Vol. 5 (1), 2010, h.30-34
Ekstraksi dan Purifikasi Senyawa Lutein dari Mikroalga
Chlorella
pyrenoidosa
Galur Lokal Ink
Kusmiati,1Ni Wayan S. Agustini,1 Swasono R. Tamat2 dan Mellia Irawati2 1Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Jl. Raya Bogor Km 46, Cibinong Bogor 16911 2Fakultas Farmasi, Universitas Pancasila, Srengseng Sawah, Jagakarsa Jakarta 12640
E-mail: [email protected]
Abstrak. Lutein merupakan karotenoid alami berbentuk kristal padat berwarna kuning yang dapat
diproduksi oleh mikroalga tertentu. Jenis mikroalga yang potensial menghasilkan senyawa karotenoid yaitu Chlorella pyrenoidosa. Kebutuhan akan lutein semakin meningkat karena lutein merupakan satu-satunya senyawa antioksidan yang berkaitan dengan kejadian katarak pada mata. Fungsi lain dari pigmen ini sebagai anti penuaan dini (antiaging) pada kulit yang terkena radiasi sinar UVB matahari. Mikroalga C. pyrenoidosa sudah umum dikonsumsi manusia sehingga bersifat aman. Penelitian ini melakukan ekstraksi dan purifikasi senyawa lutein yang dihasilkan oleh C. pyrenoidosa galur lokal INK. Senyawa lutein diperlukan sebagai bahan baku untuk industri makanan, farmasi dan kosmetika.
C. pyrenoidosa dikultur dalam media ekonomis hingga fase pertumbuhan stasioner. Kultur C. pyrenoidosa diekstraksi menggunakan senyawa organik diklorometan, etanol dan heksan, dilakukan
saponifikasi untuk memecah sel dengan KOH 10M, disentrifus dan supernatan di evaporasi sehingga diperoleh cairan kental berwarna hijau kuning. Identifikasi dan purifikasi lutein dilakukan secara spektrofotometri, kromatografi kolom dan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Hasil pengkulturan mikroalga C. pyrenoidosa diperoleh biomasa basah rata-rata sebesar 2,5 gram per liter. Ekstrak senyawa lutein diperoleh rata-rata 100 µg per gram berat basah sel C. pyrenoidosa. Hasil identifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) menunjukkan bahwa kombinasi pelarut heksan, aseton, kloroform dengan perbandingan 6:2:2 memberikan pemisahan yang terbaik. Kandungan lutein setelah melalui tahapan ekstraksi dan fraksinasi dianalisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT), menghasilkan 0,878 µg lutein per gram berat basah sel C. pyrenoidosa.
Kata kunci: Lutein, mikroalga Chlorella pyrenoidosa, KLT, kromatografi kolom, KCKT
Pendahuluan
Chlorella pyrenoidosa diketahui sebagai
penghasil bermacam jenis karotenoid, seperti β-karoten, α-β-karoten, anthaxanthin, neoxanthin, zeaxanthin dan lutein.1 Fungsi karotenoid sangat luas diberbagai sektor kehidupan, seperti untuk bahan pewarna makanan, bahan aditif pada makanan, sumber vitamin A dan sebagai antioksidan. Salah satu jenis karotenoid yang umumnya terdapat pada C. pyrenoidosa adalah lutein. Beberapa kegunaan lutein di bidang kesehatan diantaranya membantu melindungi kulit dari radiasi sinar UV, digunakan sebagai bahan kosmetik, sebagai suplemen gizi untuk pencegahan dan perawatan akibat degenerasi macular (katarak), dapat mencegah kerusakan retina akibat cahaya biru dengan cara menyerap cahaya tersebut dan mencegah fotooksidasi.2
Hua-Bin Li (2002)3 telah berhasil melakukan isolasi lutein dari Chlorella vulgaris menggunakan
pelarut diklorometan.3 Peneliti lainnya menghasilkan senyawa lutein dari mikroalga
Chlorella protothecoides yang diekstraksi
menggunakan metode berbeda dengan
menggunakan pelarut heksan.4
Senyawa lutein dengan nama lain Luteine; trans-lutein; Beta, epsilon-carotene- 3, 3’- diol memiliki rumus C40 H56 O2. Struktur kimia lutein dapat dilihat pada Gambar 1. Bobot molekul lutein yaitu 568,871 g/mol, berbentuk padat kristal berwarna merah-orange. Bersifat larut dalam lemak, dan pelarut organik, dan tidak larut dalam air, lebih larut dalam metanol panas (1:700).
Gambar 1. Struktur kimia Lutein
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi senyawa lutein dari mikroalga Chlorella pyrenoidosa yang mempunyai aktivitas sebagai
antioksidan. Metode ekstraksi yang digunakan menurut Hua Bin Li (2002)3 dengan menggunakan pelarut diklorometan untuk mengekstraksi kultur
C. pyrenoidosa tersebut.
Percobaan
Kultivasi Chlorella pyrenoidosa. C. pyrenoidosa dikultivasi dalam medium pertumbuhan yang dibuat dalam 1 botol berkapasitas 1 L dengan pencahayaan dari lampu neon 2000 lux. Kepadatan kultur diamati dengan mengukur OD (Optical Density) menggunakan spektrofotometer hingga mencapai fase pertumbuhan logaritmik. Kultur selanjutnya dipindahkan ke dalam botol berkapasitas 2 L yang berisi medium teknis untuk pertumbuhan Chlorella dengan komposisi berikut (1L): 1 gram urea, 0,8 gram amonium sulfat, 0,3 gram TSP dan gandasil-D. Kultur yang akan dipindahkan terlebih dahulu diukur kepadatannya dengan metode turbidimetri agar dapat dihitung jumlah volume kultur yang akan dipindahkan sehingga OD awal 0,5.
Ekstraksi senyawa lutein dari Chlorella pyrenoidosa.3 Kultur C. pyrenoidosa yang telah mencapai fase stasioner dengan kepadatan selnya mencapai serapan 2,19, kultur disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 10.000 rpm untuk memisahkan biomasa sel dan cairan. Selanjutnya biomassa yang diperoleh di timbang dan diekstraksi. Sejumlah 10 g biomassa basah disuspensikan dengan 25 mL KOH 10 M kemudian dihomogenkan dengan pengaduk magnet selama 5 menit, dipanaskan pada penangas air pada suhu 60ºC selama 10 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruangan. Setelah dingin ditambah 5 mL diklorometan kemudian dihomogenkan dan disentrifus dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit. Filtrat yang dihasilkan ditampung dan endapan diekstrak kembali dengan diklorometan seperti tersebut di atas sedemikian dilakukan sebanyak 5 kali sampai diperoleh filtrat berwarna kuning pucat.
Filtrat hasil sentrifus dikumpulkan dan diuapkan menggunakan penangas air pada suhu 40ºC. Sisa penguapan diekstraksi masing-masing 10 mL etanol 85% kemudian 10 mL heksan, kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah, di kocok dan dibiarkan memisah hingga terbentuk 2 lapisan yakni fase etanol (A) dan fase heksan (B)
Kromatografi Lapis Tipis untuk pemilihan eluen terbaik. Pemilihan eluen untuk fraksinasi
fase etanol (A) dan fase heksan (B) dilakukan dengan cara mencoba kombinasi tiga pelarut berdasarkan deret eluotropi pelarut menggunakan
kromatografi lapis tipis GF254. Pelarut yang digunakan adalah kombinasi tiga pelarut heksan-kloroform-aseton dengan perbandingan 7:2:1 dan 6:2:2 (modifikasi).5
Fraksinasi ekstrak dengan Kromatografi Kolom. Fase etanol (A) dan fase heksan (B)
masing-masing difraksinasi dengan kromatografi kolom menggunakan fase gerak yang telah terpilih dari tahap kromatografi lapis tipis yaitu heksan-aseton-kloroform dengan perbandingan 6:2:2. Kolom yang telah dibersihkan dipasang tegak lurus pada statif. Kolom diisi fase diam silica gel 60 kemudian dibilas dengan pelarut yang digunakan sebagai fase gerak. Sebanyak 2 mL dari masing-masing fase etanol (A) dan fase heksan (B) ditambah dengan celite 50 dan dicampur sempurna, kemudian dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi sedikit. Fase gerak dimasukkan ke dalam kolom secara kontinyu, dan fraksi-fraksi yang keluar dari kolom ditampung sebanyak 4 mL dalam setiap vial.
Kromatografi lapis tipis untuk pemilihan fraksi terbaik. Hasil fraksinasi fase etanol (A) dan
fraksinasi fase heksan (B) masing-masing dilakukan KLT dengan menggunakan eluen yang sama dengan eluen pada kromatografi kolom. Fraksi yang memberikan bercak yang sama dengan baku pembanding lutein, merupakan fraksi yang dipilih sebagai fraksi terbaik yaitu fraksi 6.
Identifikasi fase etanol, fase heksan, fraksi 6 etanol dan fraksi 6 heksan dengan KCKT. Fase
etanol (A), fase heksan (B), hasil fraksinasi terpilih yaitu fraksi 6 etanol dan fraksi 6 heksan dianalisis menggunakan KCKT untuk identifikasi senyawa yang terkandung dalam sampel tersebut. Sejumlah 20 µL masing-masing larutan diinjeksikan ke instrumen KCKT dengan kondisi yang tertera pada Tabel 1.
Tabel 1. Kondisi instrumen KCKT4
Kolom Kolom C18
Fase gerak Metanol - Diklorometan - Asetonitril - Air (67.5:22.5:9.5:0.5)
Detektor UV-VIS, λ 450 nm
Laju Alir 1,0 mL/menit
Hasil dan Pembahasan
Kultivasi C. pyrenoidosa pada botol skala 2 L. Mikroalga yang telah diregenerasi dikultur pada
media teknis dalam botol skala 2L. Peningkatan skala pengkulturan dilakukan menggunakan medium teknis mengandung urea, TSP dan ZA. Kultur dipanen pada fase stasioner diukur menggunakan spektrofotometer mencapai OD 2,3
pada panjang gelombang 680 nm. Fase stasioner C.
pyrenoidosa pada kultur 2 L dicapai setelah 9
hingga12 hari (Gambar 2).
0 0.5 1 1.5 2 2.5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hari ke-Pe rt um bu ha n Se l
Gambar 2. Kurva fase pertumbuhan Chlorella pyrenoidosa
Pemanenan Biomasa C. pyrenoidosa sistem flokulasi. Kultur pada fase stasioner dalam botol
disentrifus untuk mendapatkan biomasa dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Endapan basah dikumpulkan untuk diekstraksi senyawa lutein. Hasil rata-rata biomasa basah C.
Pyrenoidosa yaitu 2,5 gram per liter.
Ekstraksi, karakterisasi dan Identifikasi senyawa lutein dari Chlorella Pyrenoidosa.
Ekstraksi. Beberapa metode untuk ekstraksi
lutein dilakukan terhadap biomasa C. pyrenoidosa untuk mendapatkan hasil yang optimal. Metode yang paling optimal berdasarkan perolehan kristal lutein (mg) dan kecerahan warna secara fisik yaitu metode Hua-Bin Li.3 Produksi lutein crude rata-rata diperoleh 100 µg per gram berat basah sel
Chlorella pyrenoidosa.
Proses pemisahan lutein yang terlarut pada dua lapisan yang terbentuk, dilakukan dalam labu pemisah dan cairan ekstrak berwarna kuning ditampung, setelah larutan ekstrak dievaporasi pada suhu 40C terbentuk kristal lutein berwarna kuning pekat. Kristal lutein yang diperoleh selanjutnya diuji karakteristik.
Kromatografi Lapis Tipis untuk Pemilihan Eluen Terbaik. Pemilihan eluen untuk fraksinasi
fase etanol (A) dan fase heksan (B) dilakukan menggunakan Kromatografi Lapis Tipis GF254 dengan kombinasi pelarut heksan, aseton, klorofom dengan perbandingan 7:2:1 dan 6:2:2 (modifikasi). Hasil menunjukkan bahwa kombinasi pelarut dengan perbandingan 6:2:2 memberikan pemisahan yang terbaik yang menunjukkan ada 3 bercak yang masing-masing mempunyai Rf 0,12;0,3 dan 0,6 pada fase etanol (A), dan ada 2 bercak yang masing-masing mempunyai Rf 0,4 dan 0,5 pada fase heksan (B) seperti terlihat pada Gambar 3.
(a) (b) (c)
Gambar 3. Profil KLT untuk pemilihan eluen fraksinasi
terbaik Keterangan :
a : Fase etanol (A) dan Fase heksan (B) menggunakan kombinasi pelarut heksan, aseton, kloroform dengan perbandingan 7:2:1
b : Fase etanol (A) dan BP menggunakan kombinasi pelarut heksan, aseton, kloroform dengan perbandingan 6:2:2 c : Fase heksan (B) dan BP menggunakan kombinasi pelarut heksan, aseton, kloroform dengan perbandingan 6:2:2
Purifikasi Ekstrak C. pyrenoidosa Menggunakan Kromatografi Kolom. Fase etanol
(A) dan Fase heksan (B) masing-masing difraksinasi 2 mL melalui kromatografi kolom silika gel 60 dan eluen pelarut heksan-aseton-kloroform (6:2:2) menghasilkan 10 fraksi masing-masing 4 mL dalam vial.
Kromatografi Lapis Tipis Untuk Pemilihan Fraksi Terbaik. Masing-masing fraksi tersebut di
atas dilakukan analisis kromatografi lapis tipis, dengan eluen kombinasi pelarut heksan-aseton-kloroform (6:2:2) terdapat satu fraksi yang menunjukkan hanya 1 bercak dengan Rf yang sama dengan baku pembanding lutein, yakni fraksi 6 etanol dan fraksi 6 heksan. Fraksi yang lain walaupun mempunyai senyawa dengan bercak yang sama dengan lutein, namun masih terdapat bercak dari senyawa-senyawa lain.
Identifikasi Senyawa Lutein. Analisis kualitatif
senyawa lutein yang telah dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan lempeng silika gel GF254 menggunakan pelarut heksan : aseton: : kloroform (6: 2: 2) dilanjutkan identifikasi menggunakan KCKT. Hasil kromatogram KCKT sampel Lutein dari fase etanol (A), fase heksan (B) yang merupakan hasil ekstraksi mikroalga C. pyrenoidosa dan hasil fraksinasi yaitu fraksi 6 etanol, dan fraksi 6 heksan dibandingkan dengan kromatogram senyawa lutein baku pembanding. Selanjutnya dibuat hubungan
garis antara konsentrasi baku pembanding lutein dengan luas area puncak kromatogram yang dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 4. Hasil kurva kalibrasi larutan baku pembanding lutein diperoleh persamaan garis regresi y = -3722,8 + 441,468 x dengan koefisien kolerasi sebesar 0,9947. Koefisien kolerasi yang mendekati 1 menunjukkan bahwa ada hubungan linear yang baik antara luas area dengan konsentrasi baku pembanding lutein.
Tabel. 2. Data konsentrasi dan luas puncak
kromatogram baku pembanding lutein
No Konsentrasi Lutein
(bpj) Luas puncak kromatogram
1 0 0 2 50 27117 3 100 53334 4 200 88954 0 50000 100000 0 50 100 150 200 250
konsentrasi baku pembandng (bpj)
lu as p un ca k kr om at og ra m
Gambar 4. Kurva kalibrasi baku pembanding lutein
menggunakan KCKT
Kromatogram dari masing-masing sampel ekstrak lutein dapat dilihat pada Gambar 5, 6, 7, 8 dan 9. Hasil pemeriksaan masing-masing sampel dengan KCKT menunjukkan bahwa setiap sampel masih mengandung dua senyawa sebagaimana ditunjukkan dalam masing-masing gambar. Dari 2 puncak dalam kromatogram hanya 1 puncak yang mengandung lutein (Tabel 2). Dengan demikian fase etanol (A), fase heksan (B), fraksi 6 etanol, dan fraksi 6 heksan diidentifikasi masih belum murni pada kromatografi cair kinerja tinggi.
Gambar 5. Kromatogram KCKT Baku Pembanding
lutein
Gambar 6. Kromatogram KCKT ekstrak A (fase
etanol)
Gambar 7. Kromatogram KCKT ekstrak B (fase
heksan)
Gambar 8. Kromatogram KCKT fraksi 6 Etanol
Gambar 9. Kromatogram KCKT fraksi 6 heksan
Tabel 3. Interpretasi data kromatogran KCKT
Sampel Waktu retensi (menit) Luas area Fase etanol(A) 0,542 1220 0,920 3186 Fase heksan (B) 0,597 1981 0,908 1621 Fraksi 6 etanol 0,645 1234 0,920 1785
Fraksi 6 heksan 0,590 1493
0,992 1865
Namun hasil penelitian menunjukkan bahwa 1 puncak dari 2 puncak kromatogram yang ada mengandung senyawa lutein karena waktu retensi yang dimiliki oleh senyawa tersebut mendekati waktu retensi dari baku pembanding lutein (Tabel 4).
Tabel. 4. Hasil analisis kadar lutein pada fase etanol
dan heksan
Sampel Rt (menit) Luas puncak KandunganLutein (bpj)
Fase etanol (A) 0,920 3186 15,6496
Fase heksan (B) 0,908 1621 12,1028
Fraksi 6 etanol 0,920 1785 12,4743
Fraksi 6 heksan 0,992 1865 12,6573
Hasil perhitungan menunjukkan bahwa kadar lutein murni setelah melalui tahapan ekstraksi dan fraksinasi sebesar 0,878 µg per gram biomassa basah.
Kesimpulan
Mikroalga Chlorella pyrenoidosa galur INK menghasilkan senyawa lutein yang dapat terlarut dalam etanol dan heksan. Dalam tahapan ekstraksi sebagai fase etanol (A) dan fase heksan (B). Mikroalga C. pyrenoidosa menghasilkan ekstrak lutein crude sebesar 100 µg per gram berat basah sel mikroalga. Hasil fraksinasi dan purifikasi diperoleh ekstrak lutein murni sebesar 0,878 µg per gram berat basah sel mikroalga.
Ucapan Terimakasih
Penelitian ini dibiayai oleh Program Insentif -Kementerian Negara Riset dan Teknologi Tahun Anggaran 2009 untuk ibu Dra. Kusmiati, MSi. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Prof. INK. Kabinawa atas izin penggunaan mikroalga C. pyrenoidosa.
Pustaka
1. Xian-ming Shi; Feng Chen; Yuan, J.P; Hui Chen. Heterotrophic production of lutein by selected Chlorella strains. Journal of Appl.Phycology, 1997,
9, 445-450
2. Landrum, J.T.; Bone, R.A. Lutein, Zeaxanthin and the macular pigment. Arch Biochem Biophys, 2001,
385, 28-40
3. Hua-Bin Li; Jiang You; Chen Feng. Isolation and purification of lutein from the microalga Chlorella
vulgaris by Extraction after saponification. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2002,
1070-1072
4. Bhosale Prakash; Bogdan,S.; Paul,B. Production Of Deuterated Lutein by Chlorella protothecoides and its Detection by Mass Spectrometric Methods. Journal Biotechnol Lett, 2006, 1371-1375
5. Lei li; Jian Qin; Shi-an Yin; Guangwen Tang. Effects of mobile phase ratios on the separation of plant carotenoids by HPLC with a C30 column. Chromatographia, 2007, 65(1/2), 91-94.
