1
I. Tujuan Percobaan
Menentukan aktivitas enzim α-amilase dengan metoda Fuwa.
II. Prinsip Percobaan
Hidrolisis ikatan α(1-4) pada amilosa oleh enzim α-amilase, degradasi amilosa mejadi maltosa dan glukosa. Sisa substrat amilosa bersama iodin membentuk kompleks berwarna yang dapat diamati secara spektofotometri.
III. Teori Dasar a. Pendahuluan
Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia. Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk. Jenis produk yang akan dihasilkan bergantung pada suatu kondisi atau zat, yang disebut promoter. Semua proses biologis sel memerlukan enzim agar dapat berlangsung dengan cukup cepat dalam suatu arah lintasan metabolisme yang ditentukan oleh hormon sebagai promoter.
Enzim bekerja dengan cara bereaksi dengan molekul substrat untuk menghasilkan senyawa turunan melalui suatu reaksi kimia organik yang membutuhkan energi aktivasi lebih rendah, sehingga percepatan reaksi kimia terjadi karena reaksi kimia dengan energi aktivasi lebih tinggi membutuhkan waktu lebih lama.
Sebagian besar enzim bekerja secara khas, yang artinya setiap jenis enzim hanya dapat bekerja pada satu macam senyawa atau reaksi kimia. Hal ini disebabkan perbedaan struktur kimia tiap enzim yang bersifat tetap. Sebagai contoh, enzim α-amilase hanya dapat digunakan pada proses perombakan amilum menjadi glukosa. Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, terutama adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH (tingkat keasaman) optimum yang berbeda-beda karena enzim adalah protein, yang dapat mengalami perubahan bentuk jika suhu dan keasaman berubah. Di luar suhu
2 atau pH yang sesuai, enzim tidak dapat bekerja secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Hal ini akan menyebabkan enzim kehilangan fungsinya sama sekali. Kerja enzim juga dipengaruhi oleh molekul lain. Inhibitor adalah molekul yang menurunkan aktivitas enzim, sedangkan aktivator adalah yang meningkatkan aktivitas enzim.
Konsentrasi enzim juga mempengaruhi kecepatan reaksi. Semakin besar konsentrasi enzim semakin cepat pula reaksi yang berlangsung. Dengan kata lain, konsentrasi enzim berbanding lurus dengan kecepatan reaksi. Sisi aktif suatu enzim dapat digunakan berulang kali oleh banyak substrat. Substrat yang berikatan dengan sisi aktif enzim akan membentuk produk. Pelepasan produk menyebabkan sisi aktif enzim bebas untuk berikatan dengan substrat lainnya. Oleh karenanya dibutuhkan sejumLah kecil enzim untuk mengkatalis sejumlah besar substrat.
b. Enzim α-Amilase
Alfa-amilase (1,4-alfa-D-glucan glucanohydrolase, pancreatic alfa-amylase,
α-amilase, PA) adalah salah satu enzim yang berperan dalam proses
degradasi amilum, sejenis makromolekul karbohidrat. Struktur molekuler dari enzim ini adalah α-1,4-glukanohidrolase. Bersama dengan enzim pendegradasi amilum lain, pululanase, α-amilase termasuk ke dalam golongan enzim kelas 13 glikosil hidrolase. Alfa-amilase ini memiliki beberapa sisi aktif yang dapat mengikat 4 hingga 10 molekul substrat sekaligus.
3
Mekanisme kerja
Alfa-amilase pada umumnya aktif bekerja pada kisaran suhu 25 0C hingga 950C. Penambahan ion kalsium dan klorida dapat meningkatkan aktivitas kerja dan menjaga kestabilan enzim ini. Alfa-amilase akan memotong ikatan glikosidik α-1,4 pada molekul amilum (karbohidrat) sehingga terbentuk molekul-molekul karbohidrat yang lebih pendek. Hasil dari pemotongan enzim ini antara lain maltosa, maltotriosa, dan glukosa.
Struktur amilum
Amilosa dan amilopektin dalam amilum
4 Pada metabolisme karbohidrat, α-amilase bekerja bersama-sama dengan α(1-6) glukosidase untuk memecah amilum atau glikogen menjadi glukosa dan beberapa maltosa.
5 Pemecahan glikogen menjadi glukosa oleh enzim α-amilase yang bekerja sama dengan α(1-6)
glukosidase
Alfa-amilase memiliki beberapa sisi aktif yang dapat mengikat 4 hingga 10 molekul substrat sekaligus. Alfa-amilase dapat mendegradasi beras, tapioka, dan maizena dengan pola yang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa alfa-amilase memiliki domain pengikat amilum dan berpotensi tinggi dalam industri pemrosesan amilum.
6 Enzim alfa-amilase merupakan enzim yang banyak digunakan pada berbagai macam makanan, minuman, deterjen, industri pemrosesan dan industri tekstil. Ada beberapa petunjuk tentang enzim Alfa-amilase ini, diantaranya:
• Dapat ditemukan dalam bentuk tepung malt, gandum yang berkecambah • Dapat berasal dari bakteri Bacillus subtilis
• Disintesa kapang Rhizopus oligosporus dan Rhizopus oryzae • Bisa berasal dari cacing tanah
• Pakai cendawan Aspergillus sp
• Dapat berasal dari pankreas sapi dan babi
• Banyak terdapat di saliva dan pencernaan manusia
Alfa-amilase pada umumnya bekerja pada kisaran suhu 25 hingga 95°C. Penambahan ion klasium dan klorida dapat meningkatkan aktivitas kerja dan mendapat kestabilan enzim alfa-amilase ini. Alfa-amilase akan memotong ikatan glikosidik α-1,4 pada molekul amilum (karbohidrat) sehingga terbentuk molekul-molekul karbohidrat yang lebih pendek. Hasil dari pemotongan enzim ini antara lain maltosa, maltotriosa, dan glukosa.
c. Penentuan Aktifitas Enzim
Penelitian terhadap enzim sejak beberapa tahun yang lalu telah menghasilkan pengertian yang lebih jelas tentang peranan enzim dalam biologi sel, yaitu kontrol sintesa enzim dan protein lainnya secara genetika, sifat pengatur sendiri sistem enzim dan peranan enzim dalam berbagai proses pertumbuhan dan pembelahan sel.
JumLah enzim dalam ekstrak suatu jaringan ditentukan secara kuantitatif berdasarkan efek katalisisnya. Untuk penentuan ini perlu diketahui beberapa faktor, yaitu:
• Persamaan reaksi yang dikatalisis oleh enzim tersebut
• Dibutuhkan atau tidaknya kofaktor tertentu, seperti ion-ion logam atau koenzim
7 • pH optimum
• Temperatur optimum
Penetuan aktifitas enzim biasanya dilakukan pada pH optimum dan dengan konsentrasi substrat dan kofaktor yang berlebih, sehingga laju reaksi yang terjadi merupakan reaksi tingkat ke-nol terhadap substrat. Pengamatan reaksi biasanya ditentukan dengan penentuan terbentuknya hasil reaksi dengan berbagai cara kimia atau spektrofotometri. Cara terakhir ini lebih baik karena dapat dilakukan secara kontinyu dan dapat dicatat dalam suatu bagan.
Menurut perjanjian internasional, suatu unit aktifitas enzim adalah jumLah enzim yang menyebabkan perubahan 1µmol (10-6 mol ) substrat per menit pada suhu 25ºC dalam keadaaan optimum sistem tersebut. Aktivitas spesifik adalah jumLah unit aktivitas enzim per miligram protein.
IV. Alat dan Bahan
Bahan (pereaksi dan sampel)
- Enzim amilase (diambil dari saliva) - Pati 0,25% - Asam asetat - Iodin 0,2 % (0,2 g I2 dalam KI 2%) Peralatan - Tabung reaksi - Vortex - Spektofotometer V. Prosedur Percobaan
1. Sebanyak 250µl enzim amilase dipipet kedalam tabung reaksi yang sudah berisi 250µl pati 0,25%
8 3. Ditambahkan 250 µl Iodin
4. Ditambahkan 4 mL H2O (volume total = 5 mL)
5. Hal yang sama dilakukan untuk tabung kontrol yang tanpa menggunakan enzim 6. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 600 nm.
VI. Hasil dan Pengamatan
Perhitungan
Aktifitas enzim α-amilase = ( ) Keterangan:
K = kontrol, absorbansi sampel tanpa enzim S = sampel, serapan sampel
Tabung 1
Aktifitas enzim α-amilase = ( ) Aktifitas enzim α-amilase = 7,767 U/mL
Tabung 2
Aktifitas enzim α-amilase = ( ) Aktifitas enzim α-amilase = 18,2 U/mL
Tabung 3
Aktifitas enzim α-amilase = ( ) Aktifitas enzim α-amilase = 36,51 U/mL
9
VII. Pembahasan
Penentuan aktifitas enzim dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan dengan menghitung jumlah produk (metoda DNS, Somogyi-Nelson) dan dengan mengukur sisa substrat. Pada percobaan kali ini dilakukan penentuan aktifitas enzim α-amilase dengan metoda Fuwa, yaitu mengukur sisa substrat amilum setelah direaksikan dengan enzim α-amilase yang diperoleh dari saliva.
Pertama-tama, sebanyak 250µl enzim amilase dipipet kedalam tabung reaksi yang sudah berisi 250µl pati 0,25% dan diinkubasi dalam penangas air suhu 50°C selama 10 menit. Enzim bekerja pada pH netral (sebagian penyusunnya adalah air) dan pada suhu sekitar 20°C (suhu tubuh). Pemanasan yang dilakukan bertujuan agar enzim pada percobaan berada dalam suhu optimum.
Pada tabung kemudian ditambahkan asam asetat 1 N dan divortex agar semua bagian enzim dan amilum terkena asam. Penambahan asam bertujuan untuk menghentikan aktifitas enzim. Penambahan asam dapat menghentikan hidrolisis yang dilakukan oleh enzim α-amilase karena perubahan pH, sehingga aktifitas terhenti. pH yang sangat asam juga dapat merusak heliks yang terdapat dalam struktur amilosa.
Struktur heliks amilosa
Enzim α-amilase adalah enzim yang menghidrolisis ikatan α(1-4) pada amilosa, sehingga amilosa terdegradasi menjadi maltosa dan beberapa glukosa. Penambahan iodin bertujuan untuk mendeteksi sisa amilum yang masih terdapat dalam tabung setelah hidrolisis. Amilum terdiri dari amilosa dan amilopektin. Iodin bersama amilosa
10 membentuk warna biru yang dapat diamati secara spektrofotometri. Warna biru yang semakin pekat menunjukkan sisa amilum yang semakin banyak. Warna biru tersebut adalah karena pembentukan komplek iodine dan amilum, dimana iodin terjebak dalam struktur heliks amilosa.
Kompleks amilum-iodin
Setelah serangkaian langkah tersebut, pada tabung ditambahkan H2O sebanyak 4
mL sehingga volume total pada tabung adalah sebanyak 5 mL. Absorbansi warna yang timbul karena kompleks amilum-iodin kemudian diukur pada panjang gelombang 600 nm dengan spektrofotometer.
Pada percobaan, dibuat satu tabung sebagai kontrol, dimana enzim α-amilase diganti dengan aquadest. Pada tabung kontrol tidak terdapat enzim yang dapat menghidrolisis amilum, sehingga sisa amilum yang dapat membentuk kompleks dengan iodin pada tabung kontrol lebih banyak dan absorbansi tabung kontrol nilainya lebih besar daripada nilai absorbansi tabung sampel. Dengan persamaan
aktifitas enzim α-amilase = ( ) ,
dimana K merupakan absorbansi pada tabung kontrol dan S merupakan absorbansi pada tabung sampel, pada percobaan yang dilakukan oleh kelompok G2/3, didapat hasil perhitungan aktifitas enzim sebesar 36,51 unit/mL.
VIII. Kesimpulan
Aktifitas enzim α-amilase yang ditentukan oleh kelompok G2/3 dengan metoda Fuwa adalah sebesar 36,51 unit/mL.
12
DAFTAR PUSTAKA
Fuwa H., A New Method for Microdetermination of Amylase Activity by Use Amylose as the Substrate, The Journal of Biochemistry, vol. 41, No. 5, 1954.
Enzim Alfa-amilase. http://id.wikipedia.org/wiki/Alfa-amilase
http://june-s.blogspot.com/2008/05/deteksi-dan-uji-kualitas-amilase.html
Nelson, David L. dan Cox, Michael M. 2009. Lehninger. Principles of Biochemistry. Poedjadi, Anna.1994. Dasar-dasar Biokimia. UI Press:Jakarta.
