HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengamatan Makroskopis
Keadaan normal struktur tulang panjang seperti os tibia memiliki bentuk yang kompak dan padat. Pembuatan lubang dengan menggunakan bor gigi pada os tibia akan merubah struktur bagian tulang yang dibor tersebut. Penanaman implan pada bagian defek setelah pengeboran akan direspon oleh jaringan tubuh. Begitu juga apabila tidak diberi implan akan mengalami perbaikan secara alami di dalam tubuh. Tubuh akan merespon suatu defek untuk memperbaiki kerusakan tersebut. Berikut hasil pengamatan makroskopis persembuhan kerusakan tulang segmental yang diimplantasi dengan HA-TKF (Tabel 1).
Tabel 1 Perubahan makroskopis jaringan tulang tibia dan implan HA-TKF pada berbagai periode pemanenan
Karakteristik pengamatan makroskopis Periode pemanenan HA-TKF yang diimplantasi pada tulang tibia domba
30 hari 60 hari 90 hari 1.Keadaan implan Terdegradasi Terdegradasi Terdegradasi
2.Warna Putih Putih Putih
3.Bentuk implan Pecah (+) Pecah (++) Pecah (+++) 4.Tingkat degradasi (+) (++) (+++) 5.Pertumbuhan jaringan baru ke dalam implan (+) (++) (+++) Keterangan: (+): sedikit; (++): banyak; (+++): semakin banyak
Berdasarkan pengamatan makroskopis (Tabel 1), pada keseluruhan periode pemanenan bagian implan HA-TKF memperlihatkan keadaan implan terdegradasi. Degradasi terhadap implan HA-TKF semakin meningkat seiring lamanya periode penanaman. Tubuh dapat melakukan respon dengan mendegradasi implan karena implan HA-TKF merupakan bahan material yang bersifat biodegradabel dan dapat digunakan untuk menggantikan jaringan tulang (Sunil et al. 2008).
Pemeriksaan makroskopis pada hari ke-30 pascaoperasi penanaman implan HA-TKF memperlihatkan adanya pertumbuhan jaringan ikat ke dalam implan (Gambar 6A). Pertumbuhan jaringan ini membuat keadaan implan menjadi terpecah dan terdegradasi dengan tingkat degradasi implan yang masih rendah (Gambar 6A). Menurut Bansal et al. (2009), dalam kondisi fisiologis normal, beberapa bahan hidroksiapatit komersial lain memiliki daya resorpsi yang lambat,
sedangkan trikalsium fosfat umumnya dapat diresorpsi setelah 6 minggu pascaoperasi. Implan yang diamati berwarna putih, dan memiliki konsistensi yang keras dan rapuh. Beberapa literatur juga menyebutkan komposisi bahan TKF memiliki sifat yang sangat rapuh (Viswanath et al. 2008). Keadaan berbeda terjadi pada tulang kontrol yang dipanen pada hari ke-30 tanpa pemberian implan. Secara makroskopis pada defek tulang kontrol memperlihatkan adanya massa jaringan ikat yang tumbuh menutup lubang defek (Gambar 6B). Massa jaringan tersebut menunjukkan adanya pertumbuhan kalus. Pertumbuhan kalus terjadi pada awal minggu pertama sampai minggu keempat pasca kerusakan (Cheville 2006).
Gambaran pengamatan makroskopis pada hari ke-60 pascaoperasi menunjukkan adanya peningkatan proliferasi jaringan ikat ke dalam bahan implan. Jaringan ikat tumbuh ke dalam implan seperti pada tahap 30 hari dan terjadi peningkatan degradasi (Gambar 6C). Hasil makroskopis memperlihatkan bentuk implan HA-TKF yang terpecah menjadi bagian yang lebih kecil dari pada bentuk implan pada pemanenan 30 hari. Pada daerah pinggir implan terlihat jelas pertumbuhan tulang tetapi bagian pusat implan belum terlihat adanya pertumbuhan. Sedangkan tulang kontrol memperlihatkan gambaran makroskopis dengan adanya massa jaringan pada lubang defek (Gambar 6D). Tahap persembuhan tersebut telah mencapai fase pertumbuhan kalus keras.
Gambaran pengamatan makroskopis pada hari ke-90 memperlihatkan perubahan keadaan implan HA-TKF yang sudah terpecah menjadi ukuran yang lebih kecil. Pecahan tersebut terlihat seperti butiran-butiran serbuk implan HA-TKF. Hal ini menunjukkan bahwa semakin lama implan ditanam maka tubuh akan meresorpsi implan tersebut. HA-TKF merupakan senyawa apatit yang secara alami terdapat dalam tulang (Saraswathy et al. 2001), sehingga bahan yang serupa dapat diterima oleh tubuh dan tubuh akan merespon dengan melakukan degradasi dan resorpsi. Pada matriks tulang terdapat komponen HA berupa garam kristal (Guyton & Hall 2006) dan TKF yang merupakan mineral kalsium yang terdapat di dalam tubuh dalam jumlah yang rendah (Samuelson 2007). Implan HA-TKF terlihat tidak lagi dalam bentuk pellet yang padat tetapi berubah menyerupai bentuk granul karena adanya degradasi yang lebih besar (Gambar 6E). Pada area pinggir defek terlihat adanya pertumbuhan tulang mengarah ke pusat implan,
sedangkan pada tulang kontrol lubang defek telah menunjukkan adanya pertumbuhan tulang. Pertumbuhan tersebut sudah mirip dengan tulang disekitarnya (Gambar 6F).
Gambar 6 Gambaran makroskopis persembuhan tulang perlakuan (kolom kiri) dan tulang kontrol (kolom kanan) dengan pemanenan pada hari ke-30 (A, B), ke-60 (C, D), dan hari ke-90 (E, F) pascaoperasi. Peningkatan degradasi ditandai dengan semakin banyaknya pertumbuhan jaringan ikat ke pusat implan (Æ) dan terjadi perubahan struktur implan menjadi terpecah-pecah sehingga berubah menjadi bentuk granul pada hari ke-90. Persembuhan pada kelompok kontrol ditunjukkan pada lingkaran merah. s : sumsum tulang; i: implan. Bar : 5 mm.
A
B
C
D
E
F
s
s
s
s
s
s
i
i
i
Pengamatan Mikroskopis
Gambaran Mikroskopis Preparat Tulang Gosok
Proses penggosokan pada pembuatan preparat tulang gosok bertujuan untuk mendapatkan ketebalan minimum sehingga preparat mudah diamati dengan mikroskop cahaya. Saat proses penggosokan, bagian implan sulit untuk dipertahankan. Hal ini dikarenakan implan HA-TKF telah mengalami proses degradasi namun belum terbentuk tulang kompakta yang akan menggantikan implan dengan struktur tulang padat. Keadaan di pusat implan menjadi sangat rapuh sehingga dapat hilang karena proses mekanis saat penggosokan. Selain itu proses tersebut juga dapat mengikis jaringan ikat yang melekatkan tulang dengan implan.
Pada preparat tulang gosok yang diimplan dengan HA-TKF, bagian pusat implan tidak dapat diamati. Pertumbuhan jaringan tulang tipe trabekular terlihat pada bagian batas antara implan dan tulang. Adanya sedikit celah antara implan dan tulang tersebut (bagian pinggir implan) diduga memberikan ruang untuk migrasi sel-sel osteogenik dalam melakukan proses perbaikan. Hal sebaliknya terjadi di pusat implan. Keadaan implan yang padat saat awal implantasi memungkinkan sulitnya vaskularisasi dan migrasi sel-sel osteogenik ke dalam implan, sehingga bagian pinggir antara tulang dan implan terlihat lebih cepat tumbuh dibandingkan dengan bagian pusat implan.
Pada preparat tulang gosok kelompok kontrol setelah pemanenan hari ke-30, menunjukkan pertumbuhan tulang yang lebih cepat dibandingkan dengan kelompok perlakuan. Lubang defek telah diisi dengan pertumbuhan jaringan. Pertumbuhan tersebut berupa tulang trabekular. Tulang tersebut memiliki bentuk berlubang-lubang seperti anyaman jala. Jarak antara lubangnya lebih besar dari pada tulang kompakta (Samuelson 2007). Tipe tulang ini sering dideskripsikan sebagai tulang yang belum dewasa (immature bone). Jaringan tulang yang mengisi defek tersebut merupakan bentuk jaringan kalus. Kalus tulang atau kalus keras dapat terbentuk satu sampai empat minggu pasca kerusakan (Cheville 2006). Pola pertumbuhan kalus terlihat dimulai dari bagian yang masih memiliki unsur vaskular seperti bagian sisi defek, periosteum atau sumsum tulang menuju pusat defek. Gambaran bentukan kalus diperlihatkan pada gambar 7B.
Gambar 7 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang perlakuan (A) dan tulang kontrol (B) pada hari ke-30 pascaoperasi. Tanda panah merah menunjukkan daerah pertumbuhan tulang baru berbentuk tulang trabekular dan lingkaran merah menunjukkan daerah defek. Pewarnaan Hematoksilin. Bar: 0,5 mm.
Pada pengamatan preparat gosok yang diberi perlakuan implan selama 60 hari pascaoperasi terlihat pola pertumbuhan tulang di bagian pinggir menuju pusat implan. Pertumbuhan tersebut berasal dari bagian kerusakan di kedua sisinya. Selain itu pertumbuhan tulang trabekular juga aktif terjadi pada bagian pinggir tulang ke arah sumsum tulang (Gambar 8A). Proses ini terjadi karena bagian sumsum tulang mengandung bahan-bahan osteogenik (Kalfas 2001) seperti sel-sel osteoprogenitor yang akan berdeferesiasi menjadi sel osteoblas. Sel osteoblas ini yang nantinya akan berkembang menjadi struktur tulang yang kompak karena proses mineralisasi (Samuelson 2007).
Pada preparat kelompok kontrol pengamatan pascaoperasi selama 60 hari, daerah defek yang tidak diberi implan mengalami pertumbuhan atau proses osteogenesis. Tulang yang terbentuk memperlihatkan keadaan yang lebih baik dibandingkan dengan kelompok perlakuan. Bentukan tulang tidak lagi seperti pengamatan kontrol 30 hari. Pada keadaan defek yang telah menutup mengalami peningkatan tahap perbaikan. Tulang menjadi lebih padat, kompak dan terlihat memiliki unsur-unsur seperti sistem osteonal, saluran Haver’s dan saluran Volkmann (Gambar 9). Pertumbuhan tulang baru sudah mencapai tahap mature. Kepadatan tulang mature dalam bentuk kompak (kortikal) menghasilkan suatu kekuatan tulang (Baron & Emile 2003). Kekuatan tulang ini menyebabkan saat
B
A
dilakukan penggosokan struktur tulang tidak akan mengalami perubahan atau pengikisan dan bentukan tulang dapat diamati dengan baik. Pola pertumbuhan memperlihatkan tulang menutupi daerah defek.
Gambar 8 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang perlakuan (A) dan tulang kontrol (B) pada hari ke-60 pascaoperasi. Tanda panah merah menunjukkan daerah pertumbuhan tulang baru dan lingkaran merah menunjukkan daerah defek pada pertumbuhan tulang baru. Bagian persembuhan pada defek tulang kontrol (B) memperlihatkan bentukan tulang kompakta. Pewarnaan Hematoksilin. Bar: 0,5 mm
Gambar 9 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang kontrol pada hari ke-60 pascaoperasi, terbentuk tulang kompakta dengan struktur osteon (lingkaran merah), saluran Haver’s (H), saluran Volkmann (V), dan osteosit (OS). Pewarnaan Hematoksilin. Bar: 20µm
V
H
OS
Pengamatan preparat gosok kelompok perlakuan pada hari ke-90 pascaoperasi memperlihatkan pada bagian pinggir antara implan dan tulang terjadi pertumbuhan tulang trabekular. Sedangkan bagian pusat implan belum menunjukkan adanya bentukan tulang kompakta seperti yang terjadi pada defek kelompok kontrol. Pada kelompok kontrol bagian defek telah menutup dan berbentuk tipe tulang kompakta. Umumnya setelah 90 hari, perbaikan tulang telah mencapai tahap remodelling (Cheville 2006). Pada tahap ini kerusakan tulang telah kembali mempunyai bentuk, struktur, dan kekuatan mekanik seperti semula (Kalfas 2001). Pola pertumbuhan tulang terlihat menutupi lubang defek, dan pada kelompok perlakuan, pola pertumbuhan tulang menuju bagian pusat implan.
Gambar 10 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang perlakuan (A) dan tulang kontrol (B) pada hari ke-90 pascaoperasi. Tanda panah merah menunjukkan daerah pertumbuhan tulang baru dan lingkaran merah menunjukkan daerah defek pada pertumbuhan tulang baru. Pewarnaan Hematoksilin. Bar : 0,5 mm
Secara keseluruhan daerah defek yang diimplantasi dengan HA-TKF, pertumbuhan dan regenerasi tulang terjadi lebih lambat dibandingkan dengan persembuhan defek tanpa pemberian implan. Pada kelompok kontrol menunjukkan pada daerah pengeboran setelah 90 hari keadaannya menutup, ditandai dengan adanya osteosit-osteosit yang mengalami kalsifikasi sehingga terbentuk struktur osteonal.
Gambaran Mikroskopis Preparat Tulang Dekalsifikasi
Pemeriksaan dengan menggunakan preparat dekalsifikasi dan diwarnai dengan menggunakan Hematoksilin Eosin (HE) memperlihatkan perubahan-perubahan secara mikroskopis baik dari segi implan HA-TKF dan respon jaringan terhadap perbaikan alami dan respon terhadap implan. Hasil secara detail pengamatan mikroskopis preparat dekalsifikasi dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3 Perubahan mikroskopis jaringan tulang tibia dan implan HA-TKF pada berbagai periode pemanenan
Karakteristik pengamatan mikroskopis Periode pemanenan HA-TKF yang diimplan pada
tulang tibia domba
Keterangan
30 hari 60 hari 90 hari
1.Proliferasi jaringan ikat ke dalam implan (+) (++) (+++) Seperti membelah implan 2.Pertumbuhan jaringan tulang baru di
pinggir implan
(+) (++) (+++) Menyebar di beberapa lokasi pinggir implan 3.Pertumbuhan jaringan tulang (bone
growth) baru di pusat implan
(-) (++) (+++) Berupa tulang rawan
4. Proliferasi sumsum tulang * * * *Terdapat serpihan tulang, sumsum terlihat sel lemak dan neovaskularisasi 5.Ikatan antara tulang lama dengan implan * * * *Dilekatkan dengan
jaringan ikat diantara keduanya
6.Pembentukan trabekular di dalam implan (+) (+) (+) 7.Biodegradasi (+) (++) (+++) 8.Reaksi inflamasi pada pinggir implan - - -
9.Neovaskularisasi di dalam implan (+) (++) (+++) Bertambah seiring peningkatan proliferasi jaringan ikat
Keterangan (-): tidak ada; (+): sedikit; (++): banyak; (+++): sangat banyak
Berdasarkan pengamatan mikroskopis tulang dekalsifikasi pada hari ke-30 pascaoperasi telah menunjukkan adanya proliferasi jaringan ikat ke dalam implan. Jaringan ikat yang masuk ke dalam implan berbentuk serabut dengan inti berwarna biru. Selain itu, neovaskularisasi banyak terdapat pada jaringan ikat di dalam implan (Gambar 12A). Hasil tersebut mengindikasikan HA-TKF memiliki sifat osteokonduktif. Menurut Kalfas (2001) osteokonduktif adalah sifat fisik dari graft dalam menjalankan fungsi sebagai scaffold untuk mendukung dalam persembuhan tulang. Biomaterial yang memiliki sifat osteokonduktif memungkinkan untuk pertumbuhan neovaskularisasi dan infiltrasi sel-sel precursor osteogenik ke dalam ruang graft. Jaringan ikat tumbuh mendesak tulang
dan membelah implan. Pertumbuhan jaringan dan neovaskularisasi di dalam implan menandakan adanya degradasi dan resorpsi jaringan terhadap implan HA-TKF. Ruang sumsum tulang terdapat banyak pembuluh darah dan sel-sel lemak (Gambar 12B), hal ini menunjukkan sumsum tulang dalam keadaan normal.
Implan terlihat menempel di bagian tulang dengan dilekatkan oleh jaringan ikat. Pada area antara implan dengan tulang tidak terdapat reaksi inflamasi karena tidak ditemukannya sel-sel radang di area tersebut. HA-TKF merupakan senyawa kalsium yang tidak menimbulkan inflamasi, respon imunologi dan respon iritasi terhadap jaringan (Murugan dan Ramakrishna 2004). Namun, pada sisi implan yang berkontak dengan sumsum tulang terdapat tumpukan sel-sel darah merah yang menandakan adanya ruptur pembuluh darah.
Pertumbuhan tulang rawan juga terlihat pada bagian pinggir implan (Gambar 11). Pada bagian implan HA-TKF yang telah diresorpsi akan digantikan dengan massa tulang rawan. Area pusat implan sebagian besar berupa massa HA-TKF yang berbentuk seperti serabut beraspek eosinofilik dalam preparat dekalsifikasi dengan pewarnaan HE. Pertumbuhan tulang yang berbentuk trabekular terjadi pada bagian pinggir defek (Gambar 12C).
Gambar 11 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang perlakuan pada hari ke-30 pascaoperasi. Tulang rawan (Æ) terbentuk di bagian pinggir implan dan jaringan ikat (JI) tumbuh ke bagian pusat implan. Pewarnaan HE. Bar: 30µm.
HA-TKF Os tibia
Gambar 12 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang perlakuan pada hari ke-30 pascaoperasi. A. Pertumbuhan jaringan ikat (JI) di pusat implan dan neovaskularisasi (p) di dalam implan HA-TKF. B. Daerah sumsum tulang dengan adanya neovaskularisasi (p) dan sel-sel lemak (L). C. Pertumbuhan trabekular (T) dengan regenerasi sel-sel tulang. Pewarnaan HE. Bar A&B: 10µm; C: 20µm. HA-TKF A B C
p
T
p
L
p
JI
Berbeda dengan keadaan persembuhan segmental tulang yang diimplan dengan HA-TKF, kelompok tulang kontrol pada pengamatan hari ke-30 pascaoperasi menunjukkan bagian defek tulang telah tertutup dengan tulang trabekular dan sebagian jaringan ikat (Gambar 13A). Jaringan ikat tersebut memiliki sel-sel dengan inti berwarna ungu dan berbentuk serabut. Daerah pinggir defek memperlihatkan proses persembuhan dengan ditandai pembentukan tulang baru. Pertumbuhan tulang baru tersebut berupa tulang trabekular atau beraspek spongiosa. Pada tulang trabekular ini terlihat sel-sel osteoblas berada di pinggir tulang (Gambar 13).
Osteoblas membentuk formasi berderet menyerupai sel-sel epithelium. Pada daerah tengah tulang-tulang trabekular juga terlihat membentuk sel-sel osteosit yang terisolasi di dalam matrik karena proses mineralisasi. Pada daerah tengah defek juga terlihat jelas pertumbuhan tulang trabekular dan di sekitarnya terdapat pertumbuhan tulang secara meluas berupa penjuluran-penjuluran trabekular (Gambar 13A). Periosteum pada daerah defek menebal. Sumsum tulang dipenuhi sel-sel lemak dan pembuluh darah.
Gambar 13 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang kontrol pada hari ke-30 pascaoperasi. Gambar A merupakan area defek yang telah tertutup jaringan ikat (JI) dan tulang trabekular (T). Gambar B, pertumbuhan tulang trabekular di bagian pinggir defek, dengan adanya osteoblas (OB) dan pembentukan osteosit (OS) di tengah-tengah matriks tulang (M). Pewarnaan HE. Bar A: 40 µm, B: 20 µm.
Persembuhan tulang kontrol pada hari ke-30 pascaoperasi secara keseluruhan menunjukkan perbaikan dan pertumbuhan tulang yang lebih baik dibandingkan dengan defek tulang yang diberi implan HA-TKF. Pertumbuhan
B A JI T T JI OS OB M
tulang berawal dari perbaikan dari pinggir defek kemudian ke bagian tengah defek. Degradasi dan resorpsi implan telah terjadi pada pengamatan di hari ke-30.
Hasil pengamatan pada hari ke-60 pascaoperasi menunjukkan adanya peningkatan proliferasi jaringan ikat ke dalam implan dibandingkan pada pengamatan hari ke-30. Jaringan ikat mendegradasi implan seperti pada tahap 30 hari namun terjadi peningkatan degradasi. Pada daerah pinggir implan terlihat jelas pertumbuhan tulang trabekular. Keadaan pada pusat implan mengalami perubahan yaitu terbentuknya matriks tulang rawan. Zona tersebut memperlihatkan adanya kalsifikasi dan osifikasi. Kalsifikasi tulang rawan ditunjukkan dengan zona berwana biru dan matriks tulang ditandai dengan massa berwarna lebih eosinofilik. Proses perubahan ini ditunjukkan pada Gambar 14. Adanya persembuhan dengan munculnya massa tulang rawan menunjukkan bahwa HA-TKF dapat memberikan persembuhan tulang yang baik. Sebagian besar komposisi bahan anorganik tulang adalah fase hidroksiapatit, dan terkandung beberapa mineral lainnya yaitu karbonat, magnesium, flourida, klorida, kalium dan pirofosfat (Yusof 2008). Kandungan mineral ini memberikan kekerasan dan melindungi tulang dari kerusakan seperti patah. Apabila tahap mineral meningkat maka akan meningkatkan kekuatan dan kekakuan tulang (Yusof 2008). Hidroksiapatit mempunyai komposisi kimia yang hampir sama dengan tulang yang sebenarnya pada manusia, maka HA dianggap sangat sesuai digunakan untuk penggantian dan perbaikan jaringan tulang manusia yang rusak (Yusof 2008). Keadaan sumsum tulang memperlihatkan banyaknya pembuluh darah besar, selain itu sumsum tulang juga dipenuhi sel-sel lemak.
Ikatan antara tulang dan implan diperantai oleh adanya jaringan ikat. Kemudian celah antara keduanya terlihat pertumbuhan jaringan tulang seperti tulang trabekular. Tulang trabekular juga tumbuh di dalam implan. Pertumbuhan tulang trabekular berawal dari daerah pinggir ke bagian pusat implan. Pembentukan tulang ditandai dengan hadirnya sel-sel osteoblas yang aktif mensintesis. Sel osteoblas aktif berbentuk kubus dan berderet di pinggir penjuluran tulang trabekular. Pertumbuhan tulang juga ditandai dengan adanya osteosit yang terisolasi di dalam matrik tulang trabekular. Daerah sekitar pertumbuhan tulang dipenuhi jaringan ikat dan bahan material implan HA-TKF.
Gambar 14 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang perlakuan pada hari ke-60 pascaoperasi, terjadi perkembangan struktur implan dengan adanya indikasi pembentukan tulang rawan dan pertumbuhan jaringan ikat. Kalsifikasi tulang rawan (K) ditunjukkan dengan zona berwana ungu dan matriks tulang (M) ditandai dengan massa berwarna lebih eosinofilik. Pewarnaan HE. Bar: 20 µm.
Pada daerah implan juga ditemukan sel-sel berinti banyak dan memiliki ukuran lebih besar dibandingkan sel-sel tulang lainnya. Sel tersebut diduga merupakan sel osteoklas. Sel osteoklas yang ditemukan memiliki banyak inti, dengan warna inti biru dan sitoplasma bersifat asidofilik berwarna merah dalam pewarnaan HE. Sel ini menandakan adanya proses bioresorpsi dan biodegradasi yang terjadi pada implan HA-TKF.
Pada persembuhan tulang kontrol tanpa pemberian implan HA-TKF, jaringan memberikan respon yang berbeda. Pada pengamatan makroskopis, defek tulang telah ditutupi suatu massa jaringan. Hasil ini diperjelas dengan pemeriksaan secara mikroskopis. Pada hari ke-60 pascaoperasi massa jaringan tersebut merupakan pertumbuhan tulang. Pada sebagian lokasi, tulang tumbuh berbentuk trabekular namun sebagian besar tulang telah memasuki tahap tipe kompakta. Bagian pinggir tulang dekat dengan periosteum memperlihatkan aktifitas osteoblastik. Sebagian besar tulang telah membentuk struktur kompakta (Gambar 15).
HA-TKF
JI
M
Gambar 15 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang kontrol pada hari ke-60 pascaoperasi, terjadi penebalan periosteum dan terbentuknya tulang yang divaskularisasi oleh pembuluh darah (PD), struktur kompakta sudah terlihat (K). Pewarnaan HE; Bar 40µm .
Pada pemeriksaan mikroskopis antara tulang kontrol dan tulang perlakuan pada hari ke-60 pascaoperasi, menunjukkan adanya perbedaan. Pertumbuhan dan persembuhan pada tulang kontrol terjadi lebih cepat dibandingkan dengan tulang perlakuan.
Gambaran mikroskopis pada kelompok perlakuan implan HA-TKF hari ke-90 menunjukkan adanya peningkatan proliferasi jaringan ke dalam pusat implan. Perubahan yang paling menonjol yaitu keberadaan tulang rawan yang semakin meluas dan lebih kompak dari perlakuan 30 dan 60 hari (Gambar 16). Adanya ikatan antara implan dengan tulang menunjukkan bahwa HA-TKF memiliki sifat bioaktif, yaitu mampu berkontak dengan sistem jaringan dan mampu bereaksi dengan jaringan dan menghasilkan ikatan kimia yang sangat baik (Purnama 2006). Tingkat biodegradasi dan resorpsi pada tahap ini menunjukkan intensitas tinggi. Implan yang ditanam sebagian besar didegradasi dan diserap oleh tubuh dan digantikan oleh jaringan baru. Pertumbuhan jaringan ikat dan pembuluh darah juga meningkat. Peningkatan jumlah pembuluh darah yang memvaskularisasi bagian pusat implan menunjukkan tingkat penyerapan yang semakin besar dan menandakan jaringan baru telah tumbuh secara meluas.
PR
P D
Gambar 16 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang perlakuan pada hari ke-90 pascaoperasi. Tulang rawan (TR) dan jaringan ikat (JI) tumbuh secara meluas di bagian pusat dan pinggir implan. Pewarnaan HE; Bar: 20 µm.
Gambar 17 Gambaran mikroskopis persembuhan tulang kontrol pada hari ke-90 pascaoperasi. Tulang terbentuk memenuhi lubang defek. PR: periosteum. Pewarnaan HE. Bar : 40µm.
Gambaran defek tulang kontrol pada hari ke-90 menunjukkan lubang-lubang yang terbentuk lebih sedikit, tulang memiliki tingkat kekompakan yang hampir sempurna, ditandai dengan adanya struktur seperti saluran Harver’s,
tulang
TR
JI
osteosit yang telah tersebar dalam matriks dan saluran Volkmann. Daerah pengeboran dengan daerah sekitarnya terlihat memiliki struktur yang hampir mirip. Proses osteogenesis pada tulang kontrol terjadi lebih cepat dibandingkan dengan tulang yang ditanam implan HA-TKF.
Kajian Morfologi Persembuhan Tulang
Proses persembuhan pada kerusakan tulang segmental mirip dengan persembuhan fraktur. Pengeboran pada tulang akan membuat bagian tulang tersebut nekrosis dan terjadi peluruhan pembuluh darah dan tejadi ruptur kapiler-kapiler darah (Cheville 2006). Pada tulang kontrol, lubang akan dipenuhi darah dan terjadi koagulasi oleh sel-sel darah yang diinduksi oleh fibrinogen kemudian terjadi lesio hematoma (Kalfas 2001). Begitu pula yang terjadi pada tulang yang diberi implan, adanya celah (gap), pori atau defek lain antara tulang dan implan maka akan terisi dengan bekuan darah sesaat setelah operasi (Brunski 1999).
Kerusakan seluler membuat sebagian tulang kehilangan vaskularisasi atau terjadi kerusakan vaskuler, dan terjadi trauma serta nekrotik. Keadaan ini akan mengaktifkan sel-sel monosit, limfosit, sel-sel polimorfonuklear dan fibroblast yang akan menginfiltrasi tulang dengan diperantarai oleh prostaglandin (Kalfas 2001). Tahap ini sudah tidak teramati pada umur kerusakan 30 hari. Tahap inflamasi terjadi pada umur kerusakan sekitar dua atau tiga hari (Cheville 2006). Monosit yang masuk ke dalam daerah fraktur akan bertransformasi menjadi makrofag yang memainkan peranan penting dalam persembuhan tulang (Cheville 2006). Hal ini akan menyebabkan pembentukan jaringan granulasi, pertumbuhan jaringan pembuluh darah (neovaskularisasi), dan migrasi dari sel-sel osteogenik (Kalfas 2001). Umumnya pasca 30 hari terjadi kerusakan segmental atau fraktur pada tulang akan mengalami persembuhan dalam tahap remodelling (Cheville 2006).
Penanaman implan HA-TKF di dalam kerusakan segmental memberikan suatu respon yang berbeda oleh jaringan tulang seiring dengan lamanya waktu penanaman implan, mulai hari ke-30, 60 dan 90 pascaoperasi, jaringan tulang mengikat implan melalui pertumbuhan jaringan ikat dan semakin meluas pada hari ke-60 dan 90. Jaringan ikat memiliki fungsi sebagai penunjang tubuh dan
merupakan jaringan penghubung di dalam tubuh (Astawan 2002). Proses osteointegrasi terjadi dengan pembentukan jaringan ikat pada pertautan antara tulang dan implan HA-TKF. Mengingat fungsi jaringan ini sebagai penunjang dan memelihara integritas struktur tubuh hewan maupun manusia.
Jaringan ikat tidak hanya melapisi bagian pinggir implan tetapi juga tumbuh di dalam implan. Proliferasi jaringan ini berdampak pada keadaan implan. Bentuk implan yang semula ditanam memiliki bentuk padat dan utuh setelah 30 sampai 90 hari diimplantasi pada tulang domba mengalami degradasi dan terpecah oleh pertumbuhan jaringan ikat. Bahkan dalam pengamatan 90 hari implan sudah berbentuk menyerupai granul. Pada daerah implan menunjukkan adanya hubungan fibroseluler dengan bagian tulang yang lama, hal ini mengindikasikan terjadinya resorpsi dan proses penggantian di dalam implan (graft) secara ekstensif (Maiti et al. 1995).
Pada preparat kontrol, jaringan ikat hanya muncul pada pengamatan hari ke-30. Hal ini membuktikan adanya persembuhan yang mencapai tahap pembentukan kalus. Kalus merupakan jaringan baru antara dua ujung fraktur yang kemudian akan berubah menjadi jaringan tulang (Dorland 2002). Pada fase ini tulang kontrol telah terbentuk kalus dan disini tulang menjadi osteoporotik akibat resorpsi kalsium untuk penyembuhan. Sel-sel yang berkembang memiliki potensi kondrogenik dan osteogenik mulai membentuk jaringan kartilago dan tulang. Pada awal persembuhan akan terbentuk jaringan granulasi yang merupakan kalus lunak dan kemudian ketika berubah menjadi tulang rawan atau tulang dinamakan kalus keras (Cheville 2006).
Pada pengamatan kelompok tulang kontrol hari ke-30, tulang baru sudah terbentuk di daerah pinggir defek dan sebagian tumbuh di pusat defek dengan berbentuk tulang trabekula. Pertumbuhan tulang baru ditandai dengan hadirnya sel-sel osteoblas dan osteosit. Sel osteoblas membentuk deretan di pinggir tulang trabekular yang baru. Sel tersebut berfungsi mensekresikan bahan-bahan matriks tulang dan membentuk osteoid. Kemudian sel osteoblas akan terisolasi di dalam matrik dan berubah menjadi sel osteosit. Pertumbuhan tulang terlihat mengarah ke dalam lubang segmen tempat pengeboran. Proses ini akan berlangsung secara
kontinyu sampai tulang mencapai stabilitas sempurna. Periosteum di daerah defek mengalami penebalan.
Pertumbuhan tulang baru mulai tampak jelas pada hari ke-30 pascaoperasi penanaman implan HA-TKF. Pada periode ini pertumbuhan tulang terjadi di daerah pinggir implan di dekat sumsum tulang. Hal serupa terjadi pada penelitian yang dilakukan oleh Sunil et al. (2008) yang mengimplankan HA-TKF pada kelinci, setelah 8-12 minggu hasil mikroskopis menunjukkan pertumbuhan tulang mulai terjadi di pinggir kemudian tumbuh menuju pusat implan dan menyebar ke dalam implan. Penyebaran pertumbuhan tulang baru merupakan hasil dari aksi osteogenik yang berasal dari sumsum tulang di dalam ruang defek (Sunil et al. 2008).
Tulang baru yang tumbuh berbentuk jala atau disebut tulang trabekular. Osteoblas sebagai sel pembentuk tulang terletak di pinggir tulang trabekular dan membentuk deretan seperti barisan sel epithelium. Sel osteoblas berasal dari sel osteogenik yang ada pada periosteum, endosteum atau sumsum tulang. Osteoblas akan aktif mensintesis komponen organik tulang atau disebut osteoid (prebone). Komponen tersebut berupa kolagen, proteoglikan dan glikoprotein (Samuelson 2007). Osteoid yang terbentuk berawal dari bahan dasar fibril kolagen yang belum berkapur dan bersifat lunak (Hartono 1989).
Pada bagian tengah tulang trabekular memperlihatkan adanya sel-sel osteosit. Adanya sel-sel osteosit menandakan terjadinya perkembangan pada tulang trabekular. Sel osteosit merupakan perkembangan lanjutan dari sel-sel osteoblas yang terisolasi oleh matriks yang dihasilkan (Mills 2009). Osteosit berada dalam matriks membentuk suatu ruang berbentuk oval dan disebut lakuna (Samuelson 2007). Selanjutnya osteosit akan membentuk kanalikuli yang merupakan suatu penjuluran-penjuluran secara radial.
Pertumbuhan tulang baru tidak hanya terjadi pada bagian perifer tetapi juga tumbuh di dalam pusat implan berupa pertumbuhan jaringan tulang rawan. Pertumbuhannya menyebar tidak beraturan. Massa tulang rawan di pusat implan ditemukan pada pemanenan hari ke-60 dan 90. Pembentukan jaringan tersebut menunjukkan bahwa persembuhan telah memasuki tahap perbaikan dengan pembentukan tulang rawan yaitu mencapai fase pembentukan kalus keras. Tulang
rawan yang terbentuk hanya bersifat sementara karena akan segera digantikan dengan woven bone yang kemudian akan mengalami remodelling menjadi lamellar bone. Matriks ekstraselular tulang rawan akan mengalami kalsifikasi, sehingga khondrosit mati.
Adanya pertumbuhan tulang di dalam implan menandakan HA-TKF memiliki sifat osteokonduktif. Menurut Xue et al. (2009) HA-TKF keramik memiliki potensi sebagai osteokonduktif dan memiliki tingkat resorpsi optimal untuk pembentukan tulang. Osteokonduktif adalah sifat fisik dari graft dalam menjalankan fungsi sebagai scaffold untuk mendukung dalam persembuhan tulang. Osteokonduktif memungkinkan untuk pertumbuhan neovaskularisasi dan infiltrasi sel-sel prekursor osteogenik ke dalam ruang graft (Kalfas 2001).
Pada penelitian ini proses resorpsi dan degradasi HA-TKF telah terjadi minimal pada hari ke-30 penanaman. Setelah tiga bulan HA-TKF diimplan pada tulang domba telah memperlihatkan pembentukan tulang yang belum merata di seluruh implan. Penelitian yang telah dilakukan Uchida et al. (1990) melaporkan pertumbuhan tulang secara sempurna di seluruh bagian pori implan HA-TKF terjadi setelah 12 bulan. Sehingga dalam penelitian ini perlu penambahan waktu implantasi sampai mencapai adanya pertumbuhan tulang yang optimal di dalam implan.
Sel osteoklas memiliki peranan yang penting dalam resorpsi dan remodelling tulang (Samuelson 2007). Daya bioresorpsi menjadi salah satu syarat dalam menentukan biomaterial yang ideal. Hasil yang diperoleh menunjukkan HA-TKF mampu diresorpsi oleh jaringan tulang. Hadirnya sel-sel osteoklas yang ditemukan pada hari ke 60 di dalam daerah implan membuktikan HA-TKF memiliki potensi bioresorbabel.
Osteoklas merupakan multinukleat giant sel yang memiliki 6-50 atau lebih inti sel yang berperan dalam penyerapan dan remodelling jaringan tulang (Samuelson 2007) dengan ukuran diameternya sekitar 40 sampai 100 µm (Dellman & Eurell 2002). Dalam pewarnaan HE, sitoplasmanya berwarna merah muda karena bersifat acidophilic dan inti sel berwarna biru karena memiliki sifat basophilic. Osteoklas berasal dari sumsum tulang dan merupakan derivat dari sel monosit. Osteoklas melakukan aksi resorpsi melalui reaksi enzimatis (Samuelson
2007). Osteoklas akan mensekresikan berbagai bahan seperti asam laktat, asam sitrat, enzim hidrolitik kuat (acid hydrolase, collagenase, dll.) yang akan mencerna bahan matriks ekstraseluler.
Berdasarkan hasil yang diperoleh, implan HA-TKF memiliki sifat biodegradabel dan bioresorbabel. Implan mulai terpecah di hari ke-30, tetapi implan masih terlihat dalam pengamatan setelah 60 dan pada 90 hari pascaoperasi. Pada akhir pengamatan sisa implan sudah sangat sedikit. Jika dibandingkan dengan persembuhan kontrol tanpa pemberian implan, kerusakan segmental pada tulang kontrol menunjukkan perbaikan dan pertumbuhan yang lebih cepat dibandingkan dengan kerusakan segmental yang diberi implan HA-TKF.
Biodegradasi dari suatu bahan implan keramik dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain seperti pori-pori (porosity), kepadatan (density), rasio bahan implan HA-TKF, ukuran partikel serta waktu dan temperatur pembuatan (Maiti et al. 1995). Pori-pori di dalam implan akan meningkatkan kemampuan ikatan tulang, karena beberapa alasan antara lain a) adanya pori-pori akan memperbesar area permukaan sehingga menghasilkan daya bioreabsorpsi yang tinggi, dan dapat lebih menginduksi bioaktivitas, b) pori-pori yang saling berhubungan dapat memberikan suatu kerangka atau tempat untuk pertumbuhan tulang ke dalam matriks implan, c) hubungan antara pori juga berfungsi sebagai tempat saluran vaskularisasi, sehingga pembuluh darah dapat masuk ke dalam implan dan dapat menyuplai nutrien untuk pertumbuhan tulang (Nandi et al. 2009). Pada penelitian ini porositas dan kepadatan dari implan HA-TKF yang digunakan belum diketahui secara mendetail sehingga perlu pengkajian lebih lanjut dalam mendesain struktur implan untuk meningkatkan daya biodegradasi dan resorpsi agar dapat mendukung persembuhan tulang dengan baik.
Pada tulang perlakuan selama 30, 60 dan 90 hari pascaoperasi tidak memperlihatkan reaksi inflamasi. Tidak adanya reaksi inflamasi dan respon terhadap benda asing pada akhir pengamatan menandakan bahwa implan dapat digunakan sebagai alternatif penggantian tulang dalam mengisi defek tulang (Nandi et al. 2009) dan bersifat aman dan tidak toksik untuk tubuh. Tidak adanya reaksi penolakan oleh tubuh terhadap implan HA-TKF juga menunjukakan bahwa implan tersebut memiliki kecocokan dan bersifat biokompatibel dengan tubuh.
Bone graft dapat digunakan untuk membantu perbaikan berbagai kerusakan tulang, salah satunya adalah kerusakan fraktur. Fraktur atau patah tulang adalah terputusnya kontinuitas jaringan tulang atau tulang rawan. Berdasarkan luka yang ada patah tulang dapat dibagi menjadi patah tulang terbuka dan patah tulang tertutup (Brinkker et al. 1983). Fraktur tulang dapat diklasifikasikan menjadi beberapa tipe antara lain seperti tipe transverse, oblique, spiral, comminuted (tulang patah pada beberapa fragmen) dan segmental berdasarkan keparahan gangguan pada tulang (Scott & McLaughlin 2007). Penanganan patah tulang atau fiksasi yang dilakukan tergantung dengan derajat keparahan gangguan pada tulang. Patah tulang luka terbuka dengan tipe comminuted memerlukan fiksasi menggunakan bone graft (Scot t & McLaughlin 2007). Pemasangan graft dalam penanganan fraktur tipe comminuted juga memerlukan fiksasi dengan menggunakan plate dan screw. Bone graft sintetik seperti HA-TKF dapat digunakan untuk menangani kerusakan tersebut.
Bahan keramik seperti HA-TKF juga memiliki fungsi untuk berbagai macam aplikasi antara lain sebagai pengganti untuk jaringan yang berkapur dan membantu memperbaiki pembentukan tulang. Dalam bidang biomedis, biomaterial keramik dapat digunakan sebagai implan untuk defek pada tulang panjang, digunakan sebagai hip prosthesis implan, penanganan arthrodesis (Fossum et al. 2007), digunakan dalam implantasi untuk operasi spinal dan sebagai pelapis implan berbahan metal untuk keperluan ortopedik (Maxian et al. 1993; Hayashi et al. 1993; Nascimento et al. 2007).
Dalam penelitian ini HA-TKF diaplikasikan sebagai bahan pengisi kerusakan segmental pada tulang panjang tibia. Implan ditanam pada bagian medial diafise tulang dan menunjukkan hasil adanya formasi pertumbuhan tulang yang menggantikan bone graft HA-TKF. Bahan tersebut memiliki laju resorpsi dan degradasi yang lebih cepat dibanding laju pertumbuhan dan pergantian tulangnya. Berdasarkan hasil tersebut bahan HA-TKF tersebut dimungkinkan cocok untuk penanganan defek kecil dan untuk persembuhan yang memerlukan waktu recovery yang cepat. Sedangkan apabila diaplikasikan untuk defek yang cukup besar akan beresiko terjadi pemendekan tulang karena faktor beban mekanik yang akan menekan ruang defek.
