Bahan dan alat
Alat dan instrumen yang akan digunakan adalah eDAQ Potensiostat – Galvanostat yang dilengkapi perangkat lunak Echem v2.1.0, laminar air flow, inkubator, High Speed Refrigated Centrifuge KUBOTA 6500, Centrifuge 5415 R, autoklaf, Ultrasonic Homogenizer UH-150, DNA/Protein/Enzyme Analyzer
Biospec-1601 Shimadzu, Spektroscopy UV-Pharmaspec 1700 (Shidmazu, Kyoto, Japan), pipet mikro, batang gelas, sel elektrokimia serta alat-alat gelas lainnya. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah enzim SOD murni, sel bakteri
D. radiodurans, nanokomposit zeolit alam dari Bayah, DPPH dan vitamin C, media untuk pertumbuhan bakteri D. radiodurans, grafit, ferosena, parafin cair, dimetil sulfoksida (DMSO), larutan buffer fosfat, membran dialisis, xantina oksidase, xantina, bufer larutan HCl 0.1 M dan kalium ferrisianida (K3Fe(CN)6.
Metode
Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap percobaan yaitu: penumbuhan sel Deinococus radiodurans dan ektraksi SOD, pembuatan elektroda, imobilisasi enzim, optimasi aktivitas SOD dan bakteri terimobilisasi, penentuan parameter kinetika pengukuran kapasitas antioksidan vitamin C dengan metode DPPH dan biosensor. Bagan alir penelitian secara umum dilampirkan pada Lampiran 1.
Penumbuhan sel Deinococcus radiodurans dan ekstraksi enzim SOD
Deinococcus radiodurans ditumbuhkan pada media yang mengandung tripton 1%, yeast extract 0,5%, glukosa 0,2%, NaCl 0,5% dan alkohol, selanjutnya diinkubasi selama 48 jam pada 300C. Selanjutnya sel dipanen dengan sentrifugasi kecepatan 7000 x G, 40C selama 10 menit untuk memisahkan sel bakteri dengan media. Selanjutnya sel (pelet) dicuci beberapa kali dengan larutan buffer posfat pH 7,0 dan disuspensikan kembali dalam larutan bufer fosfat pH 7,0. Suspensi sel di sonikasi dengan pulsa 50% dan output 5 untuk memecahkan sel bakteri yaitu dengan interval 10 x 2 menit dan interval berhenti 1 menit. Selama sonikasi suspensi sel didinginkan dalam penangas es. Selanjutnya
13
disentrifugasi 10000 x G, 40C selama 30 menit untuk memisahkan supernatan dan pelet. Ekstrak kasar (crude extract) enzim berada disupernatan. Ekstrak selanjutnya diukur nilai serapannya pada panjang gelombang 260 nm dan 280nm untuk mengetahui konsentrasi protein dan perbandingan protein terhadap DNA.
Pembuatan elektroda
Pembuatan Elektroda Ag/AgCl
Elektroda yang akan dibuat adalah elektroda Ag/AgCl sebagai elektroda rujukan, elektroda pasta karbon termodifikasi ferosena sebagai elektroda kerja. Elektroda Ag/ AgCl dibuat dengan cara kawat perak dipotong sepanjang 4 cm sebanyak 2 buah. Kawat perak ini ujungnya disambung dengan kawat tembaga yang telah dibentuk sedemikian rupa. Larutan NaCl 3M disiapkan di dalam beaker gelas sebanyak 50ml. Baterai 1,5V sebanyak 2 buah dirangkai seri kemudian di sambung ujung-ujung kutubnya dengan kabel yang ujungnya telah diberi penjepit buaya. Kawat perak dihubungkan pada masing-masing kutub baterei kemudian dicelupkan ke dalam larutan NaCl 3M selama 1,5 menit. Kawat diangkat dan dikeringkan. AgCl akan menempel pada kawat yang dihubungkan pada kutub negatif baterai. Kawat Ag/AgCl akan berwarna hitam keabu-abuan. Elekktroda Ag/AgCl dari hasil elektrolisis selanjutnya disambungkan dengan kawat tembaga dan dimasukkan ke dalam badan elektroda yang terbuat dari kaca, dimana terdapat selubung kuarsa pada ujungnya dan telah diisi larutan KCl 3M.
Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan menggunakan alat Potensiostat E-DAQ. Elektroda kerja yang digunakan adalah emas, elektroda Ag/AgCl sebagai elektroda pembanding, dan platina sebagai elektroda bantu. Karakterisasi elektroda Ag/AgCl dilakukan dengan mengukur Larutan 0.01M K3[Fe(CN)6] dalam 0,1 M KCl alam sel elektrokimia. Ketiga elektroda dipasang
pada sel elektrokimia. Potensiostat dioperasikan dengan parameter voltametri siklis (CV), pada potensial 0 mV sampai 800 mV, kecepatan sapuan 100 mV/detik, 10 kali perulangan. Voltamogram yang diperoleh menunjukkan potensial oksidasi dan reduksi K3[Fe(CN)6].
mengacu pada Trivadila (2011). Elektroda dibuat dengan cara melarutkan 3 mg ferosena dalam 1 mL DMSO dan ke dalam larutan tersebut ditambahkan 100 mg grafit. Campuran didiamkan selama 2 jam. Setelah 2 jam pelarut dikeringkan menggunakan pengering vakum, sehingga diperoleh grafit termodifikasi mediator. Kemudian grafit dicampur dengan 35μL paraffin cair hingga membentuk pasta. Kemudian pasta karbon dimasukkan ke dalam badan elektroda. Permukaan elektroda dihaluskan dan dibersihkan dengan amplas dan kertas minyak.
Imobilisasi enzim
Matrik nanokomposit zeolit yang digunakan dibuat bervariasi 250 mg, 100mg, 50 mg, 25 mg disuspensikan kedalam larutan 5 ml bufer fosfat yang mengandung ekstrak kasar enzim SOD, campuran selanjutnya didiamkan selama 24 jam dan diaduk secara konstan pada suhu 40C. Campuran selanjutnya disentrifugasi dan dipisahkan suspensinya. Pelet dicuci dengan NaCl 0,9% beberapa kali dan disentrifugasi kembali. Pelet selanjutnya dikeringkan pada suhu 40C. 5 mikroliter pelet enzim SOD yang telah di imobilisasi dalam matiks zeolit selanjutnya diteteskan pada permukaan elektroda, dilapisi dengan membran dialisis, ditutup dengan jaring nilon dan diikat dengan parafilm. Imobilisasi ini dilakukan juga terhadap enzim SOD murni dan sel bakteri Deinococcus radiodurans.
Selain cara di atas juga dilakukan modifikasi imobilisasi SOD pada permukaan elektroda zeolit dibuat dengan cara melarutkan 100 mg zeolit dengan akuades sehingga membentuk pasta. Kemudian pasta karbon dimasukkan ke dalam badan elektroda. Selain itu elektroda juga dibuat dengan menggunakan zeolit yang terimobilisasi enzim, sebanyak 100 mg zeolit ditambahkan 5 unit SOD dalam 5 ml larutan buffer posfat. Campuran didiamkan selama 24 jam dan diaduk secara konstan pada suhu 40C. Campuran selanjutnya disentrifugasi dan dipisahkan suspensinya. Selanjutnya pelet yang dihasilkan dimasukkan kedalam badan elektroda.
15
Pengukuran Elektrokimia
Pengukuran elektrokimia dilakukan dengan metode voltametri siklik dengan menggunakan
Mode : Cyclic
eDAQ potensiostat–Galvanostat yang dilengkapi perangkat lunak Echem v2.1.0. Elektroda yang digunakan adalah elektroda Ag/AgCl sebagai elektroda rujukan, platina sebagai counter dan elektroda pasta karbon dan zeolit sebagai elektroda kerja. Parameter pengukuran dibuat sebagai berikut
Initial : 0 mV Final : 0 mV Rate : 125 mV/s Step W : 20 ms Upper E : 600 mV Lower E : 0 mV Range : 5 V
Radikal superoksida dihasilkan melalui reaksi enzimatis xantina-xantina oksidase (XO).
xantina + H2O + O2 XOD Asam urat + 2H+ + O•−
Larutan bufer fosfat sebanyak 1.9 mL dan 100 μL larutan XO 0,1 U/mL ditambahkan kedalam sel pengukuran dan puncak arus anoda yang terbentuk diamati sebagai blangko. Selanjutnya ditambahkan 1 mL larutan xantina 2,1 mM dan diukur kembali perubahan atau kenaikkan puncak arus anoda yang terjadi.
Optimasi aktivitas SOD dan Bakteri terimobilisasi
Optimasi yang dilakukan adalah optimasi suhu (20-40 0C), pH(7-11), konsentrasi SOD dan konsentrasi zeolit (25-250mg). Metode yang digunakan untuk pengoptimuman aktivitas SOD adalah Response Surface Method. Metode ini dilakukan dengan cara memasukkan kombinasi faktor-faktor peubah bebas pada perangkat lunak statistika Minitab. Selanjutnya percobaan dilakukan sesuai dengan kombinasi yang dihasilkan untuk mendapatkan nilai aktivitas optimumnya. Tabel 1 dan 2 menampilkan kombinasi faktor-faktor peubah bebas untuk pengoptimuman aktivitas SOD D. radiodurans dan enzim SOD murni. Sedangkan tabel 3 menampilkan kombinasi faktor-faktor peubah bebas untuk pengoptimuman aktivitas bakteri D. radiodurans
Suhu ( C) pH Zeolit (mg) [SOD] U/mL 25 8 81.25 2 35 8 81.25 2 25 10 81.25 2 35 10 81.25 2 25 8 193.75 2 35 8 193.75 2 25 10 193.75 2 35 10 193.75 2 25 8 81.25 4 35 8 81.25 4 25 10 81.25 4 35 10 81.25 4 25 8 193.75 4 35 8 193.75 4 25 10 193.75 4 35 10 193.75 4 20 9 137.5 3 40 9 137.5 3 30 7 137.5 3 30 11 137.5 3 30 9 25 3 30 9 250 3 30 9 137.5 1 30 9 137.5 5 30 9 137.5 3 30 9 137.5 3 30 9 137.5 3
17
Tabel 2 Kombinasi pH, suhu, zeolit dan enzim SOD untuk pengoptimuman aktivitas SOD D. radiodurans imobilisasi
Suh u pH zeolit [SOD] 25 8 81 1250 35 8 81 1250 25 10 81 1250 35 10 81 1250 25 8 194 1250 35 8 194 1250 25 10 194 1250 35 10 194 1250 25 8 81 1750 35 8 81 1750 25 10 81 1750 35 10 81 1750 25 8 194 1750 35 8 194 1750 25 10 194 1750 35 10 194 1750 20 9 138 1500 40 9 138 1500 30 7 138 1500 30 11 138 1500 30 9 25 1500 30 9 250 1500 30 9 138 1000 30 9 138 2000 30 9 138 1500 30 9 138 1500 30 9 138 1500 30 9 138 1500 30 9 138 1500 30 9 138 1500 30 9 138 1500
Suhu pH zeolit 24 8 71 36 8 71 24 10 71 36 10 71 24 8 204 36 8 204 24 10 204 36 10 204 20 9 138 40 9 138 30 7 138 30 11 138 30 9 25 30 9 250 30 9 138 30 9 138 30 9 138 30 9 138 30 9 138 30 9 138 Parameter Kinetika
Penentuan parameter kinetika dilakukan setelah diperoleh kondisi optimum aktivitas SOD. Parameter kinetika ekstrak enzim SOD D. radiodurans
yang diimobilisasi ditentukan dengan menggunakan persamaan Michaelis– Menten:
(1)
dengan adalah respon arus maksimal yang terukur (apparent), adalah konstanta Michaelis–Menten (apparent) dan [xantina] adalah konsentrasi xantina.
Persamaan Michaelis-Menten yang didapat dibuat turunannya, yaitu plot Lineweaver-Burk. Prosedur pengukuran adalah sama, namun pada uji kinetika ini, konsentrasi substrat radikal superoksida divariasikan, yaitu dengan memvariasikan konsentrasi xantina antara 0,0–1,00 mmol/mL.
19
Pengukuran Kapasitas Antioksidan
Elektroda yang telah dimodifikasi dengan enzim SOD selanjutnya digunakan untuk mengukur kapasitas antioksidan vitamin C. Pengukuran dilakukan pada kondisi optimum. Elektroda ditempatkan dalam sel pengukuran yang mengandung enzim 100 μL xantin oksidase 0,1 Unit/mL, kemudian 1 mL xantina
RAC = 1 – m
ditambahkan secara bertahap dan setiap penambahan diukur perubahan arus yang dihasilkan, sehinggga akan diperoleh garis lurus dengan nilai kemiringan tertentu. Selanjutnya pengukuran diulang dengan penambahan 0,5 mL vitamin C dengan variasi konsentrasi 0,005-0.05 M, akan diperoleh garis lurus dan kemiringan yang baru. Konsentrasi Kapasitas antioksidan diukur dalam
relative antioxidant capacity (RAC):
c/mx
dengan m
(2)
x adalah slope garis lurus yang dihasilkan tanpa senyawa antioksidan
sedangkan mc
Pengukuran kapasitas antioksidan vitamin C juga dilakukan dengan metode DPPH. Vitamin C dibuat dengan konsetrasi 1, 5, 10, 15 dan 20 ppm. Sebanyak 2 mL DPPH 125 µM ditambahkan kedalam 2 mL masing-masing sampel tersebut. Selanjutnya, dilakukan inkubasi selama 30 menit dalam suhu ruang. Diukur pada panjang gelombang 517 nm. Hasil pembacaan absorbans kemudian diplotkan terhadap konsentrasi dari kurva yang terbentuk dapat dihitung IC
slope garis lurus yang dihasilkan dengan penambahan senyawa antioksidan (Campanella et.al. 2005).
