TINJAUAN PUSTAKA
Phyllanthus niruri L. (meniran)
Meniran ialah tanaman semak semusim dengan tinggi sekitar 30 sampai 60 cm. Tanaman ini termasuk famili Euphorbiaceae, banyak ditemukan di daerah tropis dan subtropis. Memiliki morfologi tumbuh tegak bercabang, daun tunggal dengan letak berseling, helaian daun bundar telur sampai bundar memanjang dengan ujung tumpul dan pangkal membulat, buahnya berbentuk bulat pipih dan licin dengan biji kecil, keras, berbentuk ginjal, dan berwarna cokelat (Gambar 1).
Gambar 1 Tanaman Phyllanthus niruri L.
Secara turun temurun seluruh bagian tanaman ini telah digunakan sebagai obat. Bagian daun diketahui mengandung senyawa aktif lignan dengan konsentrasi tertinggi (Sharma et al. 1993). Meniran memiliki aktivitas sebagai hepatoprotektor (Syamsundar et al. 1985; Sabir & Rocha 2008), antihepatitis (Shin et al. 2005), dan antioksidan (Harish & Shivanandappa 2006; Sabir & Rocha 2008).
Senyawa aktif yang dikandung meniran meliputi golongan lignan, yaitu phyllantin, hypophyllanthin, phyltetralin, dan niranthin (Row et al. 1966; Sharma et al. 1993; Murugaiyah & Chan 2007a; Murugaiyah & Chan 2007b), alkaloid (Petchnaree et al. 1986), terpenoid (Singh et al. 1989; Gunawan et al. 2008), tanin (Shimizu et al. 1989; Markom et al. 2007), dan glikosida flavanon (Gupta & Bahar Ahmed 1984). Beberapa di antaranya telah dilaporkan memiliki efek farmakologis tertentu (Venkateswaran 1987; Harish & Shivanandappa 2006).
Senyawa phyllanthin dan hipophyllanthin berhasil diekstraksi dari meniran dengan pelarut metanol, etil asetat, dan kloroform (Tripathi et al. 2006; Murugaiyah & Chan 2007b). Ekstraksi senyawa golongan tanin telah dilakukan dengan menggunakan pelarut polar seperti air, etanol, dan metanol (Markom et al. 2007). Pelarut lain yang telah digunakan untuk mengekstraksi senyawa kimia dalam meniran antara lain ialah aseton, diklorometana, dietil eter, dan heksana. Efisiensi ekstraksi masing-masing pelarut secara berurutan ialah sebesar 3,9 %, 4 %, 2,2 %, dan 1,8 % (Markom et al. 2007).
Pemisahan ekstrak meniran telah dilakukan dengan kromatografi menggunakan kolom C18 dan beberapa kombinasi fase gerak. Fase gerak tersebut antara lain asetonitril:air (55:45 v/v) (Murugaiyah & Chan 2007a; Murugaiyah & Chan 2007b), asetonitril:air secara gradien dengan penambahan asam fosfat 0,1 % sebagai aditif (Markom et al. 2007), air:metanol secara gradien (Colombo et al. 2009), metanol:air (70:30) (Tripathi et al. 2006), dan fase gerak metanol:air (66:34) (Sharma et al. 1993).
Sidik Jari Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) memisahkan komponen berdasarkan interaksi komponen dengan fase gerak berupa cairan dan fase diam. Fase gerak mengalir dengan bantuan tekanan. Komponen yang dipisahkan teramati sebagai puncak dengan waktu retensi tertentu, sementara kadar komponen ditunjukkan oleh luas area masing-masing puncak (Harvey 2000; Ahuja & Rasmussen 2007).
Hasil pemisahan KCKT disajikan dalam kromatogram atau sidik jari kromatografi. Parameter yang diukur pada analisis sidik jari KCKT meliputi waktu retensi, resolusi, jumlah puncak, dan luas puncak. Parameter tersebut dipengaruhi oleh beberapa faktor, di antaranya metode ekstraksi, instrumen kromatografi yang digunakan, dan kondisi pemisahan (Liang et al. 2004; Borges et al. 2007a). Salah satu parameter yang banyak digunakan untuk evalusi sidik jari kromatografi ialah jumlah puncak (Borges et al. 2007a; Borges et al. 2007b; Delaroza & Scarminio 2008). Jumlah puncak dihitung berdasarkan banyaknya puncak yang muncul pada kromatogram. Secara teori, puncak kromatografi
dikatakan terpisah apabila memiliki nilai resolusi minimumsama dengan 1 (Dong 2006). Puncak dapat dideteksi jika memiliki nilai rasio sinyal terhadap derau lebih besar sama dengan 3 sementara analisis kuantitatif dapat dilakukan secara presisi dan akurasi terhadap puncak yang memiliki rasio sinyal terhadap derau lebih besar sama dengan 10 (Bliesner 2006).
KCKT secara luas digunakan untuk analisis obat herbal karena teliti, sensitif, dan memiliki ketersalinan yang baik (Xie & Leung 2009). Sidik jari kromatografi obat herbal yang dihasilkan bersifat sangat khas. Sidik jari tersebut merepresentasikan senyawa aktif yang terdapat dalam obat herbal dan interaksi yang terjadi antar komponen aktif maupun antara komponen aktif dengan fase gerak dan fase diam. Sidik jari KCKT di antaranya telah digunakan untuk kontrol kualitas Turnera diffusa (Garza-Juarez et al. 2009), Ginkgo biloba (Ding et al. 2009), Ganoderma lucidum (Chen et al. 2008), Pericarpium Citri Reticulatae dan Pericarpium Citri Reticulatae Viride (Yi et al. 2007), Rheum tanguticum (Jin et al. 2006), dan Angelica sinensis (Lu et al. 2005; Wang et al. 2007).
Metode KCKT yang digunakan untuk memperoleh sidik jari perlu divalidasi untuk memastikan bahwa metode tersebut memberikan kromatogram yang identik untuk sampel yang sama. Mengacu pada United States Pharmacopea, parameter validasi yang dilakukan ialah parameter presisi, sementara parameter lainnya dapat dilakukan ataupun tidak.
Pengoptimuman Pelarut Ekstraksi dan Fase Gerak KCKT dengan Split-Plot Mixture-Mixture Design
Efisiensi ekstraksi dipengaruhi oleh temperatur, pH, waktu ekstraksi, metode ekstraksi, nisbah sampel dengan pelarut, selektivitas pelarut, dan stabilitas solut dalam pelarut tersebut. Keberhasilan ekstraksi dipengaruhi oleh komposisi pelarut ekstraksi (Soares & Scarminio 2008). Dengan demikian, penggunaan komposisi pelarut ekstraksi yang tepat dapat meningkatkan keberhasilan ekstraksi. Mixture design merupakan rancangan komposisi campuran yang dapat digunakan untuk memilih komposisi pelarut ekstraksi yang tepat.
Pengoptimuman kondisi pemisahan KCKT dilakukan untuk memperoleh hasil pemisahan dengan resolusi yang baik, robust, dan cepat. Pengoptimuman dapat dilakukan terhadap fase gerak, fase diam, suhu pemisahan, dan kondisi
deteksi (Heyden et al. 2000). Pengoptimuman fase gerak paling sering dilakukan, kekuatan pelarut dan selektivitas pelarut dapat dijadikan pertimbangan dalam pemilihan fase gerak (Borges et al. 2007a). Rancangan percobaan yang sering digunakan pada pengoptimuman fase gerak KCKT ialah mixture design (Borges et al. 2007a; Borges et al. 2007b; Soares & Scarminio 2008; Delaroza & Scarminio 2008).
Mixture design digunakan saat suatu sistem terdiri atas campuran beberapa komponen yang jumlah totalnya konstan, yaitu 100 %. Respons yang diperoleh merupakan fungsi dari proporsi relatif tiap komponen dalam sistem. Pada Mixture design dapat digunakan 2 komponen atau lebih. Bertambahnya jumlah komponen yang terlibat akan menambah jumlah dimensi ruang yang dipakai untuk menggambarkan mixture. Saat 2 komponen terlibat, maka profil campuran komponen akan mengikuti garis lurus, saat tiga komponen akan berbentuk segitiga, berbentuk tetrahedron saat empat komponen digunakan, dan seterusnya. Objek paling sederhana yang menggambarkan dimensi mixture disebut sebagai simplex.
Saat digunakan tiga komponen, mixture design dapat mengikuti rancangan simplex-lattice, simplex-centroid, maupun simplex-centroid dengan axial design. Contoh sederhana ketiga rancangan tersebut ditunjukkan pada Gambar 2. Pada rancangan campuran berbentuk simplex-lattice titik-titik yang digunakan tersebar di sepanjang sisi simplex. Jika diamati lebih lanjut rancangan ini fokus pada pengaruh komponen tunggal dan kombinasi dua komponen dengan berbagai variasi proporsi terhadap respons yang dihasilkan. Pada rancangan simplex-centroid, selain pengaruh sistem tunggal dan biner dipelajari juga pengaruh kombinasi tiga komponen (pada titik tengah/centroid). Untuk k faktor yang terlibat, jumlah eksperimen ialah 2k-1 buah dan melibatkan kombinasi proporsi 1,
½, sampai 1/k. Pada simplex-centroid dengan axial design, pengaruh kombinasi tiga komponen diperbanyak dengan menambah titik pada daerah axial (Brereton 2005). Saat dua buah mixture design digabungkan, maka rancangan tersebut dikenal sebagai mixture-mixture design. Pada saat kombinasi pelarut ekstraksi dibuat mengikuti simplex-centroid dengan axial design dan fase gerak KCKT
mengikuti simplex-centroid, maka kombinasi mixture-mixture design yang diperoleh disajikan pada Gambar 3.
b (c) (a) (b) X13 X13 X13
Gambar 2 Simplex-lattice (a), simplex-centroid (b), simplex-centroid dengan axial design (c).
Rancangan split-plot banyak digunakan untuk mengatasi kendala teknis berupa jumlah unit percobaan yang terlalu besar. Rancangan ini dapat dilakukan dengan maupun tanpa pengulangan. Pada rancangan split-plot, unit percobaan dibagi menjadi 2, yaitu whole-plot dan sub-plot. Pengacakan dilakukan terhadap whole-plot terlebih dahulu diikuti pengacakan terhadap sub-plot. Hal ini berimplikasi pada berkurangnya unit percobaan dibandingkan unit percobaan pada pengacakan lengkap. Ragam pada rancangan split-plot berasal dari dua sumber, yaitu dari whole-plot ( ) dan sub-plot ( ). Analisis terhadap data dapat dilakukan dengan beberapa pendekatan. Ordinary Least Squares method (metode OLS) dilakukan saat nisbah ragam whole-plot terhadap ragam sub-plot kurang dari 0,4. Persamaan umum yang digunakan untuk mengolah data disajikan pada persamaan (1). Koefisien regresi pada OLS dapat dihitung dengan persamaan (2a) hingga (7a). Koefisien untuk interaksi linear dihitung dengan persamaan (2a), interaksi kuadratik dengan persamaan (3a), interaksi kubik dengan persamaan (4a), interaksi biner-biner menggunakan persamaan (5a), gabungan interaksi ternary-biner menggunakan persamaan (6a), serta interaksi ternary-ternary menggunakan persamaan (7a). Saat nisbah ragam whole-plot terhadap ragam sub-plot lebih dari 0,4 tidak dibenarkan menggunakan OLS, pendekatan yang dapat digunakan ialah Generalized Least Squares (GLS), Restricted Maximum Likelihood (REML), dan Analysis of Varians (ANOVA) (Naes et al. 2006).
(b) (a)
Gambar 3 Mixture-mixture design untuk pelarut ekstraksi (a), mixture design untuk fase gerak KCKT (b).
...(1) ...(2a) ...(2b) ...(3a) ...(3b) ...(4a) ...(4b) ...(5a) ...(5b)
...(6a) ...(6b)
...(7a) ...(7b)
