACTIVE OXYGEN SPECIES

(ROS)

Secang

(

Caesalpinia sappan

L

.

)

Heartwood Ethanolic Extract Shows

Cytotoxic Effect on 4T1 Breast Cancer Cell But Not Through ROS

Pathways

Naufa Hanif

1

, Amila Dina

1

, Yuni Fajar Esti

1

, Muhammad Arif Taufik

1

,

Ratna Asmah Susidarti

1,2

1

Cancer Chemoprevention Research Center, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada,

Yogyakarta, Indonesia

2

Departemen Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta,

Indonesia

Email: ratna_asmah@ugm.ac.id

ABSTRACT

The inhibition of Glutathione-S-Transferase (GST) enzyme activity is one of the mechanisms to suppress the metabolic activity of cancer, especially breast cancer. GST is a superfamily of multifunctional enzymes groups involved in xenobiotic detoxification. One of potentia; cytotoxic plants in some cancer cells is secang (Caesalpinia sappan L.) heartwood. The aim of this research is to explore the potency of secang (Caesalpinia sappan L.) heartwood ethanolic extract (SHEE) in decreasing GST expression and activity on 4T1 breast cancer cells. Phytochemical profile of SHEE was seen through thin layer chromatography (TLC) test. In vitro cytotoxic test with MTT assay was performed to obtain IC50 value. The inhibition of cancer metabolism was showed through reactive

oxygen species (ROS) expression using flow cytometry. The GST activity was detected by spectrophotometry. In silico test by molecular docking was also conducted to see the interaction of brazilein and brazillin compounds in SHEE toward GST enzymes. The extract of SHEE was 2.6 grams (52%). The TLC test resulted a spot equivalent with the phitochemical profile of brazilein. The MTT assay revealed cytotoxic activity with the IC5022 μg/ml. The SHEE 5 μg/ml decreased ROS

expression and increased GST levels in 4T1 cells. The molecular docking showed that brazillin and brazilein have the ability to substitute native ligands to bind toward GST enzymes with docking scores -73,6627 (brazilin) and -73.9479 (brazilein). The results of this study showed that SHEE showed cytotoxic effect on 4T1 breast cancer cells thus could be developed more for chemoprevention agents, but not through the ROS pathways.

Keywords: Sappanwood (Caesalpinia sappan L.), breast cancer, Glutathione-S-Transferase (GST), Reactive Oxygen Species (ROS)

ABSTRAK

Salah satu mekanisme untuk menekan aktivitas metabolisme sel kanker terutama kanker payudara yaitu dengan penghambatan aktivitas enzim Glutathione-S-Transferase (GST). GST merupakan superfamili dari kelompok enzim multifungsi yang terlibat dalam detoksifikasi xenobiotik. Salah satu tanaman potensial yang bersifat sitotoksik pada beberapa sel kanker adalah kayu secang (Caesalpinia sappan L.). Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi potensi ekstrak etanolik kayu secang (EEKS) dalam menurunkan ekspresi dan aktivitas GST pada sel kanker payudara 4T1. Profil fitokimia EEKS dilihat melalui uji KLT. Pada uji in vitro dilakukan uji sitotoksik dengan metode MTT untuk mendapatkan nilai IC50. Kemudian untuk

yang setara antara sampel EEKS dan senyawa pembanding brazilein. Pada uji MTT diperoleh nilai IC50 sebesar 22 µg/ml. Sedangkan pada uji ROS menunjukkan bahwa EEKS 5 µg/ml

menurunkan ekspresi ROS pada sel kanker 4T1 dan pada pengujian aktivitas GST dengan kadar yang sama mampu meningkatkan kadar GST pada sel kanker 4T1. Sementara uji molecular docking menunjukkan bahwa brazilin dan brazilein memiliki kemampuan untuk mensubstitusi native ligand untuk berikatan dengan enzim GST dengan score docking 73,6627 (brazilin) dan -73.9479 (brazilein). Dari hasil penelitian ini, menunjukkan bahwa EEKS menunjukkan efek sitotoksik pada sel kanker payudara 4T1 sehingga berpotensi sebagai agen kemoprevensi, namun bukan melalui jalur ROS.

Kata kunci: Kayu Secang (Caesalpinia sappan L.), kanker payudara, Glutathione-S-Transferase (GST), Reactive Oxygen Species (ROS)

PENDAHULUAN

Kanker payudara adalah kanker yang paling banyak terjadi pada wanita di dunia, baik di negara maju maupun berkembang. Berdasarkan data laporan yang dirilis tahun 2017 dalam laman resmi WHO, pada tahun 2015, terdapat 8,8 juta kematian karena kanker di seluruh dunia, dan 571.000 diantaranya jenis kanker payudara. Di Indonesia, penderita kanker payudara pada wanita usia dibawah 65 tahun sebesar 15.709 orang, lebih banyak dibandingkan usia diatas 65 tahun sejumlah 8.127 orang (Globocan (IARC), 2017).

Salah satu karakteristik sel kanker adalah terus menerus membelah sehingga tumbuh dan berkembang tanpa batas. Aktivitas tersebut akan menyebabkan kadar reactive oxygen species (ROS) meningkat. ROS termasuk senyawa oksidan yang secara terus menerus diproduksi pada sel melalui proses metabolisme normal tubuh (Halliwell, 2001). Stress oksidatif terjadi ketika jumlah oksidan yang dikeluarkan tubuh lebih banyak dari jumlah antioksidan yang tersedia (Sies, 1997). Akibat adanya stress oksidatif, akan diproduksi suatu karbonil reaktif melalui proses oksidasi atau peroksidasi lipid serta glikoksidasi (Ellis, 2007). Efek toksik dari karbonil reaktif ini dapat dinetralkan oleh suatu enzim (Siems & Grune, 2003). Reaksinya bisa melalui oksidasi-reduksi (fase I) maupun konjugasi (fase II). Salah satu enzim yang berperan

dalam detoksifikasi karbonil reaktif ini yaitu enzim Glutathione s-transferase (GST).

GST adalah suatu enzim detoksifikasi yang mengkatalisis konjugasi GSH terhadap berbagai senyawa elektrofil endogen maupun eksogen (Townsend et al., 2003; Sharma et al., 2004). Konjugasi dengan GSH merupakan jalur detoksifikasi utama pada beberapa karbonil reaktif (Esterbauer et al., 1975). Enzim GST dalam sel mengakibatkan reaksi netralisasi dari senyawa radikal, yaitu ROS, sehingga kadar ROS di dalam sel menjadi berkurang dan sel kanker dapat terus bertahan hidup dan melanjutkan aktivitas pembelahan sel (Townsend, 2003; Sharma, 2004). Dengan demikian, penghambatan aktivitas enzim GST oleh suatu agen kemoprevensi merupakan salah satu mekanisme potensial untuk dikembangkan dalam menghentikan pertumbuhan dan metabolisme sel kanker.

Through ROS Pathways

et al., (2010) yang menyebutkan bahwa, ekstrak etanolik kayu secang memiliki aktivitas antikanker dengan menurunkan viabilitas sel kanker payudara MCF-7, T47D, dan sel kanker serviks HeLa namun tetap selektif terhadap sel normal Vero.

Berdasarkan uraian di atas, penelitan ini bertujuan untuk mengeksplorasi potensi kayu secang (Caesalpinia sappan L.) sebagai agen kemopreventif yang dapat digunakan sebagai terapi kanker. Hasil penelitian diharapkan dapat digunakan sebagai referensi terkait potensi kayu secang untuk menghambat kanker payudara.

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian. Bahan uji berupa kayu secang (Caesalpinia sappan L.) yang diperoleh dan diidentifikasi di Balai Besar Pengembangan dan Penelitian Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B2P2TOOT), Tawangmangu, Jawa Tengah, Indonesia. Sel uji yang digunakan yaitu sel kanker payudara 4T1 yang merupakan koleksi Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC) Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta.

Ekstraksi dan Identifikasi Ekstrak Etanolik Kayu Secang. Pembuatan ekstrak dilakukan dengan mengekstraksi 100 g kayu secang dengan metode maserasi menggunakan etanol pro analysis 99% selama 7x24 jam dan diremaserasi selama 2x24 jam dalam gelas Erlenmeyer tertutup rapat. Filtrat yang terkumpul diuapkan dalam lemari asam. Ekstrak kental yang didapat kemudian diidentifikasi kandungan brazilin dan brazilein menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dengan fase diam silika gel 60 F254 dan dielusi

menggunakan fase gerak toluena : etil asetat : metanol : asam format (4 : 6 : 1 : 0,5 v/v) dan selanjutnya dideteksi pada sinar tampak, UV 254 nm, dan UV 366 nm.

Uji Sitotoksik terhadap Sel 4T1. Sebanyak 1x104 _{sel didistribusikan ke dalam}

tiap sumuran 96-well plate dan diinkubasi

selama 24 jam. Larutan uji dan media ditambahkan sebanyak 100 μl per sumuran, diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi perlakuan berbagai konsentrasi ekstrak etanolik kayu secang. Inkubasi selama 24 jam, kemudian ditambahkan 100 μl media kultur yang mengandung MTT 5 mg/ml ke dalam masing-masing sumuran, inkubasi lagi selama 4 jam pada suhu 37°C. Setelah 4 jam, media yang mengandung MTT dibuang, kemudian ditambahkan larutan stopper dan plate diinkubasi selama semalam pada suhu ruang. Plate digoyang di atas shaker selama 10 menit kemudian absorbasi dibaca menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Data absorbansi perlakuan tunggal dikonversi ke dalam persen viabilitas dan digunakan untuk menghitung IC50.

Uji Reactive Oxygen Species (ROS). Salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengukur ekspresi ROS (Reactive Oxygen Species) intrasel adalah

menggunakan reagen 2’,7’–

dichlorofluorescin diacetate (DCFDA) (Anonim, 2016). Sebanyak 5 x 104 _sel

ditumbuhkan dalam media kultur pada 24 well plate, diinkubasi 24 jam pada suhu 37o_{C. Pada akhir masa inkubasi, media}

dibuang, lalu cuci PBS 1 kali. Tripsin 300 µL ditambahkan dan diratakan di lapisan sel selama 30 detik. Tripsin diambil dan dibuang lalu diinkubasi pada suhu 37o_C

selama 3-5 menit. Selanjutnya ditambahkan 500 µL 1X supplemented buffer untuk inaktivasi tripsin. Sel ditampung ke dalam microtube baru, sel diwarnai dengan 25 _μM DCFDA dengan menambahkan 6 µL 2 mM DCFDA lalu diinkubasi selama 30 menit di inkubator 37o_{C. Kemudian ditambahkan}

sampel uji (IC50 dan ½ IC50) dan dianalisis

flow cytometry pada Ex485 nm/Em535 nm.

Sejumlah 250 mL homogenant ditambahkan 300 mL loading buffer (10 mM HCl pH 7,9; 10mM NaCl; 1mM DTT). Selanjutnya untuk mengendapkan runtuhan sel dilakukan sentrifugasi (Wynanda, 2007). Sejumlah 40 µl lisat sel ditambahkan 920 µl buffer fosfat 0.1 M pH 6, 20 µl GSH, dan 20 µl CDNB sebagai substrat lalu diamati dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 340 nm dari menit ke-0 hingga menit ke-3 sejak penambahan CDNB.

Uji in Silico. Molecular docking dilakukan dengan software PLANTS. File protein target (3CSH) diolah menggunakan software YASARA untuk mengatur kondisi lingkungan sesuai dengan kondisi fisiologi manusia. Struktur brazilin dan brazilein dibuat menggunakan software Marvin Sketch. Kemudian dilakukan docking antara ligan dengan protein 3CSH serta dibandingkan docking score yang diperoleh antara kompleks protein target dan ligan natifnya dengan kompleks protein dengan brazilin dan brazilein.

Analisis Data. Untuk uji

sitotoksik/MTT assay, data yang diperoleh dari tiap sumuran berupa absorbansi (Abs) yang kemudian dikonversikan ke dalam persentase viabilitas sel dengan rumus:

Persen viabilitas digunakan untuk menghitung nilai IC50, menggunakan metode

log probit untuk mendapatkan linearitas antara log konsentrasi dengan sel hidup.

Uji ROS secara flow cytometry menghasilkan intensitas fluoresens sebanding dengan kadar ROS dalam sel. Sementara pada uji GST diperoleh data absorbansi yang kemudian dikonversikan menjadi konsentrasi ekspresi GST.

Dalam Molecular docking diperoleh docking score. Semakin rendah nilai docking score, maka ikatannya semakin kuat dan stabil. Jika semakin kuat ikatan antara brazilin dan brazilein dengan GST enzim

untuk menghambat aktivitas GST. HASIL DAN PEMBAHASAN

Pembuatan ekstrak dilakukan dengan metode maserasi menggunakan etanol pro analysis 99% selama 7x24 jam, dan diuapkan sehingga diperoleh ekstrak etabolik kayu secang (EEKS) sebanyak 2,6 gram. Rendemen yang diperoleh sebesar 52%. Hasil uji KLT ditunjukkan pada Gambar 1. Ekstrak etanolik kayu secang yang diperoleh dapat terelusi dengan baik dan memiliki profil bercak yang setara dengan senyawa pembanding brazilein dengan nilai hRf 83. Hal ini menunjukkan kemungkinan besar terdapat senyawa brazilein pada sampel EEKS yang digunakan dalam penelitian ini.

Uji MTT assay untuk mengevaluasi aktivitas sitotoksik EEKS menghasilkan nilai IC50 yang diperoleh dari persamaan regresi

linier. Nilai IC50 adalah konsentrasi senyawa

yang menghambat viabilitas sel sebesar 50% dari total populasi sel. dari hasil penelitian ini diperoleh persamaan regresi y = -3,3888x + 125,45 dengan r² = 0,9915 dan nilai IC50 EEKS sebesar 22 µg/ml. Nilai IC50 <

100 µg/ml menunjukkan aktivitas sitotoksik poten (Prayong et al., 2008). Nilai IC50

digunakan sebagai dasar penentuan konsentrasi untuk melakukan uji ROS dan uji aktivitas GST.

Uji MTT assay untuk mengevaluasi aktivitas sitotoksik EEKS menghasilkan nilai IC50 yang diperoleh dari persamaan regresi

linier. Nilai IC50 adalah konsentrasi senyawa

yang menghambat viabilitas sel sebesar 50% dari total populasi sel. dari hasil penelitian ini diperoleh persamaan regresi y = -3,3888x + 125,45 dengan r² = 0,9915 dan nilai IC50 EEKS sebesar 22 µg/ml. Nilai IC50 <

100 µg/ml menunjukkan aktivitas sitotoksik poten (Prayong et al., 2008). Nilai IC50

Through ROS Pathways

Gambar 1. Hasil deteksi senyawa brazilein dalam EEKS dengan metode KLT. (A) Struktur brazilein. Identifikasi kandungan brazilein dalam EEKS dalam 5% etanol P menggunakan kromatogafi lapis tipis (KLT) dengan fase diam silika gel 60 F254 dan dielusi menggunakan fase gerak toluena : etil asetat :

metanol : asam format (4 : 6 : 1 : 0,5 v/v) diamati dibawah (B) sinar tampak, (C) sinar UV 254 nm, dan (D) sinar UV 366 nm. Keterangan S adalah sampel EEKS dan P adalah pembanding brazilein.

Gambar 2. Aktivitas sitotoksik ekstrak etanolik kayu secang (EEKS) terhadap sel 4T1. Pengamatan morfologi sel pada jam ke-24 menggunakan inverted microscope perbesaran 100x. (A) Pengaruh perlakuan EEKS dengan rentang konsentrasi terhadap viabilitas sel. (B) Morfologi sel 4T1 dengan perlakuan kontrol sel (KS), dan EEKS 5, 15 dan 50 µg/mL.

Hasil uji ROS dapat dilihat pada Gambar 3, terjadi penurunan ekspresi jumlah ROS pada sel 4T1 yang diberi perlakuan EEKS di setiap konsentrasi (5, 15, maupun 50 µg/ml), jika dibandingkan dengan kontrol sel. Hal ini menunjukkan bahwa EEKS berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antioksidan.

Sebagaimana penelitian yang dilakukan oleh Wetwitayaklung et al., tahun 2005, dengan menggunakan metode TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) assay, kayu secang memiliki aktivitas antioksidan.

Semakin tua usia kayu secang semakin tinggi aktivitas antioksidan. Sementara itu, penelitian Badami et al., pada tahun 2003 dengan menggunakan metode 1,1-difenil-pycryl hydrazyl (DPPH) dan nitric oxide (NO) menunjukkan bahwa ekstrak kayu secang dengan pelarut etil asetat, metanol 50%, dan air menunjukkan adanya aktivitas antioksidan yang poten.

Uji Aktivitas GST dapat diketahui setelah penambahan substrat GSH dan CDNB yang membentuk kompleks GS-DNB. Produk kompleks inilah yang akan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 340 nm secara spektrofotometri pada menit ke-0 dan menit ke-3.

S P

(B) Sinar tampak (C) UV 254 (D) UV

(A) Brazilein

(A) (B)

5 µg/ml

15 µg/ml 50 µg/ml

KS

S P

Vi abi lit as sel (% )

4, EEKS pada konsentrasi 5 µg/mL memiliki konsentrasi GST paling tinggi jika dibandingkan dengan kontrol sel dan perlakuan EEKS konsentrasi 10 µg/mL dan 25 µg/mL. Hal ini menunjukkan bahwa EEKS pada konsentrasi 5 µg/mL mampu meningkatkan aktivitas enzim GST. Sehingga hasil uji ini mengkonfirmasi hasil uji sebelumnya (uji ROS), bahwa jalur antikanker EEKS bukan melalui penghambatan GST maupun peningkatan senyawa reaktif ROS. Untuk melihat potensi lain dari EEKS dari sudut pandang molekular, dilakukan uji molecular docking.

Molecular docking

dilakukan dengan

software

PLANTS. Senyawa uji yang

digunakan adalah brazilin dan brazilein.

Berdasarkan hasil

molecular docking

(Tabel 1), senyawa brazilin dan brazilein

memiliki

docking

score

73.6627 dan

-73.9479 yang berpotensi untuk dapat

berkompetisi dengan ligan natif yang

memiliki

docking

score

-80.6188. Nilai

RMSD (

Root Mean Square Distances

) < 2

menunjukkan

validitas

metode

percobaan.

Hasil

yang

didapatkan

menunjukkan RMSD senilai 1,2052.

Artinya, metode percobaan ini valid

Gambar 3. EEKS menurunkan ekspresi ROS pada sel 4T1 (N=1). Sebanyak 5,0 x 104 _{sel 4T1 dalam}

24-well plate diberi perlakuan EEKS 5, 10 dan 25 µg/ml sesuai dengan metode. Penambahan reagen DCFDA akan bereaksi dengan ROS membentuk senyawa fluoresen setelah diinkubasi selama 4 jam kemudian diamati dengan flow cytometry.

Gambar 4. Aktivitas GST pada sel 4T1 (N=1).Sejumlah 1,5 x 105 _{sel 4T1 ditanam pada tissue culture disk}

Through ROS Pathways

Tabel 1. Docking score

Gambar 5. Visualisasi docking dengan software MOE. Baris (A) adalah gambaran 3D sedangkan (B) merupakan gambaran 2D. (a) adalah hasil molecular docking enzim GST (3csh) dengan native ligand; (b) enzim GST (3csh) dengan brazilein; (c) enzim GST (3csh) dengan brazilin Kemudian divisualisasikan dengan software MOE untuk melihat asam amino-asam amino yang berperan dalam ikatan. Tanda segi empat menunjukkan adanya residu asam amino yang sama pada interaksi docking dengan ligan yang berbeda.

Selain itu, dengan visualisasi interaksi menggunakan software MOE dapat dilihat asam amino-asam amino yang berperan dalam ikatan tersebut. Hasil visualisasi pada Gambar 5 menunjukkan adanya ikatan asam amino yang sama antara asam amino yang diikat oleh native ligand dan asam amino yang diikat oleh brazilein, yaitu Arg 100, Arg 13, Asp 157, Gly 12, Cys 14, Ala 15, Ala 16. Sedangkan asam amino yang diikat oleh brazilin hanya berbeda satu asam amino yaitu tidak mengikat Cys 14.

KESIMPULAN

Dari hasil penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanolik kayu secang (EEKS) berpotensi menjadi agen kemopreventif dilihat dari hasil uji

sitotoksik terhadap sel kanker payudara 4T1. Namun, efek sitotoksik yang ditimbulkan tidak melalui jalur ROS.

UCAPAN TERIMA KASIH

Ucapan terima kasih disampaikan oleh penulis kepada Kementerian Riset dan Teknologi Dirjen Pendidikan Tinggi (Kemristekdikti) Republik Indonesia, yang telah mendanai penelitian ini pada tahun 2017 melalui

Program Kreativitas Mahasiswa (PKM) 5 Bidang.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 2016. ab113851 DCFDA Cellular ROS Detection Assay Kit.

Ligan Docking score RMSD Native -80.6188 1.2052 Brazilein -73.9479

E., Bhojraj, S., 2003. Antioxidant activity of Caesalpinia sappan heartwood. Biological and Pharmaceutical Bulletin 26, 1534– 1537.

Ellis, Elizabeth M. 2007. Reactive carbonyls and oxidative stress: Potential for

therapeutic intervention.

Pharmacology & Therapeutics 115, 13–24.

Esterbauer, H., Zollner, H., & Scholz, N. 1975. Reaction of glutathione with conjugated carbonyls. Z Naturforsch C 30(4), 466−473.

Globocan, 2012, Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2020. URL:

http://globocan.iarc.fr/old/burden.as

p?selection_pop=90360&Text-p=Indonesia&selection_cancer=3152

&Text-c=Breast&pYear=8&type=1&window =1&submit=%C2%A0Execute%C2%A 0 diakses tanggal 6 Desember 2017 Halliwell, B. 2001. Role of free radicals in the

neurodegenerative diseases: therapeutic implications for antioxidant treatment. Drugs Aging 18(9), 685−716.

Lim, D.K., U. Choi, dan D.H. Shin, 1997, Antioxidative activity of some solvent extract from Caesalpinia sappan Linn., Korean J. Food Sci. Technol, 28(1): 77−82

Rahmi K, Erlina Rivanti, Ika Nurzijah. 2010. Kajian Komprehensif Ekstrak Etanolik Kayu Secang (Caesalpinia Sappan L.) sebagai Agen Kemopreventif Tertarget. Naskah Tidak Terpublikasi. Sharma, R, Yang Y, Sharma A, Awasthi S,

Awasthi YC. 2004. Antioxidant Role of Glutathione S-Transferases: Protection Against Oxidant Toxicity

Apoptosis. Antioxidants and Redox Signaling, 6(2): 289-300.

Siems, W., & Grune, T. 2003. Intracellular metabolism of 4-hydroxynonenal. Mol Aspects Med 24(4-5), 167−175.

Sies, H. 1997. Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Exp Physiol 82(2), 291−295.

Townsend, D. M, Tew, K.D. 2003. The Role of Glutathione S-Transferase in Anti-cancer Drug Resistance. Oncogene, (2003)22: 7369-7375.

Wetwitayaklung P, Phaechamud T, Keokitichai S. The antioxidant activity of Caesalpinia sappan L. heartwood in various ages. Naresuan Uni J 2005; 13(2): 43-52.

WHO, 2017, ‘WHO Cancer’. URL: http://www.who.int/mediacentre/fac tsheets/fs297/en/ diakses tanggal 29 November 2017

Wynanda. 2007. Pengaturan Ekspresi Glutathione S-Transferase Akibat Pemberian Ekstrak Etanolik Biji Jintan Putih (Cuminum cyminum L.) : Studi In Vivo Pada Ratus norvegicus Galur Sprague-Dawley Terinduksi 7,12-Dimetilbenz[a]antrasena. Skripsi. Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Yen, C., Kyoko Nakagawa-Goto, Tsong-Long

Hwang, Pei-Chi Wu, Susan L, Morris-Natschke, Wan-Chun Lai, Kenneth F, Bastow, Fang-Rong Changb, Yang-Chung Wu, dan Kuo-Hsiung Lee, 2010, Antitumor Agents. 271. Total Synthesis and Evaluation of Brazilein and Analogs as Antiinflamatory and Cytotoxicity Agents, Bioorg Med Chem