KERAGAMAN GENETIK NILAM (Pogostemon cablin Benth) YANG DIBUDIDAYAKAN DI BALI BERDASARKAN MARKA RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD)

i

TESIS

KERAGAMAN GENETIK NILAM (Pogostemon cablin

Benth) YANG DIBUDIDAYAKAN DI BALI

BERDASARKAN MARKA RANDOM AMPLIFIED

POLYMORPHIC DNA (RAPD)

I PUTU CANDRA NIM : 08.908.61002

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

ii

TESIS

KERAGAMAN GENETIK NILAM (Pogostemon cablin

Benth) YANG DIBUDIDAYAKAN DI BALI

BERDASARKAN MARKA RANDOM AMPLIFIED

POLYMORPHIC DNA (RAPD)

Tesis ini untuk Memperoleh Gelar Megister

pada Program Studi Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana Universitas Udayana

I PUTU CANDRA NIM : 08.908.61002

PROGRAM MAGISTER

PROGRAM STUDI BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

PROGRAM PASCASARJANA

UNIVERSITAS UDAYANA

DENPASAR

iii

Lembar Pengesahan

TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL 1 Juli 2011

Pembimbing I,

Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, MP NIP. 19621009 198803 1 002

Pembimbing II,

Dr. Ir. Made Pharmawati, MSc NIP 19680707 199303 2 001

Mengetahui

Ketua Program Bioteknologi Pertanian Program Pascasarjana

Universitas Udayana,

Dr. G. N. Alit Susanta Wirya, SP. MAgr NIP 19680115 199403 1 001

Direktur Program Pascasarjana

Universitas Udayana

Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K) NIP. 19590215 198510 2 001

iv

Penetapan Panitia Penguji Tesis

Tesis ini Telah Diuji pada Tanggal 1 Juli 2011.

Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No.: 1153/UN14.4/HK/2011,Tanggal 21 Juni 2011

Ketua : Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, MP Anggota :

1. Dr. Ir. Made Pharmawati, MSc 2. Prof. Dr. Ir. Made Sudana, MS

3. Dr. G. N. Alit Susanta Wirya, SP. MAgr 4. Ir. Dewa Nyoman Nyana, MSi

v

UCAPAN TERIMA KASIH

Pertama – tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa/Tuhan Yang Maha Esa, karena hanya atas asung wara nugraha-Nya/kurnia-Nya, tesis ini dapat diselesaikan.

Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada;

1. Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. I Made Bakta, Sp.PD.(KHOM) atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan program magister di Universitas Udayana.

2. Prof. Dr. Ir. I Gede Rai Maya Temaja, MP pembimbing utama yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan, semangat, bimbingan dan saran selama penulis mengikuti program magister, khususnya dalam penyelesaian tesis ini.

3. Dr. Ir. Made Pharmawati, MSc, pembimbing II yang telah memberikan bimbingan dengan penuh perhatian dan kesabaran dalam pelaksanaan penelitian, penulisan dan memberikan bantuan primer, DNA ladder, serta beberapa zat kimia lainnya.

4. Direktur Program Pascasarjana yang dijabat oleh Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp.S(K) dan Ketua Program Bioteknologi Pertanian Dr. G. N. Alit Susanta Wirya, SP. MAgr atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa program magister pada Program Pascasarjana Universitas Udayana.

5. Kepala Laboratorium Bioteknologi dan Kepala Laboratorium Marine Universitas Udayana Denpasar, atas bantuan fasilitasnya dalam melakukan análisis laboratorium.

6. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan pula kepada para penguji tesis, yaitu Prof. Dr. Ir. Made Sudana, MS., Dr. G. N. Alit Susanta Wirya, SP. MAgr dan Ir. Dewa Nyoman Nyana, MSi yang telah memberikan masukan, saran, sanggahan, dan koreksi sehingga tesis ini dapat terwujud seperti ini.

vi

7. Juga penulis ucapkan terima kasih kepada seluruh keluarga yang dengan penuh pengorbanan telah memberikan kepada penulis kesempatan untuk lebih berkonsentrasi menyelesaikan tesis ini.

Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa/ Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmat-Nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan dan penyelesaian tesis ini.

vii

KERAGAMAN GENETIK NILAM (Pogostemon cablin Benth)

YANG DIBUDIDAYAKAN DI BALI BERDASARKAN MARKA

RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA (RAPD)

ABSTRAK

Tanaman nilam umumnya diperbanyak secara vegetatif. sehingga keragaman genetiknya cenderung rendah. Nilam yang dibudidayakan di Bali keragaman genetiknya belum jelas dan produktivitasnya beragam. Untuk melihat keragaman genetiknya, maka perlu dilakukan pengujian secara molekuler.

Tujuh dekamer primer telah dicobakan dalam reaksi RAPD. Hasil amplifikasi dari tiga primer (OPF11, UBC 106, dan UBC 127) tidak konsisten, sehingga tidak diikutkan dalam analisis selanjutnya untuk mencegah kesalahan penentuan polimorfisme. Empat primer (OPA 04, OPD 11, OPD 14 dan UBC 250) menghasilkan 4 sampai 8 pola pita dengan ukuran 100 - 2375 bp. Tingkat keinformatifan dari primer (PIC) berkisar dari 0,68 – 0,87. Hasil analisis pengelompokan dengan UPGMA (MEGA 5. 01), menunjukkan bahwa nilam yang dibudidayakan di Bali semuanya sekelompok dengan nilam Aceh (Pogostemon cablin Benth).

Secara morfologi dan molekuler nilam yang dibudidayakan di Bali memiliki kekerabatan dengan nilam Aceh dengan jarak genetik dari 0,087 - 0,304.

viii

GENETICS DIVERSITY OF PATCHOULI (Pogostemon cablin Benth) WHICH CULTIVATED IN BALI WITH RANDOM AMPLIFIED

POLYMORPHIC DNA (RAPD) MARKERS

ABSTRACT

Patchouli plant is generally multiplied by vegetative propagation, so that it has low genetic diversity. Patchouli plant cultivated in Bali has unclear genetic diversity and the productivity vary greatly. To evaluation its genetic diversity, molecular examination is needed.

Seven decamer primers have been employed in RAPD reaction. Three primers (OPF 11, UBC 106, and UBC 127) did not show consistence amplification. Therefore they were not included in further analysis to avoid any mistakes in determination of polymorphic band. Four primers (OPA 04, OPD 11, OPD 14 and UBC250) yielding 4 to 8 band pattern of the size 100 - 2375 bp. Polymorphic information content (PIC) range from 0,68 - 0,87. Result of cluster analysis with UPGMA (MEGA- 5.01), indicated that patchouli plant cultivated in Bali are grouped with Pogostemon cablin Benth

Based on morphology and molecular the patchouli plants cultivated in Bali have relationship with Pogostemon cablin Benth with genetic distance analysis from 0,087 - 0,304.

ix RINGKASAN

Tiga jenis tanaman nilam yang tumbuh di Indonesia dapat dibedakan antara lain dari karakter morfologi, kandungan dan kualitas minyak serta ketahanan terhadap cekaman biotik dan abiotik. Ketiga jenis nilam tersebut; nilam Aceh (Pogostemon cablin Benth.), nilam Jawa (P. heyneanus Benth.) dan Nilam Sabun (P. hortensis Becker). Yang paling luas penyebarannya dan banyak dibudidayakan yaitu nilam Aceh, karena kadar minyak dan kualitasnya lebih tinggi dari kedua jenis yang lainnya (Nuryani. 2006a).

Nilam Aceh memiliki tiga varietas unggul yaitu; varietas Lhokseumawe, Sidikalang dan Tapak Tuan (Nuryani, 2006a). Nilam Tapak Tuan unggul dalam produksi dan kadar patchouli alkohol. Nilam Lhokseumawe kadar minyaknya tinggi sedangkan nilam Sidikalang toleran terhadap penyakit layu bakteri dan nematoda.

Tanaman nilam yang dibudidayakan di Bali secara genetis belum jelas keragaman genetiknya, semuanya dinyatakan sebagai nilam Aceh. Untuk memastikan varietas tanaman tersebut dan untuk melihat keragaman genetiknya, maka perlu dilakukan pengujian secara molekuler. Salah satu metode yang dapat dilakukan adalah dengan menggunkan marka RAPD. RAPD digunakan untuk mengidentifikasi genotipe tanaman karena memiliki kelebihan dalam pelaksanaan dan analisis (Suryanto, 2003). Prosedur RAPD lebih mudah, murah, cepat dan contoh DNA yang diperlukan sedikit (0,5 – 50 ng) serta tidak memerlukan radioisotop (Sharma, et al., 2008). Marka RAPD juga mampu menghasilkan karakter yang relatif tidak terbatas sehingga sangat membantu dalam analisis keragaman organisme yang tidak diketahui latar belakang genomnya (Suryanto, 2003).

Isolasi DNA nilam dilakukan dengan metode yang dikembangkan Khanuja et al. (1999). Reaksi PCR dilakukan sebanyak 35 siklus. Pemanasan pertama pada suhu 940C selama 5 menit, diikuti oleh 35 siklus yang terdiri atas denaturasi 1 menit pada suhu 940C, annealing 3 menit pada suhu 350C, dan 2 menit ekstensi pada suhu 720C. Setelah 35 siklus selesai, kemudian diikuti 7 menit pada suhu 720C dan pendinginan selama 30 menit.

Hasil amplifikasi dielektroforesis pada gel agarosa 2,0 % dalam buffer TAE (Tris-Asetat EDTA) selama 50 menit pada 100 V. Pola RAPD ini digunakan untuk analisis pengelompokan dengan metode Unweighted Pair Group Methods Arithmatic Average (UPGMA) menggunakan software MEGA 5-01.

Hasil penelitian menunjukkan morfologi tanaman nilam yang dibudidayakan di beberapa daerah di Bali adalah; bentuk daun agak bulat telur dengan warna hijau sampai hijau pucat keunguan dan petulangan daun menyirip. Ujung daun meruncing dengan pangkal daun rata membulat. Tepi daun bergerigi ganda dan pada permukaan daun terdapat bulu yang lembut. Hal ini sangat berbeda dengan nilam Jawa yang memiliki karakteristik morfologi bentuk daun agak bulat telur, tepi daun bergerigi runcing, dengan ujung daun meruncing. warna daun hijau, petulangan daun menyirip, dengan permukaan daun kasar.

Tujuh dekamer primer dari sekuen acak digunakan pada 16 nilam dalam suatu reaksi RAPD. Empat dari tujuh primer mengamplifikasi DNA pada semua sampel. Hasil amplifikasi dari tiga primer (OPF 11, UBC 106, dan UBC 127) tidak konsisten dalam mengamplifikasi DNA. Primer OPF11 menghasilkan

x

produk amplifikasi hanya pada salah satu sampel DNA sedangkan UBC 106 dan UBC 127 tidak menghasilkan produk amplifikasi. Ketiga primer ini tidak diikutkan dalam analisis selanjutnya untuk mencegah kesalahan penentuan polimorfisme yang disebabkan oleh kegagalan rekasi PCR.

Empat primer (OPA 04, OPD 11, OPD 14 dan UBC 250) menghasilkan 262 produk amplifikasi yang berbeda. Masing – masing primer menghasilkan 44 sampai 114 fragmen DNA. Dari empat primer tersebut menghasilkan 4 sampai 8 pola pita dengan ukuran 100 - 2375 bp.

Analisis filogeni menunjukkan bahwa dengan empat primer +++nilam yang dibudidayakan di beberapa daerah di Bali dapat dikelompokan. Nilam yang dibudidayakan di daerah Pupuan, Nungnung, Mekar Sari dan Mengwi berada dalam satu kelompok dengan jarak genetik 0,043 - 0,130. Sedangkan nilam Sidan dan Abiansemal yang berada dalam satu kelompok, memiliki jarak genetik 0.087. Kedua kelompok tersebut lebih mirip dengan nilam Lhokseumawe (jarak genetik 0,087 - 0,130), dibandingkan dengan nilam Tapak Tuan (jarak genetik 0,174 – 0,304) dan Sidikalang (jarak genetik 0.174 - 0,261). Namun secara filogeni tanaman nilam tersebut berada diluar kelompok Lhokseumawe. Nilam di daerah Lemukih dan daerah Plaga berada dalam satu kelompok serta memiliki jarak genetik 0,087 dengan nilam Tapak Tuan dan nilam Lhokseumawe. Nilam yang dibudidayakan di Wanagiri dan Jegu satu kelompok dengan nilam Sidikalang dengan jarak genetik 0,130. Nilam yang dibudidayakan di daerah Belok satu kelompok dengan nilam yang dibudidayakan di daerah Lukluk dengan jarak genetik 0,174. Kedua nilam ini memiliki jarak genetik 0,217 – 0,304 dengan nilam Lhokseumawe, Sidikalang dan Tapak Tuan.

Dengan demikian genetik tanaman nilam yang dibudidayakan di Bali beragam dengan jarak genetik 0.08 - 0,34. Secara morfologi dan molekuler nilam tersebut memiliki kekerabatan dengan varietas nilam Aceh.

xi DAFTAR ISI

Halaman

SAMPUL DALAM ……… i

PRASYARAT GELAR ……… ii

LEMBAR PERSETUJUAN ……….. iii

PENETAPAN PANITIA PENGUJI ……….. iv

UCAPAN TERIMA KASIH ……….. v

ABSTRAK ……….. vii

ABSTRACT ……… viii

RINGKASAN ………. ix

DAFTAR ISI ……….. xii

DAFTAR TABEL ……… xiv

DAFTAR GAMBAR ………. xv

DAFTAR LAMPIRAN ……….. xvi

BAB I PENDAHULUAN ………. 1

1.1. Latar Belakang ……….. 1

1.2. Rumusan Masalah ………. 3

1.3. Tujuan Penelitian ……… 4

1.4. Manfaat Penelitian ……… 4

BAB II KAJIAN PUSTAKA ………. 5

2.1. Sistematika dan Karakteristik Nilam ……… 5

2.2. Keragaman Genetik ………….. ………. 8

2.3. Keragaman Genetik Nilam Aceh ………. 13

2.4. Penanda Genetik ……… 15

2.5. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) ………. 17

BAB III KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN …. 23 3.1. Kerangka Konsep Penelitian ……… 23

3.2. Hipotesis Penelitian ………. 25

BAB IV METODE PENELITIAN ……… 26

4.1 Tempat dan Waktu Penelitian ……….. 26

xii

4.3. Bahan dan Alat ………. 26

4.4. Isolasi DNA Nilam ………... 27

4.5. Optimalisasi dan Amplifikasi DNA dengan PCR ……… 28

4.6. Analisis Data ……… 30

BAB V HASIL PENELITIAN ……….. 31

5.1. Karakteristik Morfologi Tanaman Nilam ……… 31

5.2. Analisis Marka RAPD ……… 32

5.3. Analisis Filogeni Nilam ……… 36

BAB VI PEMBAHASAN ………... 38

6.1. Karakteristik Morfologi Tanaman Nilam ……….. 38

6.2. Analisis RAPD Nilam ……… 39

6.3. Analisis Filogeni Nilam ………. 41

BAB VII SIMPULAN DAN SARAN ………. 47

7.1. Simpulan ………. 47

7.2. Saran ……….. 47

DAFTAR PUSTAKA ……… 48

xiii

DAFTAR TABEL

halaman 2.1. Karakteristik Aksesi Nilam Aceh (Nuryani, 2006b). ………. 14 5.1. Jumlah fragmen DNA dari masing-masing nilam dan tingkat

xiv

DAFTAR GAMBAR

halaman

3.1. Bagan Kerangka Konsep Penelitian ……….. 25

5.1. Bentuk daun nilam Jawa (kiri), nilam Aceh (tengah) dan nilam yang

dibudidayakan di Bali (kanan) ……….……….. 31

5.2. Gambar elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer OPA 04 (lajur paling kiri adalah ladder DNA 1 kb; angka secara berurutan adalah nilam Lhokseumawe, Tapak Tuan, Sidikalang, Jawa, Lemukih, Wanagiri, Pupuan, Belok, Mekar Sari, Nungnung, Plaga, Sidan,

Mengwi, Lukluk, Abiansemal dan Jegu) ……….. 33

5.3. Gambar elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer OPD 11 (lajur paling kiri adalah ladder DNA 1 kb; angka secara berurutan adalah nilam Lhokseumawe, Tapak Tuan, Sidikalang, Jawa, Lemukih, Wanagiri, Pupuan, Belok, Mekar Sari, Nungnung, Plaga, Sidan,

Mengwi, Lukluk, Abiansemal dan Jegu) ……….. 34

5.4. Gambar elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer OPD 14 (lajur paling kiri adalah ladder DNA 1 kb; angka secara berurutan adalah nilam Lhokseumawe, Tapak Tuan, Sidikalang, Jawa, Lemukih, Wanagiri, Pupuan, Belok, Mekar Sari, Nungnung, Plaga, Sidan,

Mengwi, Lukluk, Abiansemal dan Jegu) ……… 35

5.5. Gambar elektroforesis hasil amplifikasi dengan primer UBC250 (lajur paling kiri adalah ladder DNA 1 kb; angka secara berurutan adalah nilam Lhokseumawe, Tapak Tuan, Sidikalang, Jawa, Lemukih, Wanagiri, Pupuan, Belok, Mekar Sari, Nungnung, Plaga,

Sidan, Mengwi, Lukluk, Abiansemal dan Jegu)……….. 35

5.6. Dendrogram filogeni nilam Lhokseumawe, Tapak Tuan, Sidikalang, Jawa dan nilam yang dibudidayakan di Bali………. 37

xv

DAFTAR LAMPIRAN

halaman 1. Larutan Stok dan Formula Ekstrak Buffer ……….……… 52