78
KAJIAN EFEK SITOTOKSIK HASIL FRAKSINASI EKSTRAK ETANOL KULIT BUAH ASAM KANDIS (Garcinia cowa Roxb.) TERHADAP SEL KANKER
PAYUDARA T47D DENGAN METODA MICROTETRAZOLIUM (MTT) Fatma Sri Wahyuni, Edgar Firnando, Elidahanum Husni
Fakultas Farmasi Universitas Andalas ABSTRAK
Telah dilakukan kajian efek sitotoksik hasil fraksinasi ekstrak etanol kulit buah asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) terhadap sel kanker payudara T47D secara in vitro, dengan metode MTT. Prinsip kerja metoda MTT adalah kolorimetri dengan mengukur aktivitas dehidrogenase mitokondria pada sel-sel hidup yang memiliki kemampuan untuk mengkonversi MTT menjadi formazan. Pengujian fraksinasi heksan, etil asetat dan air dilakukan dari konsentrasi 0,1 µg/ml, 1 µg/ml,10 µg/ml, dan 100 µg/ml. Dari hasil pengujian, diperoleh nilai IC50 fraksi heksan, etil asetat dan air kulit buah asam kandis terhadap sel kanker payudara T47D berturut-turut sebesar 3,53 µg/ml, 0,59 µg/ml, dan 3457,39 µg/ml . Hasil analisa statistik menunjukkan bahwa fraksi heksan dan fraksi etil asetat kulit buah asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) mampu menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D secara signifikan pada konsentrasi 10 µg/ml dan 100 µg/ml.
Kata kunci: Garcinia cowa Roxb., sel kanker payudara T47D, Metode Microtetrazolium (MTT)
PENDAHULUAN Kanker merupakan penyebab utama
kematian diseluruh dunia. Dari 58 juta kematian di seluruh dunia dalam tahun 2005, tercatat 7.6 juta (13%) diantaranya disebabkan oleh kanker (Moeljopawiro, 2007). Jenis penyakit kanker yang paling umum dijumpai adalah kanker payudara. Kanker payudara merupakan penyebab utama kematian pada wanita di berbagai belahan dunia (Departemen Kesehatan, 2008).
Pengobatan kanker secara medis memerlukan biaya yang sangat tinggi. Selain melalui bedah dan radiasi, pengobatan
kanker mengandalkan kemoterapi.
Kemoterapi menggunakan obat-obat anti kanker masih banyak terkendala masalah, diantaranya masih belum efektifnya obat dalam membunuh sel kanker dan efek samping yang harus diderita oleh pasien. Selain pengobatan konvensional tersebut,
masyarakat juga banyak mencoba
kemungkinan penyembuhan dengan
pengobatan alternatif menggunakan ramuan
bahan alami (natural medicine) (Djajanegara & Wahyudi, 2010).
Tumbuhan dari genus Guttiferae (Garcinia) akhir-akhir ini banyak diteliti kandungan dan aktivitasnya. Genus ini dilaporkan mengandung santon, benzofenon, triterpen, biflavonoid, benzoquinon, senyawa α-mangostin, cowanin, cowanol, cowasanton, rubrasanton, β-mangostin, tetrapreniltolouquinon, dan santon terprenilasi (Rukachaisirikul et al., 2008; Wahyuni et al., 2004; Kenji et al., 2003; Peres et al., 2000; Sadaquat et al., 2000). Senyawa santon terutama dikenal dengan potensinya sebagai antikanker (Jabit et al., 2009). Salah satu tanaman di genus ini yang mulai banyak diteliti yaitu Garcinia cowa Roxb. yang dikenal dengan nama daerah asam kandis atau kandis.
Antikanker dapat dilakukan dengan uji MTT assay yang merupakan salah satu metode yang digunakan dalam uji sitotoksik. Metode ini merupakan metode kolorimetrik, dimana terjadinya reduksi garam kuning
79 tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromid) oleh sistem reduktase. Suksinat tetrazolium yang termasuk dalam rantai respirasi dalam mitokondria sel-sel yang hidup membentuk kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut air. Penambahan reagen DMSO akan melarutkan kristal berwarna ini yang kemudian diukur absorbansinya menggunakan microplate reader. Intensitas warna ungu yang terbentuk proporsional dengan jumlah sel hidup. Sehingga jika intensitas warna ungu semakin besar, maka berarti jumlah sel hidup semakin banyak (Mosman, 1983).
Dari penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa ekstrak etanol kulit buah asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan IC50 19,33 µg/ml (Sutma, 2012). Berdasarkan data hasil
penelitian yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan bahwa ekstrak etanol kulit buah asam kandis berpotensi untuk dikembangkan sebagai sumber baru dalam mengembangkan obat kanker. Namun, masih diperlukan penelitian lebih lanjut untuk melakukan fraksinasi terhadap ekstrak etanol kulit buah asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) untuk mengetahui aktivitas sitotoksik masing-masing fraksi.
Dalam penelitian ini, dilakukan pengujian sitotoksik terhadap fraksinasi ekstrak etanol kulit buah asam kandis terhadap sel kanker payudara T47D menggunakan metoda MTT Assay. Parameter yang diukur yaitu nilai IC50. Tujuan dari
penelitian ini adalah untuk mengetahui efek sitotoksik fraksinasi ekstrak etanol kulit buah asam kandis terhadap sel kanker payudara T47D.
METODE PENELITIAN Alat yang digunakan untuk fraksinasi
berupa erlenmeyer berbagai ukuran, gelas
ukur, corong, spatel, pipet tetes, botol coklat, vial, corong pisah, rotary evaporator.
Alat-alat yang digunakan untuk uji aktivitas sitotoksik berupa sarung tangan karet, botol semprot, labu Erlenmeyer, gelas piala, flask T-25 (Iwaki®), botol Duran, tabung Appendorf (Iwaki®), pipet mikro (Ecopipette®), hemasitometer, timbangan analitik, autoklaf (Hirayama®), lemari es (Nasional®), inkubator 370C/5% CO2 (Thermo Scientific®), microbiological safety cabinet air flow kelas II (Thermo Scientific®), vortex (Etech®), penangas air (Memert®), sentrifus (Thermo Scientific®), tabung sentrifugal, mikroskop inverted (Zeiss®), plat 96 sumuran, dan spektrofotometer microplate (xMarkTM).
Bahan yang digunakan untuk fraksinasi berupa ekstrak etanol kulit buah asam kandis, heksan, etil asetat, dan aquadest.
Bahan yang digunakan untuk uji efek sitotoksik yaitu sel kanker payudara manusia T47D, dimetil sulfoksida (DMSO), etanol 70%, air ultrapurifikasi, medium Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (Sigma-Aldrich®), Fetal Bovine Serum (FBS) (Sigma-Aldrich®), Penicillin-Streptomycin, Trypsin-EDTA, Phosphate buffer Saline (PBS) (Sigma-Aldrich®), dan reagen 3-(4,5- dimetilthiazol-2- il)-2,5- difeniltetrazolium bromida (reagen MTT).
Fraksinasi Ekstrak Etanol Kulit Buah Asam Kandis
Ekstrak etanol kulit buah asam kandis difraksinasi dengan heksan dan air dalam corong pisah, dikocok secukupnya. Setelah itu dibiarkan sampai terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan heksan dan lapisan air. Perlakuan ini dilakukan beberapa kali pengulangan sampai
lapisan heksan terlihat jernih sehingga diperoleh fraksi heksan. Hasil fraksi heksan diuapkan dengan rotary evaporator sehingga didapatkan ekstrak kental dari fraksi tersebut. Lapisan air kemudian difraksinasi dengan etil asetat dilakukan beberapa kali pengulangan seperti perlakuan diatas sehingga diperoleh fraksi air dan fraksi etil asetat. Hasil fraksi etil asetat diuapkan dengan rotary
80 evaporator sehingga didapatkan ekstrak kental. Kemudian fraksi air sisa di uapkan dengan rotary evaporator sehingga di dapatkan ekstrak kental.
Kultur Sel
a) Persiapan Alat
Alat-alat yang digunakan untuk pengujian harus dalam keadaan bersih dan steril. Wadah plastik dipersiapkan hanya untuk satu kali pemakaian, dan sterilitasnya terjamin selama kemasan tidak rusak. Untuk alat-alat berbahan gelas, wadah dicuci bersih dan dikeringkan. Kemudian disterilkan dengan autoklaf pada suhu 1210C tekanan 15 lbs selama 15 menit. Sedangkan laminar air flow disterilkan dengan cara disemprot dengan etanol 70% dan juga dilengkapi dengan lampu UV.
b) Penyiapan Sel
Sel kanker payudara yang digunakan yaitu sel T47D yang merupakan koleksi
Cancer Chemoprevention Research Center
(CCRC) dari Universitas Gajah Mada (UGM). Sel kanker dikeluarkan dari freezer (-80 0C), dihangatkan dalam penangas air pada suhu 370C selama 2-3 menit. Setelah mencair, sel dipindahkan ke dalam flask yang telah berisi 10 ml media, diinkubasi selama 3-4 jam pada suhu 370C/5% C02, kemudian diamati dibawah mikroskop untuk melihat apakah sel melekat di dasar flask dan membentuk lapisan monolayer. Medium pertumbuhan diganti sekali dalam dua hari dan bila jumlah sel di dalam flask mencapai 70-85%, lakukan sub-kultur sel.
c) Sub Kultur Sel
Medium yang ada di dalam flask dibuang, kemudian tambahkan 2 ml trypsin-EDTA lalu aduk perlahan, inkubasi selama 5 menit pada suhu 370C, 5% CO2, setelah itu amati sel di bawah mikroskop. Kemudian larutan tripsin-EDTA yang berisi sel disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Buang supernatan, lalu pelet disuspensikan dalam 3 ml medium. Masukkan ke dalam flask baru, aduk perlahan. Inkubasi pada suhu 370C, 5% CO2
d) Penghitungan Sel
Tambahkan 2 ml trypsin-EDTA ke dalam flask yang berisi kultur sel, kemudian inkubasi 5-10 menit. Kemudian larutan tripsin-EDTA yang berisi sel disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Buang supernatan, lalu pelet disuspensikan dalam 3 ml medium RPMI. Ambil 10 µl suspensi sel, letakkan pada masing-masing kotak penghitungan sel hemasitometer. Lakukan penghitungan di bawah mikroskop. Tentukan rata-rata jumlah sel aktif yang ada untuk dapat membuat suspensi 2000 sel dalam setiap sumur pada plat 96 sumuran.
e) Peletakan Sel
Dibuat suspensi sel dalam medium (jumlah dan volume terukur), campur sempurna. Masukkan sebanyak 180 µl suspensi ke dalam masing-masing sumur kecuali sumur pada kolom pertama dan terakhir. Kolom pertama dan terakhir merupakan blanko yang hanya berisi medium 200 µl, sedangkan kolom kedua merupakan kontrol yang berisi suspensi sel 200 µl. Inkubasi pada suhu 370C, 5% CO2 selama 24 jam.
Pembuatan Larutan Uji a) Larutan Stok
Ekstrak ditimbang sebanyak 100 mg. Ekstrak dilarutkan dalam 1 ml DMSO untuk mendapatkan konsentrasi larutan 100 mg/ml.
b) Pengenceran Larutan Uji
Medium dipipet 90 µl ke dalam 5 buah mikrotube. Larutan induk dibuat dengan konsentrasi 10 mg/ml dengan cara memipet 10 µl larutan larutan stok kemudian dipindahkan ke dalam tabung pertama, aduk sempurna. Pengenceran dilakukan bertingkat dengan cara memindahkan 10 µl larutan uji dari tabung pertama ke tabung kedua. Lakukan hal yang sama untuk tabung selanjutnya sehingga akan diperoleh larutan dengan konsentrasi 100, 10, 1 dan 0,1 µg/ml pada masing-masing sumur pada plat 96 sumuran.
81 Uji Proliferasi Sel (Uji MTT)
a) Peletakan Larutan Uji
Plat uji yang telah berisi sel dan telah diinkubasi selama 24 jam, dibagi menjadi 3 bagian. Setiap bagian dirancang untuk empat kali replikasi. Peletakan larutan uji dimulai dari konsentrasi paling rendah. Pindahkan 20 µl larutan uji ke dalam masing-masing sumur kecuali sumur kontrol dan sumur blanko . Plat kembali diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator 370C/ 5% CO2. Amati perubahan yang terjadi pada sel selama masa inkubasi.
b) Peletakan Larutan MTT
Larutan MTT 5 mg/ml dipipet 20 µl ke dalam masing-masing sumur. Inkubasi selama 3-4 jam pada 370C, 5% CO2. Setelah 3-4 jam, akan terlihat adanya endapan ungu kristal formazan. Medium yang mengandung reagen MTT dibuang dengan cara dihisap dari setiap sumur, sehingga yang tertinggal hanya endapan ungu kristal formazan. Larutkan endapan pada setiap sumur dengan 100 µl DMSO. Ukur serapannya dengan spektrofotometer micrroplate pada λ 550 nm.
Analisis Data
Dengan menggunakan data absorban yang diperoleh dari pengukuran, dapat
ditentukan persentase sel yang terhambat dengan menggunakan rumus sebagai berikut: Rumus % viabilitas sel
Dari % viabilitas sel ini,lalu dilakukan perhitungan IC50. IC50 merupankan gambaran efek sitiotoksik yang diberikan oleh fraksi, yaitu kadar yang dapat menghambat proliferasi sel sebesar 50%.
Hubungan antara log konsentrasi larutan uji dengan viabilitas sel dapat ditampilkan dalam bentuk grafik. Dari grafik tersebut dapat ditentukan harga IC50 dengan persamaan regresi linier dengan syarat r lebih besar dari r tabel, kemudian masukan y = 50 pada persamaan regresi linier dan cari x nya kemudian dihitung, antilog dari konsentrasi tersebut sehingga diperoleh IC50 (konsentrasi yang dapat menghambat 50 pertumbuhan sel) larutan uji (CCRC, 2009).
Selanjutnya, data hubungan antara konsentrasi sediaan uji dengan absorban dianalisis secara statistik menggunakan analisa varian (ANOVA) satu arah yang dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan (Duncan’s Multiple Range Test).
HASIL DAN DISKUSI
Dari penelitian yang telah dilakukan didapatkan hasil sebagai berikut: a) Hasil Uji Proliferasi Sel (Uji MTT)
Berdasarkan uji MTT yang telah dilakukan dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Nilai IC50 Fraksi Terhadap Sel Kanker Payudara T47D
Sampel Nilai IC50
Fraksi Heksan 3,53 µg/ml Fraksi Etil Asetat 0,59 µg/ml Fraksi Air 3457,39 µg/ml
82
Gambar 1. Grafik Hubungan Konsentrasi Fraksi Heksan Vs % Viabilitas Sel Kanker Payudara T47D
Gambar 2. Grafik Hubungan Konsentrasi Fraksi Etil Vs % Viabilitas Sel Kanker Payudara T47D
Gambar 3. Grafik Hubungan Konsentrasi Fraksi Etil Vs % Viabilitas Sel Kanker Payudara T47D
83 Nilai IC50 didapatkan dari grafik antara log konsentrasi larutan uji vs % viabilitas sel dengan persamaan regresi linier dengan syarat r lebih besar dari r tabel, kemudian masukan y = 50 pada persamaan regresi linier dan cari x nya kemudian dihitung, antilog dari konsentrasi tersebut sehingga diperoleh IC50.
Menurut The American National Cancer Institute, suatu ekstrak dikatakan memiliki aktivitas sitotoksik apabila nilai IC50 < 20 µg/ml (Lee & Houghton, 2005). Perlakuan dengan fraksi heksan dan etil asetat juga memberikan pengaruh terhadap marfologi sel. Sel yang hidup tampak masih banyak dan berbentuk seperti daun (Gambar 4 A), sedangkan sel yang sudah mengalami kematian tampak berbentuk bulat dan mengapung (Gambar 4 B,C). Sementara farksi air (D) masih menyerupai control, baik dari segi bentuk sel dan jumlahnya. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian fraksi heksan dan etil asetat dapat menginduksi terjadinya kematian sel pada sel kanker payudara T47D, sementara fraksi air tidak menunjukan aktifitas sitotoksik.
Gambar 4. Foto sel kanker payudara T47D di sumuran plate sebagai control (A) dan diberi perlakuan dengan fraksi heksan (B), fraksi etil asetat (C) dan fraksi air (D),
masing-masing pada
konsentrasi10 ug/mL (perbesaran 10x).
Dengan demikian fraksi heksan dan fraksi etil asetat kulit buah asam kandis dinyatakan memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker T47D, sedangkan pada fraksi air tidak memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 di atas 20 µg/ml.
Sebelumnya telah dilakukan penelitian mengenai uji sitotoksik dari ekstrak etanol kulit buah asam kandis dengan nilai IC50 19,33 µg/ml (Sutma, 2012).
Sehingga dari pernyataan tersebut dapat disimpulkan bahwa nilai IC50 dari ekstrak etanol kulit buah asam kandis lebih tinggi dibandingkan dengan nilai IC50 dari hasil fraksinasi ekstrak etanol kulit buah asam kandis dan bisa dikatakan bahwa hasil fraksinasi dari ekstrak etanol kulit buah asam kandis lebih besar khasiat nya sebagai anti kanker dibandingkan dengan ekstrak etanol kulit buah asam kandis tersebut.
Dari pemeriksaan metabolit yang telah dilakukan diketahui bahwa kulit buah asam kandis mengandung senyawa fenolik.
Senyawa fenolik dikenal dengan aktivitasnya sebagai antioksidan. Kemungkinan, efek sitotoksik dari kulit buah asam kandis ini, salah satunya berkaitan dengan kandungan fenoliknya. Fenolik berperan sebagai antioksidan karena dapat menangkap radikal bebas dengan melepaskan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya. Pemberian atom hidrogen ini akan menyebabkan radikal bebas menjadi stabil dan berhenti melakukan gerakan ekstrim, sehingga tak merusak lipida, protein, dan DNA (materi genetik) yang menjadi target kerusakan seluler. Dengan mekanisme seperti itu, radikal bebas dapat dihancurkan atau distabilkan yang pada akhirnya dapat menekan terjadinya kanker (Shahidi, et al., 1995).
b) Pengolahan data menggunakan ANOVA satu arah
Dari hasil pengolahan data menggunakan uji Analisa Varian (Anova) satu arah yang membandingkan antara persentase viabilitas sel kanker payudara
84 T47D dengan konsentrasi sediaan uji fraksi heksan kulit buah asam kandis didapatkan nilai yang signifikan (p = 0,002) < 0,05 dengan nilai F hitungnya 12,519, dan fraksi etil asetat kulit buah asam kandis didapatkan nilai yang signifikan juga yaitu (p = 0,001) < 0,05 dengan nilai F hitungnya 15,290, hal ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang bermakna dari masing-masing konsentrasi sediaan uji dan menunjukkan bahwa pemaparan fraksi heksan dan fraksi etil asetat kulit buah asam kandis memberikan pengaruh yang berbeda nyata antar kelompok konsentrasi sediaan uji terhadap persentase viabilitas sel kanker payudara T47D. Sedangkan hasil yang didapat dari fraksi air kulit buah asam kandis ternyata tidak signifikan yaitu (p = 0,169) > 0,05 dengan nilai F hitungnya 2,176, hal ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan yang tidak bermakna dari masing-masing konsentrasi sediaan uji dan menunjukkan bahwa pemaparan fraksi air kulit buah asam kandis tidak memberikan pengaruh yang
nyata antar kelompok konsentrasi sediaan uji terhadap persentase viabilitas sel kanker payudara T47D.
Hasil pengolahan data lanjutan yang menggunakan uji wilayah berganda duncan menunjukkan dua subset yang berbeda antara fraksi heksan kulit buah asam kandis pada kelompok yang memiliki konsentrasi 100 dan 10 µg/ml dengan kelompok yang memiliki konsentrasi 1 dan 0,1 µg/ml, dan demikian pula pada fraksi etil asetat kulit buah asam kandis menunjukkan dua subset yang berbeda antara kelompok yang memiliki konsentrasi 100 dan 10 µg/ml dengan kelompok yang memiliki konsentrasi 1 dan 0,1 µg/ml, nilai persentase viabilitas dari tiap subset menunjukkan adanya penurunan, dimulai dari konsentrasi 0,1 µg/ml sampai ke konsentrasi 100 µg/ml. Sedangkan pada fraksi air kulit buah asam kandis tidak memiliki perbedaan dan hanya menunjukkan satu subset saja pada kelompok yang memiliki konsentrasi 100,10,1 dan 0,1 µg/ml.
KESIMPULAN Berdasarkan data hasil penelitian
yang telah dilakukan, dapat diambil kesimpulan bahwa fraksi heksan dan fraksi etil asetat kulit buah asam kandis berpotensi untuk dikembangkan sebagai sumber baru dalam mengembangkan obat kanker. Namun, masih diperlukan penelitian lebih
lanjut dengan melakukan isolasi murni terhadap fraksi heksan dan fraksi etil asetat kulit buah asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) untuk menyelidiki senyawa aktif antikanker pada fraksi tersebut yang bersifat sitotoksik.
DAFTAR PUSTAKA Abcam. (2007). T47D (Human ductal breast
epithelial tumor cell line) Whole Cell Lysate (ab 14899) data sheet. http://www.abcam.com/index.html data sheet = 14899, diakses November 2012
Abcams, G.D. (1994). Gangguan pertumbuhan, proliferasi dan differensiasi sel. In S.A. Price, L.M. Wilson (Eds). Patofisiologi, konsep klinis proses-proses penyakit. (Edisi 4). Buku I. Penerjemah: P. Anugerah. Jakarta: EGC.
American Cancer Society. Breast Cancer Facts & Figures. (2009-2010). Atlanta: American Cancer Society, Inc.; 2009
American Cancer Society. Cancer Facts & Figures . (2010). Atlanta: American Cancer Society; 2010.
Burdall, E.S., Hanby M.A., Landsdown, R.J.M., dan Speirs, V. (2003), Bereast Cancer Cell Line, Breast Cancer Res., 5(2): 89-95.
Burkill, I. (1966). A Dictionary of the Economic Products of the Malay
85 Peninsula., 2nd ed. Ministry of Agriculture and Co-Operatives, Kuala Lumpur, Malaysia.
Campbell, A. N, J. B. Reece, L.G. Mitchell. (2002). Biology. Erlangga. Jakarta Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG, and
Taylor MR. (2008). Biology. 4th Ed. , Addison Wesley World Student Series, San Fransisco.
CCRC. (2009). Prosedur Tetap Uji Sitotoksik Metoda MTT. Yogyakarta:. Fakultas Farmasi, UGM.
Clarke RB, Howell A, Anderson E. (1997). Breast Cancer Res. Treat., 45: 121-133.
Corner, J. (2001). What is the cancer. In. J. Corner C. Bailey Cancer nursing care in context. Oxford : Blackwell Publishing.
Darwito, Suwito. (2009). Omega-3 dan
Kanker Payudara.
http://darwitosuwitosaridinsangpemb aharu.blogspot.com/2009/03/pengerti an-kanker-payudara-kanker. html. (diakses tanggal 27 November 2012). Departemen Kesehatan, (2009). Profil Kesehatan Indonesia 2008. Jakarta: Departemen Kesehatan RI
Djajanegara, I. & Wahyudi, P. (2010). Uji Sitotoksisitas Ekstrak etanol Herba ceplukan (Physalis angulata Linn.) terhadap Sel T47D secara In Vitro. J. Ilmu Kefarmasian Ind. 8, (1), 41-47.
Dipiro Joseph., Talbert, Robert L., Yee, Gary C (2008). Pharmacotherapy: A Pathophysiology Approach (7th Edition). New York: The Mc Graw-Hill Companies Inc.
Dipiro Joseph T., Barbara G.Wells, Terry L. Schwinghammer and Cecily V. (2009). Pharmacotherapy Handbook, 2009, 7th Edition. New York: The Mc Graw-Hill Companies Inc.
Doyle, A., dan Griffiths, J. B. (2000). Cell and Tissue Culture for Medical Research. John Willey and Sons Ltd. : New York.
Freshney, R.I., (2004), Animal Cell Culture, A Practical Approach, 4th Ed. IRL Press: Washington DC.
Guyton, A. C. (1997). Buku ajar fisiologi kedokteran. Setiawan, I. (Ed IX). Jakarta : EGC.
Guyton, A. C. & Hall, J. E. (2006). Buku Ajar Fisiologi Kedokteran (Edisi X). Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Hanahan,D., R. A. Weinberg,. (2000) “The Halfmark of Cancer”, Cell, 100:57-70.
Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Jakarta: Yayasan SaranaWana Jaya.
Hirshaut & Pressman, (1992). http://id.wikipedia.org. Diakses pada tanggal 1 Oktober 2010.
Jabit, Md. Lip, Wahyuni, F.S, Rozida, K., Ahmad, I.D., Khozirah, S., Lajis Nordin H, & Johnson, S. (2009). Cytotoxic and nitric oxide inhibitory activities of methanol extracts of Garcinia species. Pharmaceutical Biology. 47(11): 1019–1026.
Jena, B. S., Jayaprakasha, G. K., and Sakariah, K. K. (2002). Organic acids from leaves, fruits, and rinds of Garcinia cowa. Journal of Agricultural and food chemistry 50 (12): 3431-3434.
Jochems, Carlo. (2009). Fetal Bovine Serum: Are Cell Cultures Cruelty Free. Diakses dari: http://www.all-creatures.org/clct/ar-fetal.html. Diakses tanggal: 29 Mei 2012.
Jong, Wim de. (2004). Kanker, apakah itu? pengobatan, harapan hidup dan dukungan keluarga. Terjemahan: Astoeti Suharto Heerdjan, Arcan: Jakarta. Hal 2-16.
Kasugai S, Hasegawa N and Ogura H.(1991). Application of the MTT colorimetric assay to measure cytotxic effect of phenolic compound on established rat pulp cells. J. Dent Res. 70: 127-130.
Kenji, M., Yukihiro, A., Emi, K., Tetsuro, I., Kenji, O., Toshiyuki, T., Munekazu,
86 I., & Yoshinori, N. (2003). Cytotoxic benzophenone derivatives from Garcinia species display a strong apoptosis-inducing effect against human leukemia cell lines. Biol Pharm Bull. 26: 569–571.
Kuswibawati, Luciana. (2000). Apa Itu Kanker. Yogyakarta: Penerbit Universitas Sanata Dharma.
Knight, L. (2007). The Cell. In J.A. Gabriel (Ed). The biology of cancer (pp.33-43). Chichester : John Wiley & Sons Ltd.
Lee, C.C & Houghton, P. (2005). Cytotoxicity of plants from Malaysia and Thailand used traditionally to treat cancer. J Ethnopharmacol, 2005; 100: 237-243.
Lisdawati, Vivi, dkk. (2007). “Isolasi dan Elusidasi Struktur Senyawa Lignan dan Asam Lemak dari Ekstrak Daging Buah Phaleria Macrocarp”. Bul. Penel. Kesehatan 35, 3: 115 – 124.
Maryati & Sutrisna, EM. (2007). Potensi Sitotoksik Tanaman ceplukan (Physalis angulata L) terhadap Sel HeLa. Pharmacon. Vol. 8, No.1, Juni 2007.
Melannisa, R. (2004). Pengaruh PGV-1 pada Sel Kanker Payudara T47D yang diinduksi 17β-Estradiol: Kajian Antiproliferasi, Pemacuan Apoptosis dan Antiangiogenesis, (Tesis). Program Pasca Sarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Moeljopawiro, S., M.R. Anggela, D. Ayuningtyas, B. Widaryanti, Y.Sari, dan I.M.Budi. (2007). “Pengaruh Sari Buah Merah (Pandanus conoideus Lamk.) Terhadap Pertumbuhan Sel Kanker Payudara dan Sel Kanker Usus Besar”. Berkala Ilmiah Biologi 6, 2 : 121 – 130. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric
assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Method, 16;65(1-2), 55-63.
Murray, R. K.(1999). Kanker, gen kanker dan faktor pertumbuhan. In R. K. Murray et al.(Eds.) Biokimia Harper, Ed 24. Jakarta : EGC
Nafrialdi, & Gan, S,. (1995) Antikanker dan imunosupresan. In Ganiswara, S. G. et al, (Eds.) Farmakologi dan terapi, Ed. 4, Jakarta : UIP.
Na Pattalung, P., Thongtheeraparp, W., Wiriyachitra , P. & Taylor, W.C. (1994). Xanthones of Garcinia cowa. Planta Med. 60: 365-368.
Panthong, K., Pongcharoen, W., Phongpaichit, S., & Taylor, W.C. (2006). Tetraoxygenated xanthones from the fruits of Garcinia cowa. Phytochemistry. 67 (2006) 999–1004 Peres, V., Nagem, T.J., & Fernando, O.
(2000). Tetraoxygenated naturally
occurring xanthones.
Phytochemistry. 55: 683–710.
Poomipamorn, S. & Kumomg, A. (1997). Edible Multiporpuse ree Species Faung Fa. Bangkok: Printing (in Tai).
Pollard, Thomas D., William C. Earnshaw. (2004). Cell Biology. Philadelphia Saunders.
Rao, R. R. (1981). Ethnobotany of Meghalaya: Medicinal Plants Used by Khasi and Garo Tribes. Economic Botany 35(1):4-9.
Rukachaisirikul, V., Trisuwan, K., Sukpondma, Y., & Phongpaichit, S. (2008). A new benzoquinone derivative from the leaves of Garcinia parvifolia. Arch Pharm Res. 31: 17–20.
Sadaquat, A., Renee, G., Subramaniam, S., Bleaulieu, C., & Spino, C. (2000). Benzophenones of Garcinia pseudoguttifera (Clusiaceae). Phytochemistry. 53: 281–284.
Shahidi, F. and M. Naczk. (1995). Food Phenolics: Sources, Chemistry, Effects, Applications. Ed. Technomic Publishing Co. Inc.
Schafer, J.M., Lee, E.S., O’Regan, R.M., Yao, K., dan Jordan, V.C. (2000).
87 Rapid Development of Tamoxifen-stimulated Mutant p53 Breast Tumors (T47D) in Athymic Mice, Clinical Cancer Research, 6, 4373-4380.
Sutma, S. (2012). Uji Efek Sitotoksik Ekstrak
Etanol Kulit Buah Asam Kandis (Garcinia cowa Roxb.) Terhadap Sel Kanker Payudara T47D Dengan Metoda MTT. (Skripsi). Padang:
F.Farmasi, UNAND.
Tjay, T.H., Rahardja, K. (2002). Obat-obat Penting : Khasiat, Penggunaan, dan. Efek-Efek Sampingnya. Edisi VI. Jakarta: Penerbit PT. Elex Media Komputindo.
Van De Graaff, K.M., S. I. (1995). Concepts human of anatomy and physiology. Fourth Edition. Dubuque, Bogota, Boston, London: Wm. C. Brown Publishers.
Verma, S.P., Goldin, B.R., and Lin, P.S.. (1998). The Inhibition of the Estrogenic Effects of Pesticides dan Enviromental Chemicals by
Curcumin and Isoflavonoids. Envir. Health Presp, 106 (12), 807-812. Wahyuni, F.S., Byrne, L.T., Dachriyanus,
Dianita, R., Jubahar, J., Lajis, N.H., & Sargent, M.V., (2004). A New Ring-Reduced
Tetraprenyltoluquinone and a prenylated xanthone from Garcinia cowa. Aust. J. Chem. 57: 223-226. Whitmore, T.C. (1973). Guttiferae. In
T.C.Whitmore (ed.) Tree Flora of Malaya 2: 162-236. Kuala Lumpur, Longman Malaysia.
Yarbro, C., Frogge, M. and Goodman, M. (2005). Cancer nursing: principles and practice, 6th ed., Boston, MA: Jones and Bartlett Publishers.
Zampieri, L., Bianchi, P., Ruff, P., dan Arbuthnot, P. (2002). Differential modulation by estradiol of P-glycoprotein drug resistance protein expression in cultured MCF7 and T47D breast cancer cells, Anticancer Res., 22(4):2253-9
