BAB IV. DOGMA SENTRAL BIOLOGI MOLEKULER BAB IV. DOGMA SENTRAL BIOLOGI MOLEKULER
Di dalam bab ini akan dibahas sekilas dogma sentral biologi molekuler sebagai Di dalam bab ini akan dibahas sekilas dogma sentral biologi molekuler sebagai mekanisme pelaksanaan dua dari tiga fungsi DNA sebagai materi genetik, yaitu mekanisme pelaksanaan dua dari tiga fungsi DNA sebagai materi genetik, yaitu fungsi genotipik dan fungsi fenotipik. Dengan mempelajari pokok bahasan ini akan fungsi genotipik dan fungsi fenotipik. Dengan mempelajari pokok bahasan ini akan diperoleh gambaran sekilas mengenai proses replikasi dan ekspresi gen beserta diperoleh gambaran sekilas mengenai proses replikasi dan ekspresi gen beserta pengaturannya, terutama pada kelompok organisme prokariot.
pengaturannya, terutama pada kelompok organisme prokariot.
Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasiswa diharapkan Setelah mempelajari pokok bahasan di dalam bab ini mahasiswa diharapkan mampu menjelaskan
mampu menjelaskan 1.
1. tiga fungsi DNA sebagai materi genetik dan dogma sentral biologi molekuler,tiga fungsi DNA sebagai materi genetik dan dogma sentral biologi molekuler, 2.
2. prinsip dasar replikasi DNA, prinsip dasar replikasi DNA, 3.
3. prinsip dasar transkripsi dan transkrips prinsip dasar transkripsi dan transkripsi balik,i balik, 4.
4. prinsip dasar translasi, dan prinsip dasar translasi, dan 5.
5. prinsip dasar pengaturan ekspresi gen. prinsip dasar pengaturan ekspresi gen.
Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapat mempelajari Pengetahuan awal yang diperlukan oleh mahasiswa agar dapat mempelajari pokok
pokok bahasan bahasan ini deini dengan ngan lebih lebih baik abaik adalah dalah struktur asam struktur asam nukleat, nukleat, khususnya khususnya DNA,DNA, yang telah dijelaskan
yang telah dijelaskan pada Bab III. pada Bab III. Selain itu, konsSelain itu, konsep dasar tentang ep dasar tentang replikasi DNA,replikasi DNA, transkripsi, pranslasi, dan pengaturan ekspresi gen yang telah diperoleh pada mata transkripsi, pranslasi, dan pengaturan ekspresi gen yang telah diperoleh pada mata kuliah Genetika juga sangat mendukung pemahaman materi bahasan di dalam bab ini. kuliah Genetika juga sangat mendukung pemahaman materi bahasan di dalam bab ini.
Fungsi DNA sebagai Materi Genetik Fungsi DNA sebagai Materi Genetik
DNA sebagai materi genetik pada sebagian besar organisme harus dapat DNA sebagai materi genetik pada sebagian besar organisme harus dapat menjalankan tiga macam fungsi pokok berikut ini.
menjalankan tiga macam fungsi pokok berikut ini. 1.
1. DNA harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapatDNA harus mampu menyimpan informasi genetik dan dengan tepat dapat meneruskan informasi tersebut dari tetua kepada keturunannya, dari generasi ke meneruskan informasi tersebut dari tetua kepada keturunannya, dari generasi ke generasi. Fungsi ini merupakan
generasi. Fungsi ini merupakan fungsi genotipik fungsi genotipik , yang dilaksanakan melalui, yang dilaksanakan melalui
replikasi replikasi.. 2.
2. DNA harus mengatur perkembangan fenotipe organisme. Artinya, materi genetik DNA harus mengatur perkembangan fenotipe organisme. Artinya, materi genetik harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi organisme mulai dari zigot harus mengarahkan pertumbuhan dan diferensiasi organisme mulai dari zigot hingga individu dewasa. Fungsi ini merupakan
dilaksanakan melalui ekspresi gen dengan dua tahapan, yaitu transkripsi dan
translasi.
3. DNA sewaktu-waktu harus dapat mengalami perubahan sehingga organisme yang bersangkutan akan mampu beradaptasi dengan kondisi lingkungan yang berubah.
Tanpa perubahan semacam ini, evolusi tidak akan pernah berlangsung. Fungsi ini merupakan fungsi evolusioner, yang dilaksanakan melalui peristiwamutasi.
Di dalam bab ini hanya akan dijelaskan secara singkat fungsi genotipik dan fungsi fenotipik DNA. Mekanisme pelaksanaan kedua fungsi ini sering disebut sebagai dogma sentral genetika molekuler ataudogma sentral biologi molekuler.
transkripsi translasi
replikasi DNA RNA protein
transkripsi balik
Gambar 4.1. Skema dogma sentral biologi molekuler
Replikasi DNA
Replikasi dapat dikatakan juga sebagai sintesis molekul DNA menggunakan molekul DNA sebagai cetakan (template). Enzim utama yang berperan dalam proses replikasi adalah DNA polimerase. Enzim ini hanya dapat bekerja apabila tedapat ujung 3’-OH bebas sehingga diperlukan adanya molekul primer. Oleh karena itu, sebelum enzim DNA polimerase bekerja terlebih dahulu diperlukan enzim primase untuk membetuk molekul primer. Sementara itu, komponen penyusun polimerisasi DNA berupa molekul deoksinukleosida trifosfat (dNTP), yang terdiri atas deoksiadenosin trifosfat (dATP), deoksiguanosin trifosfat (dGTP), deoksisitidin trifosfat (dCTP), dan deoksitimidin trifosfat (dTTP).
Ada tiga cara teoretis replikasi DNA yang pernah diusulkan, yaitu konservatif, semikonservatif, dan dispersif. Pada replikasi konservatif seluruh tangga berpilin DNA awal tetap dipertahankan dan akan mengarahkan pembentukan tangga berpilin baru. Pada replikasi semikonservatif tangga berpilin mengalami pembukaan terlebih dahulu sehingga kedua untai polinukleotida akan saling terpisah. Namun,
masing-masing untai ini tetap dipertahankan dan akan bertindak sebagai cetakan (template) bagi pembentukan untai polinukleotida baru. Sementara itu, pada replikasi dispersif
kedua untai polinukleotida mengalami fragmentasi di sejumlah tempat. Kemudian, fragmen-fragmen polinukleotida yang terbentuk akan menjadi cetakan bagi fragmen nukleotida baru sehingga fragmen lama dan baru akan dijumpai berselang-seling di dalam tangga berpilin yang baru (Gambar 4.2).
Di antara ketiga cara replikasi DNA yang diusulkan tersebut, hanya cara semikonservatif yang dapat dibuktikan kebenarannya melalui percobaan yang dikenal dengan nama sentrifugasi seimbang dalam tingkat kerapatan atau equilibrium density-gradient centrifugation. Prinsip kerja metode ini dapat dilihat pada Bab III. Percobaan pembuktian tersebut dilaporkan hasilnya pada tahun 1958 oleh M.S. Meselson dan F.W. Stahl.
konservatif semikonservatif dispersif
Gambar 4.2. Tiga cara teoretis replikasi DNA = untai lama = untai baru
Replikon, ori, garpu replikasi, dan termini
Setiap molekul DNA yang melakukan replikasi sebagai suatu satuan tunggal dinamakan replikon. Dimulainya (inisiasi) replikasi DNA terjadi di suatu tempat tertentu di dalam molekul DNA yang dinamakan titik awal replikasi atau origin of replication (ori). Proses inisiasi ini ditandai oleh saling memisahnya kedua untai DNA, yang masing-masing akan berperan sebagai cetakan bagi pembentukan untai DNA baru sehingga akan diperoleh suatu gambaran yang disebut sebagai garpu replikasi. Biasanya, inisiasi replikasi DNA, baik pada prokariot maupun eukariot, terjadi dua arah (bidireksional). Dalam hal ini dua garpu replikasi akan bergerak melebar dari ori menuju dua arah yang berlawanan hingga tercapai suatu ujung
(terminus). Pada eukariot, selain terjadi replikasi dua arah, ori dapat ditemukan di beberapa tempat.
Replikasi pada kedua untai DNA
Proses replikasi DNA yang kita bicarakan di atas sebenarnya barulah proses yang terjadi pada salah satu untai DNA. Untai DNA tersebut sering dinamakan untai pengarah (leading strand). Sintesis DNA baru pada untai pengarah ini berlangsung secara kontinyu dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai pengarah dari ujung 3’ ke ujung 5’.
Pada untai DNA pasangannya ternyata juga terjadi sintesis DNA baru dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau bergerak di sepanjang untai DNA cetakannya ini dari ujung 3’ ke ujung 5’. Namun, sintesis DNA pada untai yang satu ini tidak berjalan kontinyu sehingga menghasilkan fragmen terputus-putus, yang masing-masing mempunyai arah 5’→ 3’. Terjadinya sintesis DNA yang tidak kontinyu sebenarnya disebabkan oleh sifat enzim DNA polimerase yang hanya dapat menyintesis DNA dari arah 5’ ke 3’ serta ketidakmampuannya untuk melakukan inisiasi sintesis DNA.
Untai DNA yang menjadi cetakan bagi sintesis DNA tidak kontinyu itu disebut
untai tertinggal (lagging strand). Sementara itu, fragmen-fragmen DNA yang dihasilkan dari sintesis yang tidak kontinyu dinamakan fragmen Okazaki, sesuai dengan nama penemunya. Fragmen-fragmen Okazaki akan disatukan menjadi sebuah untai DNA yang utuh dengan bantuan enzim DNA ligase.
fragmen-fragmen untai tertinggal
3’ Okazaki 5’
5’ 3’ 5’ 3’
untai pengarah
Gambar 4.3. Diagram replikasi pada kedua untai DNA
Transkripsi
Transkripsi merupakan tahap awal ekspresi gen berupa perubahan urutan basa molekul DNA menjadi urutan basa molekul RNA. Dengan perkataan lain, transkripsi merupakan proses sintesis RNA menggunakan salah satu untai molekul DNA sebagai cetakan (templat)nya.
Transkripsi mempunyai ciri-ciri kimiawi yang serupa dengan sintesis/replikasi DNA, yaitu
1. Adanya sumber basa nitrogen berupa nukleosida trifosfat. Bedanya dengan sumber basa untuk sintesis DNA hanyalah pada molekul gula pentosanya yang tidak berupa deoksiribosa tetapi ribosa dan tidak adanya basa timin tetapi digantikan oleh urasil. Jadi, keempat nukleosida trifosfat yang diperlukan adalah adenosin trifosfat (ATP), guanosin trifosfat (GTP), sitidin trifosfat (CTP), dan uridin trifosfat (UTP).
2. Adanya untai molekul DNA sebagai cetakan. Dalam hal ini hanya salah satu di antara kedua untai DNA yang akan berfungsi sebagai cetakan bagi sintesis molekul RNA. Untai DNA ini mempunyai urutan basa yang komplementer dengan urutan basa RNA hasil transkripsinya, dan disebut sebagai pita antisens. Sementara itu, untai DNA pasangannya, yang mempunyai urutan basa sama dengan urutan basa RNA, disebut sebagai pita sens. Meskipun demikian, sebenarnya transkripsi pada umumnya tidak terjadi pada urutan basa di sepanjang salah satu untai DNA. Jadi, bisa saja urutan basa yang ditranskripsi terdapat berselang-seling di antara kedua untai DNA.
4. Gugus 3’- OH pada suatu nukleotida bereaksi dengan gugus 5’- trifosfat pada nukleotida berikutnya menghasilkan ikatan fosofodiester dengan membebaskan dua atom pirofosfat anorganik (PPi). Reaksi ini jelas sama dengan reaksi polimerisasi DNA. Hanya saja enzim yang bekerja bukannya DNA polimerase, melainkan RNA polimerase. Perbedaan yang sangat nyata di antara kedua enzim ini terletak pada kemampuan enzim RNA polimerase untuk melakukan inisiasi sintesis RNA tanpa adanya molekul primer.
Secara garis besar transkripsi berlangsung dalam empat tahap, yaitu pengenalan promoter, inisiasi, elongasi, dan teminasi. Agar molekul DNA dapat digunakan sebagai cetakan dalam sintesis RNA, kedua untainya harus dipisahkan satu sama lain di tempat-tempat terjadinya penambahan basa pada RNA. Selanjutnya, begitu penambahan basa selesai dilakukan, kedua untai DNA segera menyatu kembali. Pemisahan kedua untai DNA pertama kali terjadi di suatu tempat tertentu, yang merupakan tempat pengikatan enzim RNA polimerase di sisi 5’ (upstream) dari urutan basa penyandi (gen) yang akan ditranskripsi. Tempat ini dinamakan
promoter.
Setelah mengalami pengikatan oleh promoter, RNA polimerase akan terikat pada suatu tempat di dekat promoter, yang dinamakan tempat awal polimerisasi
atau tapak inisiasi (initiation site). Tempat ini sering dinyatakan sebagai posisi +1 untuk gen yang akan ditranskripsi. Nukleosida trifosfat pertama akan diletakkan di tapak inisiasi dan sintesis RNA pun segera dimulai.
Pengikatan enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya pada untai DNA cetakan membentuk kompleks transkripsi. Selama sintesis RNA berlangsung kompleks transkripsi akan bergeser di sepanjang molekul DNA cetakan sehingga nukleotida demi nukleotida akan ditambahkan kepada untai RNA yang sedang diperpanjang pada ujung 3’ nya. Jadi, elongasi atau polimerisasi RNA berlangsung dari arah 5’ ke 3’, sementara RNA polimerasenya sendiri bergerak dari arah 3’ ke 5’ di sepanjang untai DNA cetakan.
Berakhirnya polimerisasi RNA ditandai oleh disosiasi kompleks transkripsi atau terlepasnya enzim RNA polimerase beserta kofaktor-kofaktornya dari untai DNA
cetakan. Begitu pula halnya dengan molekul RNA hasil sintesis. Hal ini terjadi ketika RNA polimerase mencapai urutan basa tertentu yang disebut denganterminator.
Terminasi transkripsi dapat terjadi oleh dua macam sebab, yaitu terminasi yang hanya bergantung kepada urutan basa cetakan (disebut terminasi diri) dan terminasi yang memerlukan kehadiran suatu protein khusus (protein rho). Di antara keduanya terminasi diri lebih umum dijumpai. Terminasi diri terjadi pada urutan basa
palindrom yang diikuti oleh beberapa adenin (A). Urutan palindrom adalah urutan yang sama jika dibaca dari dua arah yang berlawanan. Oleh karena urutan palindom ini biasanya diselingi oleh beberapa basa tertentu, maka molekul RNA yang dihasilkan akan mempunyai ujung terminasi berbentuk batang dan kala (loop) seperti pada Gambar 4.4.
Inisiasi transkripsi tidak harus menunggu selesainya transkripsi sebelumnya. Hal ini karena begitu RNA polimerase telah melakukan pemanjangan 50 hingga 60 nukleotida, promoter dapat mengikat RNA polimerase yang lain. Pada gen-gen yang ditranskripsi dengan cepat reinisiasi transkripsi dapat terjadi berulang-ulang sehingga gen tersebut akan terselubungi oleh sejumlah molekul RNA dengan tingkat penyelesaian yang berbeda-beda.
urutan penyela 5‘ 3‘ ATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTT TTT TT DNA TAATTTCCGAGGAAAACCTCGGAAAAAAAA 3‘ 5‘ transkripsi U U U U C G C G U A C G G C G C A U A U 5’ A U 3’ A U U U U U U U
Gambar 4.4 Terminasi sintesis RNA menghasilkan ujung berbentuk batang dan kala
Transkripsi balik
Pada beberapa virus tertentu, yang materi genetiknya berupa RNA, proses ekspresi gen tetap berlangsung melalui transkripsi dan translasi. Dengan demikian, keberadaan molekul DNA tetap diperlukan sehingga RNA sebagai materi genetik terlebih dahulu harus diubah menjadi DNA. Proses penyalinan RNA menjadi DNA disebut sebagai transkripsi balik (reverse transcription) dan enzim utama yang mengatalisis proses tersebut adalah enzim transkriptase balik (reverse transcriptase). DNA hasil transkripsi balik disebut sebagai DNA komplementer (cDNA), yang dapat berupa molekul untai tunggal atau untai ganda.
Proses transkripsi balik, selain terjadi secara alami pada virus dengan materi genetik berupa RNA (retrovirus), dapat juga dilakukan secara in vitro seperti halnya pada pembuatan perpustakaan cDNA (lihat Bab VI). Oleh karena cDNA merupakan
hasil transkripsi balik RNA, khususnya mRNA, maka ukurannya lebih pendek daripada DNA. Hal ini terutama terlihat pada cDNA organisme eukariot, yang hanya mengandung urutan basa intron.
Tujuan mengonversi mRNA menjadi cDNA adalah karena DNA sifatnya lebih stabil daripada RNA. Jika seorang peneliti ingin mengekspresikan suatu protein spesifik dari sistem eukariot di dalam sel yang tidak lazim memproduksi protein tersebut, maka cara sederhana yang dapat dilakukan adalah mentransfer cDNA yang menyandi protein tersebut ke dalam sel resipien sebagai sel inang (lihat Bab V).
Enzim transkriptase balik ditemukan oleh Howard Temin dan David Baltimore secara terpisah pada tahun 1970, tidak lama setelah penemuan enzim restriksi. Saat ini enzim transkriptase balik telah diproduksi secara komersial. Ketersediaan enzim transkriptase balik ini telah memberikan kemudahan bagi para peneliti untuk mempelajari gen yang bertanggung jawab terhadap pemunculan sifat-sifat tertentu.
Meskipun demikian, enzim transkriptase balik sebenarnya bukanlah merupakan katalisator yang efektif. Selama satu periode transkripsi setidaknya terdapat rata-rata 10 kesalahan, yang relatif lebih parah bila dibandingkan dengan kesalahan pada replikasi normal. Hal ini karena proses transkripsi normal mempunyai mekanisme koreksi yang mengurangi frekuensi kesalahan transkripsi.
Translasi
Bila dibandingkan dengan transkripsi, translasi merupakan proses yang lebih rumit karena melibatkan fungsi berbagai makromolekul. Oleh karena kebanyakan di antara makromolekul ini terdapat dalam jumlah besar di dalam sel, maka sistem translasi menjadi bagian utama mesin metabolisme pada tiap sel. Makromolekul yang harus berperan dalam proses translasi tersebut meliputi
1. Lebih dari 50 polipeptida serta 3 hingga 5 molekul RNA di dalam tiap ribosom 2. Sekurang-kurangnya 20 macam enzim aminoasil-tRNA sintetase yang akan
mengaktifkan asam amino
3. Empat puluh hingga 60 molekul tRNA yang berbeda
4. Sedikitnya 9 protein terlarut yang terlibat dalam inisiasi, elongasi, dan terminasi polipeptida.
Translasi, atau pada hakekatnya sintesis protein, berlangsung di dalam ribosom, suatu struktur organel yang banyak terdapat di dalam sitoplasma. Ribosom terdiri atas dua subunit, besar dan kecil, yang akan menyatu selama inisiasi translasi dan terpisah ketika translasi telah selesai. Ukuran ribosom sering dinyatakan atas dasar laju pengendapannya selama sentrifugasi sebagai satuan yang disebutsatuan Svedberg (S). Pada kebanyakan prokariot ribosom mempunyai ukuran 70S, sedangkan pada eukariot biasanya sekitar 80S.
Tiap ribosom mempunyai dua tempat pengikatan tRNA, yang masing-masing dinamakan tapak aminoasil (tapak A) dan tapak peptidil (tapak P). Molekul aminoasil-tRNA yang baru memasuki ribosom akan terikat di tapak A, sedangkan molekul tRNA yang membawa rantai polipeptida yang sedang diperpanjang terikat di tapak P.
Gambaran penting sintesis protein adalah bahwa proses ini berlangsung dengan arah tertentu sebagai berikut.
1. Molekul mRNA ditranslasi dengan arah 5’→ 3’, tetapi tidak dari ujung 5’ hingga ujung 3’.
2. Polipeptida disintesis dari ujung amino ke ujung karboksil dengan menambahkan asam-asam amino satu demi satu ke ujung karboksil. Sebagai contoh, sintesis
protein yang mempunyai urutan NH2-Met-Pro- . . . -Gly-Ser-COOH pasti dimulai dengan metionin dan diakhiri dengan serin.
Mekanisme sintesis protein secara skema garis besar dapat dilihat pada Gambar 4.5. Sebuah molekul mRNA akan terikat pada permukaan ribosom yang kedua subunitnya telah bergabung. Pengikatan ini terjadi karena pada mRNA prokariot terdapat urutan basa tertentu yang disebut sebagai tempat pengikatan ribosom
(ribosom binding site) atau urutan Shine-Dalgarno. Sementara itu, pada eukariot pengikatan ribosom dilakukan oleh ujung 5’ mRNA. Selanjutnya, berbagai aminoasil-tRNA akan berdatangan satu demi satu ke kompleks ribosom-mRNA ini dengan urutan sesuai dengan antikodon dan asam amino yang dibawanya. Urutan ini ditentukan oleh urutan triplet kodon pada mRNA. Ikatan peptida terbentuk di antara asam-asam amino yang terangkai menjadi rantai polipeptida di tapak P ribosom. Penggabungan asam-asam amino terjadi karena gugus amino pada asam amino yang baru masuk berikatan dengan gugus karboksil pada asam amino yang terdapat pada
rantai polipeptida yang sedang diperpanjang. Penjelasan tentang mekanisme sintesis protein yang lebih rinci disertai contoh, khususnya pada prokariot, akan diberikan di bawah ini.
arah gerakan ribosom
ribosom 5’ CUG GGG 3’ mRNA GAC tRNA aminoasil-tRNA aa aa NH2 NH2 COOH ikatan peptida
Gambar 4.5. Skema garis besar sintesis protein
Inisiasi sintesis protein dilakukan oleh aminoasil-tRNA khusus, yaitu tRNA yang membawa metionin (dilambangkan sebagai metionil-tRNAiMet). Hal ini berarti
AUC ACC UAG UGG
aa aa COOH aa
bahwa sintesis semua polipeptida selalu dimulai dengan metionin. Khusus pada prokariot akan terjadi formilasi gugus amino pada metionil-tRNAi Met (dilambangkan sebagai metionil-tRNAf Met) yang mencegah terbentuknya ikatan peptida antara gugus
amin tersebut dengan gugus karboksil asam amino pada ujung polipetida yang sedang diperpanjang sehingga asam amino awal pada polipeptida prokariot selalu berupa f-metionin. Pada eukariot metionil-tRNAi Met tidak mengalami formilasi gugus amin, tetapi molekul ini akan bereaksi dengan protein-protein tertentu yang berfungsi sebagai faktor inisiasi (IF-1, IF-2, dan IF-3). Selain itu, baik pada prokariot maupun eukariot, terdapat pula metionil-tRNA yang metioninnya bukan merupakan asam amino awal (dilambangkan sebagaimetionil-tRNAMet).
Kompleks inisiasi pada prokariot terbentuk antara mRNA, metionil-tRNA f Met , dan subunit kecil ribosom (30S) dengan bantuan protein IF-1, IF-2, dan IF-3, serta sebuah molekul GTP. Pembentukan kompleks inisiasi ini diduga difasilitasi oleh perpasangan basa antara suatu urutan di dekat ujung 3’ rRNA berukuran 16S dan
sebagian urutan pengarah (leader sequence) pada mRNA. Selanjutnya, kompleks inisiasi bergabung dengan subunit besar ribosom (50S), dan metionil-tRNA f Met terikat pada tapak P. Berpasangannya triplet kodon inisiasi pada mRNA dengan antikodon pada metionil-tRNA f Met di tapak P menentukan urutan triplet kodon dan
aminoasil-tRNA f Met berikutnya yang akan masuk ke tapak A. Pengikatan aminoasil-tRNA f Met berikutnya, misalnya alanil- tRNAala, ke tapak A memerlukan protein-protein elongasi EF-Tsdan EF-Tu. Pembentukan ikatan peptida antara gugus karboksil pada metionil-tRNA f Met di tapak P dan gugus amino pada alanil-tRNAala di tapak A dikatalisis oleh enzim peptidil transferase, suatu enzim yang terikat pada subunit ribosom 50S. Reaksi ini menghasilkan dipeptida yang terdiri atas f-metionin dan alanin yang terikat pada tRNAaladi tapak A.
Langkah berikutnya adalah translokasi, yang melibatkan (1) perpindahan f-met-ala- tRNAala dari tapak A ke tapak P dan (2) pergeseran posisi mRNA pada ribosom sepanjang tiga basa sehingga triplet kodon yang semula berada di tapak A masuk ke tapak P. Dalam contoh ini triplet kodon yang bergeser dari tapak A ke P tersebut adalah triplet kodon untuk alanin. Triplet kodon berikutnya, misalnya penyandi serin,
akan masuk ke tapak A dan proses seperti di atas hingga translokasi akan terulang kembali. Translokasi memerlukan aktivitas faktor elongasi berupa enzim yang biasa dilambangkan denganEF-G.
Pemanjangan atau elongasi rantai polipeptida akan terus berlangsung hingga suatu tripet kodon yang menyandi terminasi memasuki tapak A. Sebelum suatu rantai polipeptida selesai disintesis terlebih dahulu terjadi deformilisasi pada f-metionin menjadi metionin. Terminasi ditandai oleh terlepasnya mRNA, tRNA di tapak P, dan rantai polipeptida dari ribosom. Selain itu, kedua subunit ribosom pun memisah. Pada terminasi diperlukan aktivitas dua protein yang berperan sebagai faktor pelepas atau releasing factors, yaitu RF-1dan RF-2.
Sesungguhnya setiap mRNA tidak hanya ditranslasi oleh sebuah ribosom. Pada umumnya sebuah mRNA akan ditranslasi secara serempak oleh beberapa ribosom yang satu sama lain berjarak sekitar 90 basa di sepanjang molekul mRNA. Kompleks translasi yang terdiri atas sebuah mRNA dan beberapa ribosom ini dinamakan
poliribosom atau polisom. Besarnya polisom sangat bervariasi dan berkorelasi dengan ukuran polipeptida yang akan disintesis. Sebagai contoh, rantai hemoglobin yang tersusun dari sekitar 150 asam amino disintesis oleh polisom yang terdiri atas lima buah ribosom (pentaribosom).
Pada prokariot translasi seringkali dimulai sebelum transkripsi berakhir. Hal ini dimungkinkan terjadi karena tidak adanya dinding nukleus yang memisahkan antara transkripsi dan translasi. Dengan berlangsungnya kedua proses tersebut secara bersamaan, ekspresi gen menjadi sangat cepat dan mekanisme nyala-padam (turn on-turn off) ekspresi gen, seperti yang akan dijelaskan nanti, juga menjadi sangat efisien.
Namun, tidak demikian halnya pada eukariot. Transkripsi terjadi di dalam nukleus, sedangkan translasi terjadi di sitoplasma (ribosom). Pertanyaan yang muncul adalah bagaimana mRNA hasil transkripsi dipindahkan dari nukleus ke sitoplasma, faktor-faktor apa yang menentukan saat dan tempat translasi? Sayangnya, hingga kini kita belum dapat menjawab pertanyaan-pertanyaan tersebut dengan memuaskan. Kita baru mengetahui bahwa transkripsi dan translasi pada eukariot jauh lebih rumit daripada proses yang ada pada prokariot. Salah satu di antaranya seperti telah kita
bicarakan di atas, yaitu bahwa mRNA hasil transkripsi (transkrip primer) pada eukariot memerlukan prosesing terlebih dahulu sebelum da pat ditranslasi.
Pengaturan Eskpresi Gen
Produk-produk gen tertentu seperti protein ribosomal, rRNA, tRNA, RNA polimerase, dan enzim-enzim yang mengatalisis berbagai reaksi metabolisme yang berkaitan dengan fungsi pemeliharaan sel merupakan komponen esensial bagi semua sel. Gen-gen yang menyandi pembentukan produk semacam itu perlu diekspresikan terus-menerus sepanjang umur individu di hampir semua jenis sel tanpa bergantung kepada kondisi lingkungan di sekitarnya. Sementara itu, banyak pula gen lainnya yang ekspresinya sangat ditentukan oleh kondisi lingkungan sehingga mereka hanya akan diekspresikan pada waktu dan di dalam jenis sel tertentu. Untuk gen-gen semacam ini harus ada mekanisme pengaturan ekspresinya.
Pengaturan ekspresi gen dapat terjadi pada berbagai tahap, misalnya transkripsi, prosesing mRNA, atau translasi. Namun, sejumlah data hasil penelitian menunjukkan bahwa pengaturan ekspresi gen, khususnya pada prokariot, paling banyak terjadi pada
tahap transkripsi.
Pengaturan ekspresi gen pada prokariot
Pengaturan ekspresi gen pada sistem prokariot telah banyak diungkapkan berdasarkan hasil penelitian mengenai induksi dan represi menggunakan Escherichia coli dan Salmonella typhimurium. Mekanisme molekuler induksi dan represi telah dapat dijelaskan menurut model operon yang diajukan oleh F. Jacob dan J. Monod pada tahun 1961.
Menurut model yang dikenal sebagai operon ini ada dua unsur yang mengatur transkripsi gen struktural penyandi enzim, yaitu gen regulator (gen represor) dan
operator yang letaknya berdekatan dengan gen-gen struktural yang diaturnya. Gen regulator menyandi pembentukan suatu protein yang dinamakan represor. Pada kondisi tertentu represor akan berikatan dengan operator, menyebabkan terhalangnya transkripsi gen-gen struktural. Hal ini terjadi karena enzim RNA polimerase tidak dapat memasuki promoter yang letaknya berdekatan, atau bahkan tumpang tindih,
dengan operator. Secara keseluruhan setiap operon terdiri atas promoter operon atau promoter bagi gen-gen struktural (PO), operator (O), dan gen-gen struktural (GS). Di luar operon terdapat gen regulator (R) beserta promoternya (PR), molekul protein represor yang dihasilkan oleh gen regulator, dan molekul efektor. Molekul efektor pada induksi adalah induser, sedangkan pada represi adalah korepresor.
operon
PR R PO O GS1 GS2 GS3
represor efektor (induser atau korepresor)
a)
RNA polimerase
induser
RNA polimerase berjalan
transkripsi kompleks represor-induser
translasi
b)
RNA polimerase berjalan
transkripsi korepresor
translasi
kompleks represor-korepresor
c)
Gambar 4.6. Model operon untuk pengaturan ekspresi gen a) komponen operon b) induksi c) represi
Pada Gambar 4.6 terlihat bahwa terikatnya represor pada operator terjadi dalam keadaan yang berkebalikan antara induksi dan represi. Pada induksi represor secara normal akan berikatan dengan operator sehingga RNA polimerase tidak dapat memasuki promoter operon. Akibatnya, transkripsi gen-gen struktural tidak dapat berlangsung. Namun, dengan terikatnya represor oleh induser, promoter operon
menjadi terbuka bagi RNA polimerase sehingga gen-gen struktural dapat ditranskripsi dan selanjutnya ditranslasi. Dengan demikian, gen-gen struktural akan diekspresikan apabila terdapat molekul induser yang mengikat represor.
Operon yang terdiri atas gen-gen yang ekspresinya terinduksi dinamakan
operon induksi. Salah satu contohnya adalah operon lac, yang terdiri atas gen-gen penyandi enzim pemecah laktosa seperti telah disebutkan di atas.
Sebaliknya, pada represi secara normal represor tidak berikatan dengan operator sehingga RNA polimerase dapat memasuki promoter operon dan transkripsi gen-gen struktural dapat terjadi. Akan tetapi, dengan adanya korepresor, akan terbentuk kompleks represor-korepresor yang kemudian berikatan dengan operator. Dengan pengikatan ini, RNA polimerase tidak dapat memasuki promoter operon sehingga transkripsi gen-gen struktural menjadi terhalang. Jadi, ekspresi gen-gen struktural akan terepresi apabila terdapat molekul korepresor yang berikatan dengan represor.
Gen-gen yang ekspresinya dapat terepresi merupakan komponen operon yang dinamakan operon represi. Operon trp, yang terdiri atas gen-gen penyandi enzim untuk biosintesis triptofan merupakan contoh operon represi.
Pengaturan ekspresi gen pada eukariot
Hingga sekarang kita baru sedikit sekali mengetahui mekanisme pengaturan ekspresi gen pada eukariot. Namun, kita telah mengetahui bahwa pada eukariot tingkat tinggi gen-gen yang berbeda akan ditranskripsi pada jenis sel yang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa mekanisme pengaturan pada tahap transkripsi, dan juga prosesing mRNA, memegang peran yang sangat penting dalam proses diferensiasi
sel.
Operon, kalau pun ada, nampaknya tidak begitu penting pada eukariot. Hanya pada eukariot tingkat rendah seperti jamur dapat ditemukan satuan-satuan operon atau
mirip operon. Semua mRNA pada eukariot tingkat tinggi adalah monosistronik, yaitu hanya membawa urutan sebuah gen struktural. Transkrip primer yang adakalanya menyerupai polisistronik pun akan diproses menjadi mRNA yan g monosistronik.
Berbagai macam sinyal seperti molekul-molekul sitoplasmik, hormon, dan rangsangan dari lingkungan memicu dimulainya pembacaan program-program dengan urutan tertentu pada waktu dan tempat yang tepat selama perkembangan individu. Bukti paling nyata mengenai adanya keharusan urutan pembacaan program pada waktu dan tempat tertentu dapat dilihat pada kasus mutasi yang terjadi pada lalat Drosophila, misalnya munculnya sayap di kepala di tempat yang seharusnya untuk
mata. Dengan mempelajari mutasi-mutasi semacam ini diharapkan akan diperoleh pengetahuan tentang mekanisme pengaturan ekspresi gen selama perkembangan
normal individu.
Pada eukariot tingkat tinggi kurang dari 10 persen gen yang terdapat di dalam seluruh genom akan terepresentasikan urutan basanya di antara populasi mRNA yang telah mengalami prosesing. Sebagai contoh, hanya ada dua hingga lima persen urutan DNA mencit yang akan terepresentasikan pada mRNA di dalam sel-sel hatinya. Demikian pula, mRNA di dalam sel-sel otak katak Xenopus hanya merepresentasikan delapan persen urutan DNAnya. Jadi, sebagian besar urutan basa DNA di dalam genom eukariot tingkat tinggi tidak terepresentasikan di antara populasi mRNA yang ada di dalam sel atau jaringan tertentu. Dengan perkataan lain, molekul mRNA yang dihasilkan dari perangkat gen yang berbeda akan dijumpai di dalam sel atau jaringan yang berbeda pula.
SOAL EVALUASI
1. a. Komponen manakah yang menentukan spesifisitas suatu molekul asam nukleat? b. Apakah perbedaan antara nukleotida dan nuk leosida?
c. Sebutkan macam-macam ikatan yang terdapat pada molekul DNA.
2. Jika suatu molekul RNA mengandung basa adenin sebanyak 20%, dapatkah Saudara menghitung persentase ketiga basa lainnya? Jelaskan jawaban Saudara. 3. Suatu untai molekul DNA mempunyai sekuens 5‘- AGTTGCAGCCTACGT-3‘.
Bagaimanakah sekuens untai pasangannya?
4. a. Fenomena apakah yang menyebabkan stabilitas molekul DNA?
b. Apakah yang terjadi jika asam nukleat berada di dalam suasana asam mineral encer?
c. Apakah yang dimaksud dengan pernyataan bahwa molekul DNA mempunyai nisbah aksial yang tinggi?
d. Setelah dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan tinggi di dalam larutan CsCl 8M, bagaimanakah pemisahan molekul DNA, RNA, dan protein?
5. a. Mengapa pengukuran konsentrasi larutan DNA dilakukan pada λ260 nm?
b. Apakah artinya jika hasil pengukuran kemurnian larutan DNA memberikan nilai nisbah A260/ A280 kurang dari 1,8?
c. Apakah yang dimaksud dengan titik leleh (melting temperature) molekul DNA? d. Apakah manfaat senyawa interkalator etidium bromid?
KUNCI JAWABAN
1. a. Basa nitrogen (basa nukleotida).
b. Nukleotida = fosfat + gula + basa; nukleosida = gula + basa. Jadi, nukleotida = nukleosida monofosfat.
c. Ikatan glikosidik (glikosilik), ikatan fosfodiester, ikatan hidrogen.
2. Tidak bisa karena molekul RNA merupakan polinukleotida untai tunggal. Jadi, persentase A tidak sama dengan persentase T sehingga kandungan basa T, G, dan
C tidak dapat dihitung bedasarkan kandungan basa A. 3. 5‘- ACGTAGGCTGCAACT - 3‘.
4. a. Interaksi penempatan (stacking interactions) antara pasangan-pasangan basa. Permukaan basa yang bersifat hidrofobik menyebabkan molekul-molekul air
dikeluarkan dari sela-sela perpasangan basa sehingga perpasangan tersebut menjadi kuat.
b. Ikatan glikosilik antara gula dan basa terputus.
c. Perbandingan antara panjang dan diameternya sangat tinggi sehingga molekul DNA sangat tipis memanjang.
d. DNA di tengah, RNA di bawah, protein di atas.
5. a. Absorpsi maksimum sinar UV oleh DNA terjadi pada panjang gelombang 260 nm.
b. Larutan DNA terkontaminasi oleh protein.
c. Suhu ketika molekul DNA mulai mengalami denaturasi, yang merupakan fungsi kandungan GC.
