III. METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan adalah ikan lundu (Mystus gulio) dari DAS Serayu di wilayah Banyumas, alkohol 96% PA, Chelex 5%, DTT (dithiotriol) 0,1 mM, proteinase-K, larutan bufer TAE 1x, agarosa, etidium bromide, loading dye, DNA marka 1 kb, buffer PCR, H2O/ddH2O, MgCl, dNTP, Taq DNA, kertas
parafilm, dan urutan primer/ kit RAPD.
Tabel 3.1. Primer/kit RAPD yang digunakan Kode (5‟ - ……… - 3‟) OPA-07 (5'- G A A A C G G G T G -3') OPA-09 (5' -G G G T A A C G C C - 3') OPA-11 (5' - C A A T C G C C G T - 3') OPA-20 (5' - G T T G C G A T C C - 3') OPAC-14 (5' - G T C G G T T G T C - 3') OPAH-01 (5' - T C C G C A A C C A - 3') OPAH-02 (5' - C A C T T C C G C T - 3') OPAH-04 (5' - C T C C C C A G A C - 3') OPAH-08 (5' - T T C C C G T G C C -3') OPAH-09 (5' - A G A A C C G A G G - 3')
Alat-alat yang digunakan adalah eppendorf 1,5 ml dan 0,2 ml, micropipets dan
tips (10µl, 200 µl, dan 1000 µl), thermomixer, collection tube, microcentrifuge,
electric stove, erlenmeyer, timbangan analitik, electrophoresis tray, electrophoresis chamber, power supply, UV transiluminator, nanophotometer, thermocycler, gloves
dan camera digital.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Taksonomi Hewan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto selama 6 bulan mulai dari Oktober 2013 hingga Februari 2014.
8 B. Metode Penelitian
1. Metode dan Teknik Pengambilan Sampel
Metode yang digunakan adalah survei dengan teknik pengambilan sampel secara purposive random sampling, yaitu pengambilan sampel M. gulio pada daerah sungai yang telah ditentukan di DAS Serayu.
2. Variabel yang diamati
Variabel yang diamati yaitu pola pita dan jumlah fragmen DNA dari hasil amplifikasi PCR.
3. Cara Kerja
a. Pengambilan Sampel Jaringan
Jaringan insang ikan lundu dipotong dari masing-masing sampel dengan
ukuran kurang lebih 5 mm. Sampel jaringan sirip selanjutnya diawetkan dalam alkohol 96% PA kemudian disimpan pada temperatur 4oC hingga analisis DNA
dilakukan.
b. Isolasi DNA Genom
DNA diisolasi menggunakan metode Chelex® 5%. Jaringan insang M. gulio
yang telah dipotong dimasukkan kedalam tabung mikrosentrifuga 1,5 mL yang telah berisi 100 µL chelex 5%, 5 µL dithiotriol, 4 µL Proteinase-K dan 2 µL RNAse. Jaringan ikan tersebut kemudian diinkubasi menggunakan thermomixer pada temperatur 540C selama 6 jam pada kecepatan 1000 rpm. Sampel yang telah diinkubasi kemudian disentrifugasi selama 1 menit pada kecepatan 13000 rpm. Supernatan kemudian ditransfer ke dalam tabung mikrosentrifuga baru dan diinkubasi kembali pada temperatur 940C selama 10 menit.
c. Uji Hasil Isolasi DNA Genom 1. Pembuatan Gel Agarosa
Gel agarosa 1,2 % dibuat dengan mencampurkan 1,2 gram agarosa dan 100 ml TAE. Larutan agarosa kemudian dipanaskan pada hotplate sampai mendidih. Gel agarosa dibiarkan sampai temperatur kurang lebih 600C dan ditambahkan etBr dengan perbandingan 30 µL etBr dalam 30 mL agarosa atau sekitar 5 µl sebelum dituang ke dalam baki elektroforesis. Kedua ujung baki diberi lakban untuk mencegah gel keluar dan sisir elektroforesis dipasang kemudian gel agarosa dituang.
9 2. Elektroforesis
DNA hasil isolasi sebanyak 5 µL dicampur dengan 3 µL loading dye dengan menggunakan mikropipet di atas kertas parafilm, kemudian campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumuran sesuai urutan sampel. Salah satu sumuran diberi 5 µL DNA marker 1 kb (kilobasa). Elektoforesis dilakukan dengan cara menghubungkan tray pada power supply pada tegangan 100 Volt, 400 A selama 50 menit.
3. Visualisasi dan Dokumentasi
Produk isolasi berupa pita DNA yang telah dimigrasikan diletakkan di atas lampu UV transiluminator dan didokumentasikan.
a. Amplifikasi Fragmen DNA Menggunakan PCR
Proses amplifikasi marka RAPD dilakukan dengan volume total campuran reaksi PCR sebanyak 25 µL. Campuran reaksi PCR terdiri dari 2,5 µL buffer PCR; 1,75 µL primer; 1,5 µL dNTP; 0,2 µL Taq DNA polymerase; 2,5 µL DNA template (DNA hasil isolasi) dan 16,55 µL H2O. Konsentrasi masing-masing reagen disesuaikan selama proses optimasi kondisi termal PCR. Untuk mengontrol ada tidaknya kontaminasi digunakan control negative berupa campuran reaksi PCR tanpa DNA templat.
Predenaturasi dilakukan selama 3 menit pada temperatur 950C, diikuti dengan 45 siklus yang terdiri atas fase denaturasi pada temperatur 940C selama 15 detik,
penempelan primer (annealing) selama 20 detik pada temperatur 450C, dan fase pemanjangan (elongation) pada temperatur 720C selama 1,5 menit. Selanjutnya, tahap pemanjangan akhir (final extension) dilakukan selama 10 menit pada temperatur 720C. Suhu annealing dan lama waktu tiap fase dioptimasi untuk medapatkan kondisi terbaik bagi berlangsungnya proses PCR.
b. Visualisai Migrasi marka DNA
Produk PCR dimigrasikan dalam elektroforesis gel agarosa 1,2% dan diwarnai dengan cara merendamnya dalam larutan Etidium Bromida. Gel hasil pewarnaan diletakkan di atas lampu UV transilluminator dan didokumentasikan. Hasil dokumentasi tersebut digunakan sebagai dasar dalam analisis produk amplifikasi seperti pita dan jumlah pita. DNA ladder juga dimigrasikan dalam gel agarosa bersama dengan sampel RAPD untuk menentukan ukuran molekul masing-masing pita RAPD yang dihasilkan.
10 C. Metode Analisis
Penentuan primer terseleksi dilakukan secara deskriptif berdasarkan ada tidaknya pita DNA spesifik pada gel agarosa. Keragaman genetik dianalisis secara statistik menggunakan molecular diversity indices yang terdapat dalam software
Arlequin (versi 3.1). Langkah pertama menuliskan data yang digunakan pada aplikasi notepad, dan file atau data disimpan dalam bentuk arp (Arlequin project). Aplikasi Arlequin dibuka, lalu diklik open project. Dipilih data yang telah disimpan sebelumnya. Settings dipilih dan dipilih molecular diversity indices, diceklist semua yang disarankan. Dipilih Pairwise difference pada kolom molecular distance.
Kemudian diklik start, hasil terhubung pada aplikasi internet seperti mozilla firefox, opera, google chrome dan pendukung lainnya.
D. Bagan Alir Penelitian
Gambar 3.1. Bagan alir penelitian Persiapan Alat dan Bahan
Penelitian
Pengambilan Sampel Mystus gulio di DAS Serayu
Pengukuran konsentrasi DNA dengan
Nanophotometer
Visualisai Migrasi marka DNA
Isolasi DNA genom dengan Metode Chelex 5%
Analisis Data (molecular diversity indices)
RAPD-PCR
HASIL (Lampiran 3.) Hasil Analisis (Molecular Diversity Indices)
