UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav) TERHADAP KULTUR SEL RAJI SKRIPSI

(1)

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOLIK DAUN SIRIH MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav)

TERHADAP KULTUR SEL RAJI

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Eva Dwi Kusumaningtyas NIM : 048114147

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2008

(2)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

Eva Dwi Kusumaningtyas NIM : 048114147

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

2008

(3)

PERSETUJUAN PEMBIMBING

Yang diajukan oleh : Eva Dwi Kusumaningtyas

NIM : 048114147

telah disetujui oleh

(4)

Pengesahan Skripsi Berjudul

Oleh :

Eva Dwi Kusumaningtyas NIM : 048114147

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 28 Juni 2008

(5)

HALAMAN PERSEMBAHAN

Aku menanti datangnya pagi

Dan aku temui

Aku menanti bergantinya hari

Dan aku temui

Aku menanti musim berganti

Dan aku temui

Aku mencari hati

Dan aku dapati

Tiada kata yang bisa terucap selain terimakasih

Dan tiada hal yang dapat kuingat selain

KASIH

Skripsi Ini kupersembahkan Untuk :

Papa dan Mamaku tercinta....

Kakakku

terkasih....

Saudara

dan

teman

–

temanku....

Almamaterku...

(6)

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN

PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Yang bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universitas Sanata Dharma : Nama : Eva Dwi Kusumaningtyas

Nomor Mahasiswa : 048114147

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul :

“Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Raji”

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan, me-ngalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data, mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di Internet atau media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari saya maupun memberikan royalti kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya. Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 18 Juli 2008 Yang menyatakan

( Eva Dwi Kusumaningtyas )

(7)

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yesus Kristus atas semua rahmat dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi yang berjudul “Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih

Merah (Piper Crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Raji.” Skripsi ini

disusun dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm).

Selama penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis tidak terlepas dari bantuan dan dukungan berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terimakasih kepada :

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

2. Drs. A. Yuswanto S.U., Ph.D., Apt. selaku dosen pembimbing atas kesediaannya dalam memberikan arahan, dukungan dan masukan dalam penelitian dan penulisan skripsi ini.

3. Drs. Mulyono., Apt. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan masukan kepada penulis.

4. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah banyak memberikan masukan kepada penulis.

5. Ibu Tri Yuliani dan segenap karyawan LPPT Universitas Gadjah Mada yang telah banyak membantu dalam pelaksanaan penelitian.

(8)

6. Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., dan Romo Sunu yang telah membantu penyelesaian skripsi ini.

7. Papa dan Mamaku tercinta, Kakakku Petra, Mbak Dwi, dek Pasha, Andreas Bob Dwi Putra dan segenap keluarga besar atas semua dukungan, kasih sayang dan semangat yang diberikan.

8. Anggota team sirih merah : Ririt, Meri, Siska dan Nur, terimakasih untuk kerjasama dan bantuannya, serta suka dan duka dalam masa ‘penantian’. 9. Rike, Bu Novi dan temen – temen GTY, Mbak Darti sekeluarga, Bapak

Narkoyo sekeluarga yang selalu memberikan dukungan.

10. Teman - teman kosku Yanti, Dewi, Ayu, Wulan, teman – teman kelas C dan praktikum golongan F, Vina, Syamsi, Mas Adi, Robert, Finza, Budiaji, Maria, Siska, Evi, Dhita, Mas Ary, Yusak, Hendrat, Kornel untuk pengertian dan dukungan yang diberikan serta persahabatan kita.

11. Semua pihak yang turut membantu dalam penyusunan skripsi ini.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan yang terdapat dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang menyempurnakan. Semoga penulisan skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi semua pihak serta mendukung perkembangan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, Mei 2008 Penulis

(9)

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, 10 Mei 2008 Penulis

Eva Dwi Kusumaningtyas

(10)

INTISARI

Di Indonesia, kanker merupakan salah satu penyakit yang masih berpotensi tinggi dalam menyebabkan kematian. Secara empiris, tanaman sirih merah (Piper crocatum) telah digunakan oleh masyarakat sebagai obat antikanker. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui potensi efek sitotoksik dan nilai LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan lengkap pola satu arah. Ekstrak etanolik daun sirih merah dibuat dalam delapan konsentrasi yaitu 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah dilakukan dengan metode direct counting. Perolehan hasil perhitungan merupakan persen kematian sel yang kemudian dilakukan analisis statistik menggunakan Anova satu arah dan analisis probit untuk menentukan nilai LC50.

Melalui uji sitotoksisitas yang dilakukan dapat diketahui bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel Raji, dengan nilai LC50 395,5 µg/ml.

Kata kunci : sitotoksisitas, ekstrak etanolik, daun sirih merah, LC50, sel Raji

(11)

ABSTRACT

In Indonesia, cancer is a kind of the disease that might cause death. Empiricaly, Piper crocatum Ruiz & Pav has been used for cancer treatment. The objective of this research is to identify the cytotoxicity potential and the LC50 of

ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav against Raji Cell Culture.

This research was pure experimental with one way completely randomized design. Ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav was made on eight concentration, that were 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750 and 2000 µg/ml. The cytotoxicity test have been done with the direct counting method. Cytotoxicity of ethanolic extract of Piper crocatum Ruiz & Pav were analyzed with one way Anova and the LC50 value were analyzed with probit statistic.

The result showed that the extract of Piper crocatum Ruiz & Pav have cytotoxicity effect on Raji cell culture with LC50 value of 395.5 µg/ml.

Keyword : cytotoxicity, ethanolic extract, Piper crocatum Ruiz & Pav, LC50, Raji cell culture

(12)

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN SAMPUL ... i

HALAMAN JUDUL... ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

PENGESAHAN SKRIPSI ... iv

HALAMAN PERSEMBAHAN... ...v

PRAKATA... vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... viii

INTISARI... ix

ABSTRACT...x

DAFTAR ISI... xi

DAFTAR TABEL...xv

DAFTAR GAMBAR ... xvi

DAFTAR LAMPIRAN... xviii

BAB I PENGANTAR...1 A. Latar Belakang ...1 1. Perumusan Masalah...2 2. Keaslian karya ...3 3. Manfaat penelitian ...3 B. Tujuan Penelitian ...3 1. Tujuan umum...3 2. Tujuan khusus...3 xi

(13)

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...4

A. Sirih Merah... ... 4

1. Keterangan Botani ...4

2. Deskripsi Tanaman ...4

3. Kandungan Kimia...4

4. Khasiat dan Kegunaan ...5

B. Teknik Penyarian…………... 5 C. Kanker...7 1. Tinjauan Umum...7 2. Limfoma ...10 D. Kultur Sel ...10 E. Sitotoksisitas ...11 F. Landasan Teori...12 G. Hipotesis...13

BAB III METODOLOGI PENELITIAN...14

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...14

B. Variabel dan Definisi Operasional...14

a. Variabel ...14

1. Variabel bebas...14

2. Variabel tergantung...14

3. Variabel pengacau terkendali...14

(14)

C. Alat dan Bahan...15

1. Alat ...15

2. Bahan ...15

D. Tata Cara Penelitian ...16

1. Determinasi tanaman ...16

2. Pengumpulan daun sirih merah ...16

3. Pembuatan serbuk daun sirih merah...16

4. Sterilisasi alat...17

5. Pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah ...17

6. Pembuatan larutan uji ...17

7. Pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh ...18

a. Pembuatan medium pencuci ...18

b. Pembuatan medium penumbuh ...18

8. Preparasi kultur sel Raji...18

a. Propagasi sel raji...18

b. Panen sel raji...19

9. Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah dengan menggunakan metode direct counting ...19

E. Analisis Hasil ...20

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...21

A. Determinasi Tanaman ...21

(15)

C. Pembuatan serbuk daun sirih merah ...22

D. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah ...22

E. Sterilisasi Alat ...24

F. Pembuatan Medium Pencuci dan Penumbuh...24

G. Preparasi Kultur Sel Raji...25

H. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah...26

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN...33

A. Kesimpulan ...33

B. Saran...33

DAFTAR PUSTAKA ...34

LAMPIRAN...37

(16)

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I. Pelarut dan tingkat kepolaran...7 Tabel II. Hasil perhitungan sel raji secara direct counting pada perlakuan

masing-masing konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah setelah inkubasi 24 jam ...27 Tabel III. Persentase kematian sel raji dan harga probit setelah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah setelah inkubasi 24 jam ...29 Tabel IV. Harga probit sesuai dengan prosentasenya ...42 Tabel V. Nilai koefisien korelasi pada level signifikansi 5% dan 1% ...50

(17)

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 1. Sel Raji pada kontrol dan sel Raji dengan pemberian ekstrak etanolik

daun sirih merah 2000 µg/ml, pada bilik haemocytometer di bawah

mikroskop dengan perbesaran 100x...26

Gambar 2. Sel raji yang mati seluruhnya pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 2000 µg/ml; sel raji pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 250 µg/ml, pada perbesaran 100x ...27

Gambar 3. Kontrol pada perbesaran 100x, tidak terdapat kematian sel raji ...28

Gambar 4. Grafik pengaruh konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap persentase kematian sel Raji ...28

Gambar 5. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan I ...30

Gambar 6. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan II...31

Gambar 7. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan III ...31

Gambar 8. Tanaman Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)...38

Gambar 9. 96 well Plate dan conical steril...38

Gambar 10. Kultur sel raji dalam flask...38

Gambar 11. Laminar air flow...39

Gambar 12. Haemocytometer dan cell counter...39

Gambar 13. Inverted microscope...39

(18)

Gambar 14. Sel raji dengan pemberian ekstrak 1750 µg/ml...40

(19)

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil determinasi ...7

Lampiran 2. Peralatan dan bahan yang digunakan dalam penelitian ...38

Lampiran 3. Sel raji dengan pemberian ekstrak setelah inkubasi 24 jam ...40

Lampiran 4. Tabel probit...42

Lampiran 5. Perhitungan LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel raji...43

Lampiran 6. Perhitungan nilai korelasi LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji pada taraf kepercayaan 95%...50

Lampiran 7. Tes distribusi normal Kolmogorov-Smirnov...51

Lampiran 8. Analisis statistik Anova satu arah...51

(20)

BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang

Kanker merupakan salah satu penyakit yang berpotensi tinggi dalam menyebabkan kematian dan bertanggung jawab atas satu dari setiap lima kematian. Di Indonesia, kanker menempati peringkat keenam setelah penyakit jantung dan jumlah pasien kanker mengalami peningkatan setiap tahun (Adamo, 2006). Pengobatan terhadap kanker dapat dilakukan dengan cara pembedahan, kemoterapi dan radioterapi. Alternatif lain yang digunakan oleh sebagian penderita kanker adalah melalui ramuan tradisional dari tanaman. Pengembangan dan pemanfaatan bahan alam terutama tanaman telah berlangsung lama di Indonesia yang kaya akan tumbuh – tumbuhan (Dalimartha, 2006). Masyarakat dengan latar belakang budaya dan etniknya, lazim menggunakan obat tradisional dengan memanfaatkan bahan alam tersebut yang disebut dengan jamu. Namun penggunaan tanaman sebagai obat biasanya masih terbatas secara tradisional dan turun temurun berdasarkan pengalaman.

Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) mempunyai bentuk yang menarik dan dapat berfungsi sebagai antikejang, antiseptik, analgetik, antiketombe, antidiabetes, pelindung hati, antidiare, mempertahankan kekebalan tubuh dan penghilang bengkak serta berbagai macam radang, dan yang paling menarik adalah pemakaian empiris ekstrak yang diklaim dapat menyembuhkan penyakit kanker payudara dan kanker rahim (Sudewo, 2005). Pemanfaatan daun

(21)

sirih merah sebagai obat kanker telah diakui secara empiris, baik digunakan secara tunggal maupun dikombinasikan dengan tanaman lain dalam berbagai bentuk seperti rebusan dan kapsul. Akan tetapi, secara ilmiah belum terdapat bukti yang mendukung mengenai kebenaran aktivitas tanaman sirih merah sebagai obat antikanker.

Mengacu pada klaim khasiat bahwa ekstrak daun sirih merah tersebut dapat mengobati penyakit kanker payudara dan kanker rahim, maka perlu dilakukan penelitian mengenai potensi ekstrak daun sirih merah terhadap penyakit kanker yang lain. Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan gambaran mengenai potensi efek sitotoksik ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel kanker limfoma.

1. Perumusan Masalah

Uji sitotoksisitas dapat dilakukan secara in vitro dengan menggunakan suatu kultur sel. Kultur sel Raji merupakan kultur sel kanker yang diturunkan dari penyakit Limfoma Burkitt. Berdasarkan latar belakang dari penelitian maka timbul beberapa permasalahan, yaitu :

a. Apakah ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel Raji ?

b. Berapakah nilai LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel

(22)

2. Keaslian Karya

Sejauh ini, penulis belum menemukan adanya penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel Raji di Universitas Sanata Dharma dan Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat Teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan dan memperkaya informasi mengenai daya sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

b. Manfaat Praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan suatu alternatif untuk pengobatan kanker dengan memanfaatkan bahan alam.

B. Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umum

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi sitotoksik dari ekstrak etanolik daun sirih merah.

2. Tujuan Khusus

a. Untuk mengetahui potensi sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

b. Untuk mengetahui nilai LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur

(23)

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Sirih Merah

1. Keterangan Botani

Tanaman sirih merah termasuk ke dalam famili Piperaceae dan genus Piper, memiliki nama spesies Piper crocatum Ruiz & Pav, serta sinonim dengan Piper ornatum N.E.Br (Anonim, 2007a).

2. Deskripsi Tanaman

Tanaman sirih merah tumbuh menjalar seperti halnya sirih hijau. Batangnya bulat berwarna hijau keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan bagian atas meruncing, bertepi rata dan permukaannya mengkilap atau tidak berbulu. Panjang daunnya bisa mencapai 15 sampai dengan 20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak warna putih keabu – abuan. Bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya berlendir, berasa sangat pahit dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas dengan jarak buku 5 – 10 cm, di setiap buku tumbuh bakal akar (Sudewo, 2005).

3. Kandungan Kimia

Dari hasil penelitian berupa uji tabung dan uji kromatografi lapis tipis diketahui daun sirih merah mengandung senyawa flavonoid, alkaloid, senyawa polifenolat, tanin dan minyak atsiri (Sudewo, 2005).

(24)

4. Khasiat dan Kegunaan

Dalam penggunaan secara empiris ekstrak daun sirih merah pada pemakaian tunggal atau dikombinasikan dengan tanaman obat lainnya mampu mengobati penyakit seperti diabetes mellitus, peradangan akut pada organ tubuh tertentu, luka yang sulit sembuh, kanker payudara dan kanker rahim, leukemia, TBC, radang pada lever, lemah sahwat, ambeien, jantung koroner, darah tinggi dan asam urat (Sudewo, 2005).

B. Teknik Penyarian

Ekstraksi atau penyarian adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut air. Hal – hal yang perlu diperhatikan dalam pembuatan ekstrak meliputi pembuatan serbuk simplisia dan klasifikasinya, cairan penyari, pemekatan, pengeringan ekstrak dan rendemen (Anonim, 2000).

Ekstrak merupakan sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim,1995). Pada ekstrak tumbuhan (umumnya konsentrasi etanolnya berbeda – beda) jika bahan pengekstrasinya sebagian atau seluruhnya diuapkan, maka diperoleh ekstrak, yang dikelompokkan menurut sifat – sifatnya menjadi :

a. Ekstrak encer (extractum tenue). Merupakan ekstrak dengan konsistensi yang dapat dituang.

(25)

b. Ekstrak kental (extractum spissum). Ekstrak ini liat dalam keadaan dingin dan tidak dapat dituang. Kandungan airnya berjumlah sampai 30%. Jika kandungan air terlalu tinggi maka dapat menyebabkan suatu instabilitas bahan (tumbuhnya bakteri).

c. Ekstrak kering (extractum siccum). Memiliki konsistensi kering dan mudah digosokkan. Melalui penguapan cairan pengekstraksi dan pengeringan terbentuk suatu produk, biasanya menunjukkan kandungan lembab tidak lebih dari 5%.

d. Ekstrak cair (extractum fluidum). Diartikan sebagai suatu sediaan cair simplisia yang mengandung etanol sebagai pelarut atau sebagai pengawet atau sebagai pelarut dan pengawet (Voigt, 1994; Anonim, 1995)

Pengetahuan mengenai kandungan senyawa aktif yang terkandung dalam simplisia akan mempermudah pemilihan cairan penyari dan cara ekstraksi yang tepat (Anonim, 2000). Pemilihan cairan penyari harus meliputi beberapa kriteria, antara lain adalah murah dan mudah diperoleh, stabil secara kimia fisika, selektif yaitu hanya menarik zat berkhasiat yang dikehendaki, tidak mempengaruhi zat berkhasiat dan diperbolehkan oleh peraturan. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, etanol – air atau pelarut lain. Oleh karena banyak bahan tumbuhan larut air atau larut alkohol, maka air atau etanol lebih disukai penggunaannya sebagai cairan pengekstraksi (Voigt, 1994). Bila cairan penyari digunakan air, maka untuk mencegah timbulnya kapang ditambahkan bahan pengawet yang diberikan pada awal penyarian (Anonim, 1986).

(26)

Tabel I. Pelarut dan Tingkat Kepolaran Pelarut Tingkat Kepolaran Air 10,2 DMSO 7,2 Etanol 4,3 Etil Asetat 4,4

Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia ke dalam cairan penyari. Metode ini digunakan untuk penyarian simplisia yang mengandung zat aktif yang mudah larut dalam cairan penyari. Kerusakan senyawa yang tidak tahan panas dapat dihindari dengan metode ini (Anonim, 1986).

C. Kanker

1. Tinjauan Umum

Proliferasi sel terjadi melalui suatu rangkaian proses. Siklus dari sel sendiri terdiri dari fase mitosis dan interfase. Pada proses interfase tersebut sel akan mengalami fase G-1 yang merupakan permulaan dari replikasi asam deoksiribonukleat (DNA). Kemudian melalui fase S yaitu pembentukan DNA baru, jumlah kromosom akan berlipat dua dan terjadi persiapan ke tahapan selanjutnya. Fase G-2 merupakan fase pertumbuhan, kromosom yang terbentuk dari proses ini sudah ada dalam bentuk kromatida (Mutschler, 1999).

(27)

Kanker adalah suatu penyakit dimana terjadi pertumbuhan sel – sel jaringan tubuh yang tidak normal, cepat dan tidak terkendali. Dalam keadaan normal, sel hanya akan membelah jika tubuh membutuhkannya seperti mengganti sel rusak dan mati. Sebaliknya, sel kanker akan terus membelah diri meskipun tidak dibutuhkan, terlepas dari pengendalian pertumbuhan dan tidak lagi menuruti hukum – hukum pembiakan (Dalimarta, 2006). Sifat dari sel kanker adalah mempunyai kemampuan untuk bermigrasi dari tempatnya tumbuh ke jaringan di dekatnya (invasif) dan membentuk massa pada daerah baru di dalam tubuh (metastasis). Kanker terdiri dari sel ganas, menjadi lebih agresif dari waktu ke waktu dan menjadi letal apabila jaringan atau organ yang diperlukannya untuk bertahan hidup mengalami gangguan (Sofyan, 2000).

Penyebab dari kanker dapat berupa inveksi virus maupun faktor – faktor yang menginduksi penyakit oleh perubahan gen –gen secara mutasi. Mutasi merupakan perubahan yang terjadi pada gen atau pada kromosom. Beberapa buah mutasi mungkin dibutuhkan untuk mengubah sel normal menjadi sel kanker. Mutasi-mutasi tersebut sering diakibatkan agen kimia maupun fisik yang disebut karsinogen. Mutasi dapat terjadi secara spontan (diperoleh) ataupun diwariskan (mutasi germline). Bila sel kehilangan kemampuan untuk melakukan apoptosis (misalnya karena mutasi), atau bila inisiatif untuk melakukan apoptosis dihambat (oleh virus), sel yang rusak dapat terus membelah tanpa terbatas, yang akhirnya menjadi kanker. Apoptosis dapat terjadi misalnya ketika sel mengalami kerusakan yang sudah tidak dapat diperbaiki lagi. Keputusan untuk melakukan apoptosis

(28)

berasal dari sel itu sendiri, dari jaringan yang mengelilinginya, atau dari sel yang berasal dari sistem imun (Anonim, 2007b).

Terjadinya kanker disebut pula dengan karsinogenesis. Dalam prosesnya dibagi menjadi beberapa tahapan berupa :

a. Tahap inisiasi, sebagai tahap awal yang mengakibatkan terjadinya perubahan genetik sehingga menyebabkan abnormalitas proliferasi sel tunggal. Pada perubahan ini seringkali disebabkan karena mutasi atau pengaruh zat – zat yang bersifat karsinogen.

b. Tahap promosi, sel tumbuh sangat pesat yang pada akhirnya menjadi tumor benigna.

c. Tahap progresi, neoplasma akan berkembang menjadi bersifat ganas, biasanya diikuti invasi sel tumor ke dalam jaringan setempat dan dapat terjadi proses metastasis.

d. Tahap metastasis akan mengakibatkan penyebaran sel neoplastik dari tempat tumor utama menuju tempat yang lebih jauh (Schneider, 1997).

Sel kanker dikenal oleh tubuh sebagai bahan asing, sehingga mekanisme imunologi tubuh akan bereaksi secara humoral maupun seluler. Tubuh mempunyai kemampuan immunosurveillance terhadap semua sel kanker maupun sel yang bermutasi untuk mencegah perkembangan sel kanker tersebut, namun terkadang terjadi immunological escape yaitu sel kanker luput dari pengawasan sistem imun, sehingga terjadilah kanker. Penderita kanker sendiri juga mengalami supresi imun, tetapi kanker juga mempengaruhi sistem imun itu sendiri (Nafrialdi, 1995).

(29)

2. Limfoma

Limfoma adalah kanker yang berasal dari jaringan limfoid mencakup sistem limfatik dan imunitas tubuh. Kelainan umum yang sering menyertai adalah pembesaran kelenjar limfe dan terdapat kelainan sumsum tulang. Dalam praktek yang dimaksud dengan limfoma adalah LH (Limfoma Hodgkin) dan LNH (Limfoma Non Hodgkin). Pada LNH disebabkan oleh rangsangan imunologik yang menimbulkan proliferasi jaringan limfoid yang tidak terkendali (Tambunan, 2003).

D. Kultur Sel

Kultur sel merupakan keadaan dimana sel prokariotik maupun eukariotik berada dalam kondisi yang terkontrol. Sedangkan kultur primer adalah sel yang diisolasi dari suatu jaringan maupun organ aslinya kemudian ditumbuhkan dalam kultur media secara invitro dan dikondisikan sama seperti pada saat sel masih berada dalam jaringan aslinya (Freshney, 2000). Pemeriksaan kultur ini dapat dilakukan dengan pengamatan morfologi sel, warna medium dan kepadatan sel (Wolf, 2006). Pemindahan sel ke dalam flask baru dengan medium yang baru disebut dengan subkultur (Freshney, 2000).

Sel Raji merupakan continous cell line yang berasal dari sel β – limfoma manusia. Dikenalkan pada tahun 1964 yang diturunkan dari penyakit Limfoma Burkitt yang diderita oleh seorang anak laki – laki berusia 11 tahun. Penyakit ini dihubungkan dengan infeksi oleh virus Epstein Barr yaitu virus DNA yang menimbulkan ploriferasi pada sel – sel β normal. Protein virus ini menginaktivasi p53 sehingga dapat meningkatkan proliferasi karena DNA yang rusak tetap

(30)

mengalami pembelahan secara berkelanjutan (King, 2000). Bentuk morfologi dari sel Raji berupa sel tunggal berbentuk lingkaran yang terkadang dalam bentuk berkelompok. Sifat yang dimiliki sel raji adalah tidak melekat pada dinding atau dasar sumuran namun melayang di dalam cairan media (Anonim, 2007c).

E. Sitotoksisitas

Sitotoksisitas dapat didefinisikan sebagai sifat beracun suatu senyawa terhadap sel hidup. Uji sitotoksisitas dapat dilakukan secara invitro menggunakan kultur sel di dalam mengevaluasi keamanan obat, makanan, kosmetik maupun bahan – bahan kimia yang lain (Freshney, 1986).

Penggunaan haemocytometer sangat umum dan sering dipakai dalam penghitungan sel karena efisien dan akurat. Suatu chamber hitung yang kaku berbentuk kotak dan memiliki kedalaman 0,1 mm digunakan sebagai media bantu dalam penghitungan sel. Pada saat chamber telah terisi dengan suspensi sel, dapat dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dan sel dihitung pada sejumlah bilik yang dipilih pada haemocytometer. Dari perhitungan yang dilakukan, dapat ditentukan jumlah sel per ml dari suspensi sel tersebut. Untuk mengetahui sel yang hidup maupun yang mati dapat digunakan zat penanda seperti trypan blue. Pada metode ini perlu diperhatikan pada saat pengisian suspensi sel ke dalam chamber pada haemocytometer agar tidak terjadi gelembung yang dapat

menyebabkan terjadinya kesalahan dalam perhitungan sel. Kondisi lain yang menentukan keakuratan dalam perhitungan sel adalah kebersihan bilik hitung yang digunakan dan ketepatan dalam pengisian suspensi sel ke dalam chamber (Doyle and Griffiths, 2000).

(31)

F. Landasan Teori

Efek flavonoid terhadap macam – macam organisme sangat banyak macamnya, hal ini mengakibatkan tumbuhan yang mengandung flavonoid banyak dipakai dalam pengobatan tradisional. Flavonoid telah menunjukkan perannya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik, dan aktivitas vasodilatator. Potensi antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk mencegah kerusakan oksidatif pada pengendalian sejumlah penyakit (Miller, 1999). Selain itu juga diketahui bahwa terdapat senyawa flavonoid mampu menghambat DNA polimerase Tiga senyawa flavonoid alam telah diisolasi menggunakan etil asetat, yang berasal dari fraksinasi S. feruginosa, yaitu kuersetin, kuersetrin, dan flavonol glikosida 4-O-asetil kuersetrin memiliki daya sitotoksik pada kultur jaringan kanker glioblastoma manusia (Miller, 1999).

Pada umumnya alkaloid merupakan senyawa yang tidak berwarna, kelarutannya sangat bervariasi tergantung struktur dan bentuknya dalam tumbuhan (Roberts, 1998). Beberapa alkaloid telah diketahui memiliki aktivitas antikanker melalui interaksi dengan target seperti RNA polimerase dan DNA topoisomerase (Sukardiman, 2003). Senyawa alkaloid yang terkandung di dalam tanaman seperti senyawa vinkristin dan vinblastin dapat menghambat RNA polimerase, vinblastin berperan dalam penghambatan pembelahan sel yaitu pada tahap metafase. Ekstraksi dari senyawa alkaloid dalam tanaman dapat dilakukan dengan menggunakan pelarut etanol atau etil asetat melalui metode ekstraksi yang sesuai (Roberts, 1998).

(32)

G. Hipotesis

Ekstrak etanolik daun sirih merah mempunyai efek sitotoksik terhadap kultur sel Raji.

(33)

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan penelitian

Penelitian mengenai uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap kultur sel Raji ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel

a. Variabel Bebas

Konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yaitu 250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml.

b. Variabel Tergantung

Persentase kematian sel Raji. c. Variabel Pengacau Terkendali

i. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun sirih merah dikendalikan dengan memanen daun sirih merah pada tempat dan waktu yang sama.

ii. Medium tumbuh sel Raji dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640-serum.

2. Definisi Operasional

a. Sitotoksisitas ialah sifat toksik atau beracun dari ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel Raji.

(34)

b. LC50 ialah konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang mampu

membunuh atau dapat menyebabkan kematian sejumlah 50% sel uji (sel Raji) dan dinyatakan dalam µg/ml.

c. Ekstrak etanolik daun sirih merah adalah ekstrak yang diperoleh dengan cara mengekstraksi daun sirih merah secara maserasi dengan penyari etanol 70%.

C. Alat dan Bahan

1. Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat - alat gelas, timbangan analitik (Mettler Toledo), alumunium foil, tabung conical (Nunc), autoklaf, tissue culture flask (Nunc), swing rotor centrifuge, inkubator (inco 2 memmert), mikropipet, lemari pendingin (Sharp), cell counter (togoshiseiki), 96-well plate (Nunc), laminar air flow (Labconco), inverted microscope (Olympus IMT-2), mikroskop (Olympus), haemocytometer (Neubauer

Improved), tissue, glove, masker, waterbath, yellow tip, blue tip, effendorf, blender, oven, ayakan.

2. Bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah : a. Daun sirih merah

b. Kultur sel Raji yang diambil dari stok Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT) Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

c. Etanol 70% (bahan penyari daun sirih merah) d. Dimethyl Sulfoxide (DMSO), Sigma

(35)

e. Trypan blue f. Aquabidest

g. Media pencuci: RPMI 1640 (Gibco), natrium bikarbonat, Hepes

h. Media penumbuh: RPMI 1640 (Gibco), FBS (Foetal Bovine Serum) 10%(Gibco), Penisilin Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco).

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi Tanaman

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sirih merah yang telah dideterminasi di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta menggunakan acuan baku Backer dan Brink (1965).

2. Pengumpulan Daun Sirih Merah

Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian diambil dari daerah Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Propinsi Jawa Tengah.

3. Pembuatan Serbuk Daun Sirih Merah

Daun sirih merah segar dicuci menggunakan air mengalir dan ditiriskan sehingga sisa air menghilang. Untuk proses pengeringan digunakan oven pada suhu 60 – 70 °C. Hasil pengeringan diserbuk menggunakan blender dan diayak dengan pengayak 0,75 mm. Serbuk yang diperoleh disimpan dalam botol berwarna coklat.

(36)

4. Sterilisasi Alat

Alat – alat yang akan digunakan dicuci bersih menggunakan deterjen, dibilas menggunakan air mengalir dan dikeringkan. Masing – masing dibungkus menggunakan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121°C dengan tekanan 2,05 abs bar (Hagman, 2005).

5. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

Serbuk kering daun sirih merah ditimbang sebanyak 100 gram kemudian dimaserasi menggunakan 700 ml larutan penyari etanol 70%. Kemudian ditutup dan dibiarkan selama 24 jam terlindung dari cahaya matahari. Setelah 24 jam sari diserkai, disaring, ampas diperas. Ampas yang diperoleh kemudian ditambah cairan penyari secukupnya, diaduk dan diserkai sehingga diperoleh seluruh sari sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk dan terlindung dari cahaya, rendaman harus dikocok berulang-ulang (kira-kira 3x sehari). Setelah 2 hari maserat disaring dengan kertas saring kemudian ditampung. Maserat yang terkumpul kemudian dipekatkan di atas waterbath dengan suhu 60-65oC dibantu dengan kipas angin hingga diperoleh ekstrak kental.

6. Pembuatan larutan uji

Ekstrak etanolik daun sirih merah ditimbang sebanyak 0,1 g, dilarutkan dengan DMSO dan diaduk sampai homogen untuk mendapatkan sediaan ekstrak induk dengan konsentrasi 100 mg/ml. Dari sediaan ekstrak induk tersebut, dibuat sediaan uji, dengan konsentrasi sebesar 250 µg/ml, 500 µg/ml, 750 µg/ml, 1000 µg/ml, 1250 µg/ml, 1500 µg/ml, 1750 µg/ml, dan 2000 µg/ml.

(37)

7. Pembuatan Medium Pencuci dan Medium Penumbuh a. Pembuatan medium pencuci

RPMI 1640 dilarutkan dalam aquabidest kurang lebih 80 ml, ditambahkan 2,3 gram natrium bikarbonat dan 2 gram Hepes, diencerkan sampai diperoleh volume 100 ml, pH dibuat 7,2 dan larutan disterilkan dengan menggunakan filter berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4 °C (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

b. Pembuatan medium penumbuh (RPMI 1640-serum)

Dibuat suatu campuran antara 10 ml FBS (Foetal Bovine Serum), 2 ml penisilin – streptomisin dan 0,5 ml fungison, ditambahkan RPMI 1640 sehingga diperoleh volume 100 ml. Larutan disterilkan dengan menggunakan filter berdiameter 0,22 µm. Medium disimpan dalam almari es pada suhu 4 °C (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989).

8. Preparasi Kultur Sel Raji a. Propagasi Sel Raji

Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian segera dicairkan dalam penangas air 37°C, kemudian ampul disemprot dengan etanol 70%. Ampul dibuka dan sel Raji dipindahkan dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi selama 5 menit, supernatan dibuang, diganti dengan medium RPMI yang baru, kemudian disuspensikan perlahan. Suspensi sel lalu disentrifugasi kembali selama 5 menit kemudian dicuci ulang sekali lagi. Supernatan dibuang, pelet ditambahkan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 10% FBS. Resuspensikan secara perlahan

(38)

sampai homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasikan dalam inkubator dengan suhu 37°C dengan aliran 5% CO2 dari

udara. Setelah 24 jam, medium penumbuh diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.

b. Panen Sel Raji

Setelah jumlah sel cukup, media diganti dengan RPMI 1640 baru sebanyak 5 ml kemudian sel diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril dan ditambahkan medium RPMI sampai volume 10 ml dan disentrifugasi 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensikan perlahan dengan 1 ml medium. Sel kemudian dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 3,0x104/100 µl.

9. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah dengan Menggunakan Metode Direct Counting

Untuk uji sitotoksisitas, sebanyak 100 µl suspensi sel Raji dengan kepadatan 3,0x104/100 µl dimasukkan dalam sumuran-sumuran 96-well plate kemudian diberikan 100 µl ekstrak etanolik daun sirih merah dengan kadar

250; 500; 750; 1000; 1250; 1500; 1750; 2000 µg/ml pada masing – masing sumuran. Sebagai kontrol, digunakan 200 μl suspensi sel dalam media penumbuh.

Selanjutnya 96-well plate diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37°C, dalam inkubator dengan aliran CO2 5% dari udara. Pada akhir masa inkubasi, tiap

(39)

dimasukkan dalam haemocytometer, diletakkan di bawah mikroskop kemudian dihitung jumlah sel hidup dan mati menggunakan cell counter.

E. Analisis Hasil

Prosentase kematian sel hasil perlakuan dihitung menggunakan rumus sebagai berikut : % Kematian sel = 100%

A × Β − Α

Keterangan : A = Jumlah sel hidup pada sumuran kontrol media

B = Jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan Distribusi data diuji menggunakan Kolmogorov-Smirnov. Untuk mengetahui perbedaan antara kontrol dan perlakuan digunakan one-way Anova dengan taraf kepercayaan 95%. Nilai LC50 dihitung dengan menggunakan analisis probit.

(40)

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Determinasi Tanaman

Tujuan dari determinasi ini adalah untuk memberikan kepastian terhadap kebenaran tanaman yang hendak diuji yaitu sirih merah, sehingga menghindari kekeliruan penggunaan bahan dengan tanaman lain. Determinasi dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta menggunakan acuan baku Backer dan Brink (1965). Hasil yang didapatkan dari determinasi menyatakan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav).

B. Pengumpulan Daun Sirih Merah

Pada penelitian ini digunakan daun sirih merah yang diambil dari daerah Desa Mantenan, Kecamatan Mertoyudan, Kabupaten Magelang, Propinsi Jawa Tengah, pada bulan September 2007. Pemanenan dilakukan pada tanaman di tempat dan waktu yang sama, hal ini dimaksudkan untuk penyeragaman kandungan kimia atau meminimalkan variasi kandungan kimia. Daun sirih merah dipilih pada keadaan tidak terlalu tua dan tidak terlalu muda yaitu pada tanaman yang berumur 4 bulan dan daunnya berumur 1 bulan, dengan tujuan mendapatkan kandungan senyawa yang optimal. Untuk menjaga kualitas daun yang dipakai maka dipilih daun yang tebal, segar dan berwarna terang kemudian dicuci di bawah air mengalir untuk memastikan daun sirih merah bersih dari kotoran seperti debu dan serangga yang menempel.

(41)

C. Pembuatan Serbuk Daun Sirih Merah

Hasil pencucian daun sirih merah kemudian ditiriskan dan dikeringkan menggunakan oven pada suhu 60 – 70 °C sehingga kadar air yang terkandung dalam simplisia berkurang, dengan demikian reaksi enzimatis dan tumbuhnya mikroorganisme dapat diminimalkan. Dipilih pengeringan menggunaan oven karena memiliki keuntungan dibandingkan dengan pengeringan menggunakan sinar matahari yaitu tidak tergantung cuaca serta suhu yang digunakan dapat ditentukan selain itu waktu yang dibutuhkan relatif lebih singkat. Penyerbukan dilakukan untuk memperkecil ukuran partikel dari daun sirih merah. Dalam bentuk serbuk, luas permukaan partikel yang dapat kontak langsung dengan cairan penyari menjadi lebih besar sehingga kandungan kimia yang terkandung dapat tersari secara maksimal. Untuk memperoleh derajat halus yang optimal digunakan ayakan 0,75 mm. Derajat halus perlu diperhatikan karena jika digunakan nomor mesh yang terlalu besar ukuran serbuk yang dihasilkan akan semakin kecil dan cenderung menggumpal sehingga cairan penyari akan sulit untuk masuk diantara serbuk, sedangkan nomor mesh yang terlalu kecil akan menghasilkan ukuran serbuk yang besar dan memperkecil luas permukaan partikel yang akan kontak dengan cairan penyari.

D. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

Dalam pembuatan ekstrak etanolik daun sirih merah, pada penelitian ini digunakan etanol sebagai cairan penyari. Pemilihan etanol sebagai cairan penyari didasarkan pada kandungan senyawa di dalam daun sirih merah yaitu flavonoid, alkaloid, polifenolat, minyak atsiri dan tanin yang dapat larut ke dalam etanol.

(42)

Keuntungan lain dari penggunaan etanol adalah mikroorganisme sulit tumbuh sehingga terjadinya kontaminasi dapat dicegah selain itu panas yang diperlukan pada proses pemekatan ekstrak lebih sedikit.

Maserasi dipilih sebagai metode pembuatan ekstrak daun sirih merah karena prosesnya yang sederhana sehingga mudah dilakukan dan cepat. Pada proses ekstraksi dengan metode maserasi tidak digunakan panas, hal ini sangat menguntungkan karena dapat menghindari penguapan minyak atsiri dan kerusakan senyawa tidak tahan panas yang terkandung pada daun sirih merah. Untuk menghindari penguapan baik senyawa yang mudah menguap seperti minyak atsiri maupun cairan penyari maka digunakan bejana tertutup. Keadaan tertutup juga dimaksudkan agar tidak terjadi kontaminasi dari luar serta pencegahan reaksi oksidasi karena ekstrak mengalami kontak dengan oksigen yang terkandung di udara.

Pada saat terjadi kontak antara cairan penyari dan serbuk simplisia maka cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar sel sehingga larutan yang terpekat akan didesak keluar. Proses maserasi dihentikan pada saat terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di luar sel dan di dalam sel. Proses pengocokan selama maserasi dimaksudkan agar cairan penyari dapat masuk pada bagian dalam serbuk simplisia sehingga semua bagian serbuk dapat tersari.

(43)

E. Sterilisasi Alat

Proses diawali dengan pencucian menggunakan deterjen dan dibilas di bawah air mengalir agar pengotor dan kontaminan (sebagai contoh adalah debu dan sisa – sisa bahan kimia) yang menempel pada alat – alat yang akan digunakan dalam penelitian dapat dihilangkan sehingga tidak mengganggu proses dan hasil penelitian. Sterilisasi dilakukan menggunakan autoklaf dengan prinsip penetrasi uap air panas ke dalam sel mikroorganisme. Keadaan ini mengakibatkan terjadinya koagulasi dan denaturasi protein mikroorganisme yang pada akhirnya mengakibatkan kematian mikroorganisme. Metode ini menguntungkan karena proses sterilisasi yang dilakukan relatif cepat, mempunyai daya tembus dan menghasilkan kelembapan yang tinggi.

F. Pembuatan Medium Pencuci dan Penumbuh

Medium pencuci yang digunakan dalam penelitian ini adalah RPMI 1640 yang kemudian ditambahkan bahan buffer yaitu natrium bikarbonat dan hepes. Untuk medium penumbuh sel Raji digunakan complete medium atau disebut dengan RPMI 1640 – serum. Komposisi dari medium ini antara lain FBS (Foetal Bovine Serum) yang merupakan serum berisi kandungan nutrisi yang diperlukan

dalam pertumbuhan sel, penisilin – streptomisin sebagai antibiotik berfungsi mencegah tumbuhnya bakteri dan fungison sebagai antifungi untuk mencegah pertumbuhan jamur. Bentuk sterilisasi yang dilakukan pada pembuatan medium pencuci dan medium penumbuh adalah filtrasi dengan menggunakan suatu membran filter berdiameter 0,22 μm. Penggunaan diameter pori membran yang berukuran kecil bertujuan agar dapat menyaring virus, bakteri dan fungi yang

(44)

mungkin mengkontaminasi selama proses pembuatan medium berlangsung. Dengan suatu sistem yang terkendali maka pertumbuhan sel dapat dikontrol sehingga permasalahan seperti kematian sel dan kontaminasi dapat dihindari.

G. Preparasi Kultur Sel Raji

Proses preparasi meliputi propagasi dan pemanenan sel Raji. Propagasi dilakukan dengan mengambil sel Raji dari tangki nitrogen cair dalam keadaan beku sehingga tidak merubah kondisi sel dari bentuk aslinya. Sesaat setelah pencairan, ampul disemprot dengan etanol sehingga kontaminasi dari luar dapat dicegah. Pencucian sel dilakukan dengan memindahkan sel Raji ke dalam medium RPMI kemudian disentrifugasi, proses ini dilakukan berulang untuk menyesuaikan sel Raji terhadap medium penumbuh. Sel Raji ditumbuhkan dengan medium penumbuh dalam inkubator pada suhu 37 °C untuk mengkondisikan seperti keadaan sel di dalam tubuh manusia.

Pemanenan sel Raji dilakukan pada saat keadaan konfluen tercapai, yaitu kondisi dimana populasi sel menempati seluruh atau hampir seluruh permukaan medium penumbuh. Untuk memastikan keadaan sel maka dilakukan pengamatan di bawah mikroskop inversi terhadap sel Raji yang telah diresuspensi. Dari hasil pengamatan sel menggunakan mikroskop inversi menunjukkan penampakan morfologi sel Raji berupa sel berbentuk lingkaran, terdapat sel yang tunggal maupun menggerombol, tidak melekat pada dinding flask dan melayang pada medium penumbuh. Sel Raji kemudian ditempatkan dalam medium RPMI yang baru dan diresuspensikan menggunakan pipet pasteur sehingga sel terlepas antara satu dengan yang lain. Sentrifugasi sel dilakukan untuk membantu proses

(45)

pemisahan antar sel dan memperoleh pelet sel yang terpisah dari medium. Pelet sel yang diperoleh disuspensikan kedalam medium penumbuh untuk selanjutnya dihitung konsentrasi sel pada suspensi menggunakan haemocytometer.

H. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

Pengujian sitotoksisitas dalam penelitian ini tidak menggunakan metode MTT karena ekstrak etanolik daun sirih merah berwarna coklat tua yang ikut memberikan serapan sehingga dapat mempengaruhi hasil pengukuran absorbansi menggunakan ELISA reader. Metode uji sitotoksisitas yang dipilih adalah menggunakan metode direct counting yaitu perhitungan sel secara langsung di bawah mikroskop dengan menggunakan bantuan haemocytometer. Sebagai penanda untuk membedakan sel yang hidup dan sel yang mati digunakan trypan blue. Zat penanda ini hanya dapat menembus masuk membran sel yang mati

karena pada sel yang telah mati membran sel akan kehilangan integritasnya sehingga dapat ditembus dan sel berwarna biru tua. Pada saat suspensi sel diberikan trypan blue, sel yang hidup akan tetap kecil, bulat dan bersinar hal ini dikarenakan sel yang hidup masih terdapat sitoplasma secara utuh.

i

ii

Gambar 1. Sel Raji yang hidup pada kontrol (i) dan sel Raji yang mati dengan pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah konsentrasi 2000 µg/ml (ii) setelah pemberian trypan blue,

(46)

Dibuat berbagai konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah untuk melihat respon yang diberikan terhadap kematian sel uji. Pada penelitian ini digunakan delapan seri konsentrasi ekstrak yaitu 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 dan 2000 µg/ml. Metode direct counting memiliki subyektifitas tinggi oleh karenanya perhitungan sel dilakukan dengan penetapan sebanyak tiga kali.

Tabel II. Hasil Perhitungan Sel Raji Secara Direct Counting pada perlakuan masing – masing konsentrasi ekstrak etanolik

daun sirih merah setelah inkubasi 24 jam

Penetapan I II III Konsentrasi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (µg/ml) Sel Hidup Sel Mati Sel Hidup Sel Mati Sel Hidup Sel Mati 250 45 15 46 15 46 15 500 34 20 36 19 36 20 750 25 25 25 25 25 25 1000 17 30 18 31 18 31 1250 9 37 10 37 11 36 1500 5 40 6 40 5 40 1750 - 43 - 43 - 43 2000 - 42 - 43 - 42

Kultur sel Raji yang hidup berbentuk hampir bulat sempurna dan bersinar. Sedangkan pada kultur sel Raji yang mati tampak kusam.

i

ii

Gambar 2. Sel raji yang mati seluruhnya pada pemberian ekstrak dengan konsentrasi 2000 µg/ml (a) ; sel raji hidup (i) dan mati (ii) pada pemberian ekstrak

(47)

Kontrol yang digunakan berupa sel Raji dalam medium penumbuh tanpa diberikan perlakuan. Fungsi dari kontrol adalah untuk memberikan perbandingkan antara sel yang diberikan perlakuan dengan kondisi sel tanpa adanya perlakuan.

Gambar 3. Kontrol Pada Perbesaran 100x, tidak terdapat kematian sel Raji

Hasil penelitian menunjukkan semakin besar konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah yang diberikan maka semakin besar jumlah kematian sel uji. Konsentrasi terendah dari ekstrak telah dapat menimbulkan kematian dari sel Raji dan pada konsentrasi tertinggi mengakibatkan kematian seluruh sel Raji.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250

konsentrasi kadar ekstrak etanolik daun sirih merah (µg/ml) kem at ian sel ( % ) penetapan 1 penetapan 2 penetapan 3

Gambar 4. Grafik pengaruh konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap persentase kematian sel Raji

(48)

Melalui jumlah sel yang diperoleh dari metode direct counting dapat dilakukan perhitungan terhadap persentase kematian sel Raji. Berdasarkan pada persentase kematian sel maka dapat diketahui harga probit pada masing – masing konsentrasi ekstrak.

Tabel III. Persentase kematian sel Raji dan harga probit setelah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah dan inkubasi 24 jam

Penetapan I II III Konsentrasi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (µg/ml) Kematian Sel (%) Harga Probit Kematian Sel (%) Harga Probit Kematian Sel (%) Harga Probit 250 40,53 4,77 39,21 4,72 39,21 4,72 500 55,07 5,13 52,42 5,05 52,42 5,05 750 66,96 5,52 66,96 5,44 66,96 5,44 1000 77,53 5,77 76,21 5,71 76,21 5,71 1250 88,11 6,18 86,78 6,13 85,46 6,04 1500 93,39 6,48 92,07 6,41 93,39 6,48 1750 100,00 - 100,00 - 100,00 - 2000 100,00 - 100,00 - 100,00 - Untuk mengetahui efek sitotoksisitas dari ekstrak etanolik daun sirih merah maka dilakukan analisis statistik Anova satu arah. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui apakah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah dalam berbagai konsentrasi pada sel raji, memiliki perbedaan bermakna terhadap kontrol. Salah satu syarat yang harus dipenuhi dalam analisis menggunakan Anova satu arah adalah distribusi data yang diuji adalah normal. Pengujian distribusi data digunakan metode Kolmogorov-Smirnov. Hasil uji menunjukkan data yang diperoleh dalam penelitian ini memiliki distribusi normal. Dari uji Anova satu arah dengan taraf kepercayaan 95% diketahui bahwa persentase kematian sel pada

(49)

kelompok perlakuan berbeda bermakna dengan kontrol, dengan demikian ekstrak etanolik daun sirih merah memiliki efek sitotoksik terhadap sel Raji.

Potensi sitotoksisitas dari ekstrak digambarkan melalui LC50. Harga LC50

ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji dihitung menggunakan analisis probit yang merupakan analisis regresi antara log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit dari persentase kematian sel Raji setelah perlakuan pada masing - masing konsentrasi ekstrak.

Gambar 5. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan I

Untuk penetapan I diperoleh hubungan yang linier (r hitung > r tabel) antara

log konsentrasi ekstrak terhadap nilai probit dari persentase kematian sel Raji setelah perlakuan dan inkubasi 24 jam. Pada perhitungan diperoleh nilai r sebesar 0,971 sedangkan nilai r pada tabel untuk taraf kepercayaan 95% adalah 0,811.

(50)

Gambar 6. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan II

Pada penetapan II diperoleh hubungan yang linier (r hitung > r tabel) antara

log konsentrasi ekstrak terhadap nilai probit dari persentase kematian sel Raji. Dari perhitungan diperoleh nilai r sebesar 0,968 sedangkan nilai r pada tabel untuk taraf kepercayaan 95% adalah 0,811.

Gambar 7. Grafik hubungan log konsentrasi ekstrak terhadap harga probit pada penetapan III

(51)

Pada penetapan III juga diperoleh hubungan yang linier (r hitung > r tabel)

antara log konsentrasi ekstrak terhadap nilai probit dari persentase kematian sel Raji. Untuk perhitungan diperoleh nilai r sebesar 0,962 sedangkan nilai r pada tabel untuk taraf kepercayaan 95% adalah 0,811.

Melalui analisis probit yang dilakukan pada tiap penetapan maka didapatkan harga LC50 ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap sel Raji sebesar

395,5 µg/ml. Menurut NCI (National Cancer Institute) suatu bahan dapat dikatakan berpotensi sitotoksik apabila memiliki nilai LC50 < 1000 µg/ml, dengan

demikian ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap sel Raji dan berpotensi untuk dikembangkan lebih lanjut.

Ekstrak etanolik daun sirih merah juga memberikan efek sitotoksik terhadap kultur sel kanker yang lain seperti pada sel SiHa yaitu sel kanker serviks dengan nilai LC50 sebesar 200,6 µg/ml (Nur’aniyah, 2008), terhadap kultur sel

Mieloma yaitu sel kanker sumsum tulang dengan nilai LC50 sebesar 434,1 µg/ml

(Meri, 2008), terhadap kultur sel T47D yaitu sel kanker payudara dengan nilai LC50 sebesar 587,7 µg/ml (Neritika, 2008) dan terhadap kultur sel Hela yaitu sel

kanker serviks dengan nilai LC50 yang dihasilkan sebesar 1143,1 µg/ml

(Atmaningsih, 2008). Perbedaan nilai LC50 pada masing – masing sel kanker

dikarenakan perbedaan karakteristik dari sel. Selain itu dimungkinkan terdapat perbedaan reseptor pada masing – masing sel yang dapat berikatan dengan senyawa yang bersifat sitotoksik dari ekstrak etanolik daun sirih merah.

(52)

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat ditarik dari penelitian ini adalah ekstrak etanolik daun sirih merah bersifat sitotoksik terhadap kultur sel Raji dengan harga LC50

sebesar 395,5 µg/ml.

B. Saran

Saran yang dapat dikemukakan dari penelitian ini adalah :

1. Perlu dilakukan uji sitotoksisitas ekstrak etanolik daun sirih merah terhadap kultur sel normal.

2. Dilakukan pengujian sitotoksisitas terhadap fraksi dari daun sirih merah.

(53)

DAFTAR PUSTAKA

Adamo, D., 2006, Diet Sehat Golongan Darah untuk Mencegah dan Mengobati Kanker, 26-27, PT Bhuana Ilmu Populer Kelompok Gramedia, Jakarta

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 17, 25-26, Direktorat POM, Jakarta

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, edisi IV, 7, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta

Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, cetakan pertama, 1 – 38, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta Anonim, 2007a, Piper ornatum,

http://toptropicals.com/catalog/uid/Piper_ornatum.htm, diakses tanggal 10 Mei 2008

Anonim, 2007b, Kanker, http://id.wikipedia.org/wiki/Kanker diakses tanggal 7 September 2007

Anonim, 2007c, Position Statement of the ZKBS on Risk Assessment of the Recipient Cell Lines COS, 239 and Raji, BVL, http://www.bvl.bund.de/nn_1115098/EN/06__Genetic__Engineering/ZK BS/01__Allg__Stellungnahmen/05__zellbiologischeThemen/COS-293-Raji.html diakses tanggal 10 September 2007

Atmaningsih, F. R., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Hela, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Backer, C. A., and Backuizen van den Brink, R. C.,1965, Flora of Java, Volume I dan II, N. V. Noordhoff, Graningen

Dalimartha, S., 2006, Ramuan Obat Tradisional untuk Pengobatan Kanker, 1, 5, 7, Penebar Swadaya, Jakarta

De Muth, J.E., 1999, Basic Statistics and Pharmaceutical Statistical Applications, 585, Marcel Dekker, Inc., New York

Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture for Medical Research, 12 -16, 47-50, 402 – 415 John Willey and Sons Ltd, New York

Freshney, R.I., 1986, Animal Cell Culture A Practical Approach, 1st Edition, 71-73, IRL Press, Washington DC

(54)

Freshney, R.I., 2000, Culture of Animal Cells, A manual of Basic Technique, 4th Edition, 71-73, 309 – 312, 337 – 339, A John Wiley & Sons Inc, New York

Hagman, D.E., 2005, Sterilization, th, Beringer, Paul., Remington The Science and Practice of Pharmacy, 21th edition, 776 – 781, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.

Jacoby, W.B., and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York.

King, R.J.B., 2000, Cancer Biology, 2ndedition, 79 – 80, School of Biological Sciences, University of Surrey, England

Meri, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel Mieloma, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Miller, R. E., Rausher, M. D., and Manos, P. S., 1999, Phylogenetic systematics of Ipomoea (Convolvulaceae) based on ITS and waxy sequences, Syst Bot, 24:209-227

Mursyidi, A., 1985, Statistika Farmasi Dan Biologi, 157, Ghalia Indonesia,Jakarta

Mutschler, E., 1999, Dinamika Obat, Edisi 5, 701 – 702, Penerbit ITB, Bandung Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Imunosupresan, Farmakologi dan Terapi, 687 –

689, Fakultas Kedokteran UI, Jakarta

Neritika, Kartina., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel T47D, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Nur’aniyah, 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav) terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta

Roberts, F.M., and Wink, M., 1998, Alkaloid: Biochemistry, Ecology and Medicinal Aplications, 312 – 314, Plenum Press, New York

Sambrook, Fritsch, E.F., and Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press.

(55)

Schneider, 1997, Cancer Genetics, Encyclopedia of Human Biology, 2nd ed., Academic Press, New York

Sofyan, R., 2000, Terapi Kanker Pada Tingkat Molekuler, Cermin Dunia Kedokteran, No. 127, 5 - 10

Sudewo, B., 2006, Basmi Penyakit Dengan Sirih Merah, 22, 35 – 36, 40 – 45, 66 – 71, Agromedia Pustaka, Yogyakarta

Sukardiman., Hadi P., dan Aty W., 2003, Penapisan Antikanker dari Tanaman Obat Indonesia dengan Molekul Target Enzim DNA Topoisomerase, Majalah Farmasi Airlangga, Vol.III, No.3, 93 – 95

Tambunan, G.W., 2003, Diagnosis dan Tatalaksana Sepuluh Jenis Kanker Terbanyak di Indonesia, 67 – 84, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta

Voigt, Rudolf., 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, 551, 565 – 566, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Wolf, J.B., 2007, Tissue Culture Methods, http://www.unej.ac.id/fakultas/mipa/vol13,no2/amrun.pdf#search=%22k

(56)

Lampiran 1. Hasil Determinasi

(57)

Lampiran 2. Peralatan dan Bahan yang Digunakan dalam Penelitian

Gambar 8. Tanaman Sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)

Gambar 9. 96 well Plate dan conical steril

(58)

Gambar 11. Laminar air flow

Gambar 12. Haemocytometer dan cell counter

(59)

Lampiran 3. Sel Raji setelah pemberian ekstrak etanolik daun sirih merah pada inkubasi 24 jam dengan perbesaran 100x

Gambar 14. Sel raji yang mati dengan pemberian kadar ekstrak 1750 µg/ml

i

ii

Gambar 15. Sel raji yang hidup (i) dan mati (ii) dengan kadar ekstrak 1500 µg/ml

ii i

(60)

ii

i

ii i

i ii

(61)

Lampiran 4. Tabel Probit

Tabel IV. Harga Probit Sesuai dengan Prosentasenya

Probit Prosentase 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 - 2,67 2,95 3,12 3,25 3,36 3,45 3,52 3,59 3,66 10 3,72 3.77 3,82 3,87 3,92 3,96 4,01 4,05 4,08 4,12 20 4,16 4,19 4,23 4,26 4,29 4,33 4,36 4,39 4,42 4,45 30 4,48 4,50 4,53 4,56 4,59 4,61 4,64 4,67 4,39 4,72 ss40 4,75 4,77 4,80 4,82 4,85 4,87 4,90 4,92 4,95 4,97 50 5,00 5,03 5,05 5,08 5,10 5,13 5,15 5,18 5,20 5,23 60 5,25 5,28 5,31 5,33 5,36 5,39 5,41 5,44 5,47 5,50 70 5,52 5,55 5,58 5,61 5,64 5,67 5,71 5,74 5,77 5,81 80 5,34 5,88 5,92 5,95 5,99 6,04 6,08 6,13 6,18 6,23 90 6,28 6,34 6,41 6,48 6,55 6,64 6,75 6,88 7,05 7,33 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 99 7,33 7,37 7,41 7,51 7,51 7,58 7,65 7,75 7,88 8,09 (Mursyidi,1985)

(62)

Lampiran 5. Perhitungan LC50 Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah terhadap

Sel Raji Menggunakan Analisis Probit

Kontrol Sel Raji Penetapan I II III 75 76 76 Jumlah sel = 10 200 4× × x

Keterangan: x = jumlah sel hasil perhitungan langsung pada haemocytometer 4 = jumlah bilik dalam haemocytometer

10 = jumlah volume yang masuk dalam bilik haemocytometer (µl) 200 = jumlah volume total (µl)

Penetapan I = 10 200 4 75_× _× = 37.500 Penetapan II = 10 200 4 76_× _× = 38.000 Penetapan III = 10 200 4 76_× _× _{= 38.000}

Rata – rata kontrol =

3 000 . 38 000 . 38 500 . 37 + + = 37.833 Konsentrasi sel pada kontrol adalah 37.833/200 µl

PENETAPAN I

Jumlah sel Raji yang hidup/ sumuran : 10 200 4× × x Konsentrasi 250 µg/ml = 10 200 4 45_× _× = 22.500 sel/sumuran Konsentrasi 500 µg/ml = 10 200 4 34_× _× = 17.000 sel/sumuran

(63)

Konsentrasi 750 µg/ml = 10 200 4 25_× _× = 12.500 sel/sumuran Konsentrasi 1000 µg/ml = 10 200 4 17 × × = 8.500 sel/sumuran Konsentrasi 1250 µg/ml = 10 200 4 9_× _× = 4.500 sel/sumuran Konsentrasi 1500 µg/ml = 10 200 4 5_× _× = 2.500 sel/sumuran Konsentrasi 1750 µg/ml = 10 200 4 0_× _× = 0 sel/sumuran Konsentrasi 2000 µg/ml = 10 200 4 0_× _× = 0 sel/sumuran

Persen Kematian Sel Raji = 100% A ×

Β − Α

Keterangan : A = jumlah sel hidup pada sumuran kontrol

B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan Konsentrasi 250 µg/ml = 100% 833 . 37 500 . 22 833 . 37 − _× = 40,53 % Konsentrasi 500 µg/ml = 100% 833 . 37 000 . 17 833 . 37 × − = 55,07 % Konsentrasi 750 µg/ml = 100% 833 . 37 500 . 12 833 . 37 − _× = 66,96 % Konsentrasi 1000 µg/ml = 100% 833 . 37 500 . 8 833 . 37 − _× = 77,53 % Konsentrasi 1250 µg/ml = 100% 833 . 37 500 . 4 833 . 37 × − = 88,11 % Konsentrasi 1500 µg/ml = 100% 833 . 37 500 . 2 833 . 37 − _× = 93,39 % Konsentrasi 1750 µg/ml = 100% 833 . 37 0 833 . 37 − _× = 100,00% Konsentrasi 2000 µg/ml = 100% 833 . 37 0 833 . 37 × − = 100,00%

(64)

Sel No

Konsentrasi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

(µg/ml) Hidup Mati Kematian Sel (%) Harga Probit 1. _{250 45}₁₅_40,53_4,77 2. _{500 34}₂₀_55,07_5,13 3. _{750 25}₂₅_66,96_5,52 4. _{1000 17}₃₀_77,53_5,77 5. _{1250 9}₃₇_88,11_6,18 6. _{1500 5}₄₀_93,39_6,48 7. _{1750 -}₄₃_100,00_- 8. _{2000 -}₄₂_100,00_-

Log konsentrasi ekstrak vs harga probit

Dengan menggunakan regresi linier diperoleh nilai : A = - 0,56218; B = 2,15849

r = 0,97118; n = 6

persamaan yang didapatkan : y = 2,15849x – 0,56218 y= nilai probit 50Æ 5 = 2,15849x – 0,56218 X= 2,57688

PENETAPAN II

Jumlah sel Raji yang hidup/ sumuran : 10 200 4× × x Konsentrasi 250 µg/ml = 10 200 4 46_× _× = 23.000 sel/sumuran Konsentrasi 500 µg/ml = 10 200 4 36 × × = 18.000 sel/sumuran Konsentrasi 750 µg/ml = 10 200 4 25_× _× = 12.500 sel/sumuran

(65)

Konsentrasi 1000 µg/ml = 10 200 4 18_× _× = 9.000 sel/sumuran Konsentrasi 1250 µg/ml = 10 200 4 10 × × = 5.000 sel/sumuran Konsentrasi 1500 µg/ml = 10 200 4 6_× _× = 3.000 sel/sumuran Konsentrasi 1750 µg/ml = 10 200 4 0_× _× = 0 sel/sumuran Konsentrasi 2000 µg/ml = 10 200 4 0_× _× = 0 sel/sumuran

Β − Α

B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan Konsentrasi 250 µg/ml = 100% 833 . 37 000 . 23 833 . 37 × − = 39,21 % Konsentrasi 500 µg/ml = 100% 833 . 37 000 . 18 833 . 37 − _× = 52,42 % Konsentrasi 750 µg/ml = 100% 833 . 37 500 . 12 833 . 37 × − = 66,96% Konsentrasi 1000 µg/ml = 100% 833 . 37 000 . 9 833 . 37 − _× = 76,21 % Konsentrasi 1250 µg/ml = 100% 833 . 37 000 . 5 833 . 37 − _× = 86,78 %

(66)

Konsentrasi 1500 µg/ml = 100% 833 . 37 000 . 3 833 . 37 − _× = 92,07% Konsentrasi 1750 µg/ml = 100% 833 . 37 0 833 . 37 × − = 100,00% Konsentrasi 2000 µg/ml = 100% 833 . 37 0 833 . 37 − _× = 100,0 Sel No Konsentrasi Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah

(µg/ml) Hidup Mati Kematian Sel (%) Harga Probit 1. _{250 46}₁₅_39,21_4,72 2. _{500 36}₁₉_52,42_5,05 3. _{750 25}₂₅_66,96_5,44 4. _{1000 18}₃₁_76,21_5,71 5. _{1250 10}₃₇_86,78_6,13 6. _{1500 6}₄₀_92,07_6,41 7. _{1750 -}₄₃_100,00_- 8. _{2000 -}₄₃_100,00_-

Log konsentrasi ekstrak vs harga probit

Dengan menggunakan regresi linier diperoleh nilai : A = - 0,61283

B = 2,15349 n = 6

r = 0,96826

persamaan yang didapatkan : y = 2,15349x– 0,61283 y= nilai probit 50Æ 5 = 2,15349x– 0,61283

(67)

PENETAPAN III

Jumlah sel Raji yang hidup/ sumuran : 10 200 4× × x Konsentrasi 250 µg/ml = 10 200 4 46_× _× _{= 23.000 sel/sumuran} Konsentrasi 500 µg/ml = 10 200 4 36_× _× = 18.000 sel/sumuran Konsentrasi 750 µg/ml = 10 200 4 25 × × = 12.500 sel/sumuran Konsentrasi 1000 µg/ml = 10 200 4 18_× _× = 9.000 sel/sumuran Konsentrasi 1250 µg/ml = 10 200 4 11_× _× = 5.500 sel/sumuran Konsentrasi 1500 µg/ml = 10 200 4 5 × × = 2.500 sel/sumuran Konsentrasi 1750 µg/ml = 10 200 4 0_× _× = 0 sel/sumuran Konsentrasi 2000 µg/ml = 10 200 4 0_× _× = 0 sel/sumuran

Β − Α

B = jumlah sel hidup pada sumuran yang telah diberi perlakuan Konsentrasi 250 µg/ml = 100% 833 . 37 000 . 23 833 . 37 − _× = 39,21 % Konsentrasi 500 µg/ml = 100% 833 . 37 000 . 18 833 . 37 × − = 52,42 % Konsentrasi 750 µg/ml = 100% 833 . 37 500 . 12 833 . 37 − _× = 66,96% Konsentrasi 1000 µg/ml = 100% 833 . 37 000 . 9 833 . 37 × − = 76,21 % Konsentrasi 1250 µg/ml = 100% 833 . 37 500 . 5 833 . 37 − _× = 85,46 %