3
METODE
Bahan
Penelitian ini menggunakan belut sawah dari Pusat Kegiatan Belajar Masyarakat (PKBM) Baitul Ilmi di daerah Sentul dengan panjang 22±2 cm dan bobot tubuh sekitar 5 sampai 12 g. Status belut adalah immature, berdasarkan pengamatan morfologi (warna perut), pembedahan dilanjutkan histologi gonad ukuran panjang 20 cm sampai 31 cm dan tinjauan pustaka jurnal tentang tingkat kematangan gonad pada ukuran 20 sampai 24 cm sebelum penelitian dimulai. Hormon yang digunakan adalah PMSG (Murni dan PG600), hCG (Prenil1500IU) dan antidopamin. Pakan yang digunakan adalah cacing tubifex.
Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kolam Percobaan Babakan. Pembuatan preparat histologi gonad dilakukan di Laboratorium Kesehatan Ikan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Analisis konsentrasi hormon estradiol-17β
dalam darah dengan uji ELISA di Laboratorium Hormon, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilakukan pada bulan Oktober 2012 sampai Juni 2013
Prosedur Penelitian Rancangan penelitian
Penelitian ini menggunakan metode eksperimental Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tujuh perlakuan dan tujuh ulangan individu.
Perlakuan yang diterapkan diantaranya :
K : larutan NaCl 0.95% (dosis 1 ml/kg bobot ikan) P20 : PMSG (dosis 20 IU/kg bobot ikan)
H20 : hCG (dosis 20 IU/kg bobot ikan)
A10 : Antidopamin (AD) (dosis 0.01 mg/kg bobot ikan)
P20H10 : PMSG+hCG (dosis 20 IU+10 IU/kg bobot ikan)
P20A10 : PMSG+AD (dosis 20 IU+0.01 mg/kg bobot ikan)
H20A10 : hCG+AD (dosis 20 IU+0.01 mg/kg bobot ikan)
Persiapan wadah
Akuarium yang digunakan sebanyak tujuh buah dengan ukuran 79x38x40 cm. Akuarium dibersihkan dengan menggunakan air hingga bersih, lalu dijemur. Kemudian setelah kering diisi air setinggi 20 cm, dan diberi larutan kalium permanganat (PK) dengan dosis 2 ppm dan didiamkan selama satu hari. Setelah itu air didalam akuarium dibuang, kemudian dibilas dan diisi air setinggi 7 cm. Akuarium yang telah berisi air diberi aerasi, hiter, pelindung berupa serutan tali
rafia dan paralon, kemudian diberi Oxcytetracyxlin (OTC) dengan dosis 0.5 gr/22.1 L volume air media penelitian.
Persiapan induk
Belut sawah diambil dari pembudidaya. Belut sawah kemudian direndam larutan kalium permanganat dan dimasukkan ke bak aklimasi. Belut sawah dibiarkan terlebih dahulu satu hari tanpa diberi pakan. Pemberian pakan dilakukan pada hari berikutnya selama satu minggu. Aklimasi dilakukan dengan tujuan adaptasi lingkungan, pakan dan seleksi. Setelah satu minggu, dipilih induk sebanyak 49 ekor sebagai objek perlakuan.
Pemeliharaan pakan
Pakan yang diberikan pada penelitian ini adalah cacing tubifex. Cacing tubifex dibersihkan dahulu dengan air. Cacing tubifex dipelihara menggunakan baskom yag diberi air dan aerasi. Cara pemberiannya dengan menggunakan wadah khusus untuk cacing tubifex yang diletakkan pada sisi akuarium.
Pembiusan dan penyuntikan
Pembiusan belut sawah dilakukan dengan obat bius stabilizer dengan dosis 1 ml/0,5 L air selama tiga menit, kemudian dilakukan penyuntikan secara intramuscular dengan hormon yang ditentukan. Hormon yang disuntikan adalah hormon perlakuan sesuai dengan dosis. Suntikan yang digunakan adalah ukuran 1 ml merk Terumo. Ikan yang telah disuntik dimasukkan pada wadah dengan aerasi yang kuat selama 6 sampai 10 menit. Belut yang telah sadar dimasukkan kedalam akuarium.
Pemeliharaan belut sawah
Pemberian pakan cacing tubifex sebanyak 3% dari bobot tubuh belut sawah per akuarium setiap harinya. Pemberian pakan dilakukan pada masa adaptasi dan penelitian (pagi, siang dan malam). Penyifonan dilakukan satu kali sehari yaitu siang. Pergantian air dilakukan apabila kualitas air kurang baik (kotor).
Parameter uji Bobot dan panjang tubuh belut
Belut sawah dibius terlebih dahulu sebelum dilakukan penimbangan bobot dan pengukuran panjang tubuh. Pengukuran bobot tubuh dilakukan setiap minggu selama penelitian (empat minggu) menggunakan timbangan digital dengan tingkat ketelitian 0.01 g. Panjang badan diukur dengan menggunakan penggaris 30 cm. Pengukuran panjang dan bobot tubuh belut sawah dilakukan sebelum penyuntikkan. Data pertambahan panjang dan bobot tubuh pada akhir penelitian dihitung dengan pengurangan data pada minggu ke-4 (M4) dengan minggu ke-0 (M0).
Konsentarasi estradiol-17βdalam darah belut sawah
Pengukuran konsentrasi estradiol-17β dalam darah dilakukan pada awal (M0), minggu ke-1, ke-2, ke-3 dan minggu ke-4 penelitian. Mekanisme pengambilan sampel darah adalah:
1. Ikan yang akan diambil darahnya dibius terlebih dahulu dengan cara memasukkan satu persatu ke dalam air yang diberi larutan stabilizer dengan dosis 1 ml/0,5 L selama 5 menit,
2. Ikan yang telah pingsan, darah diambil pada bagian pangkal ekor sebanyak 0.2 sampai 0.5 ml dengan menggunakan syiring 1 ml yang telah diberi antikoagulan (larutan citrate-phosphate-dextrose, produk Laboratorium Kesehatan Ikan), kemudian dimasukkan kedalam mikrotube volume 1.5 ml dan disimpan dalam kotak dingin (cool box).
3. Darah yang ditampung dalam mikrotube, kemudian disentrifuge pada kecepatan 10000 rpm selama 5 sampai 10 menit.
4. Supernatan diambil dan dimasukkan kedalam mikrotube baru. Bila pengukuran supernatan plasma tidak dilakukan secara langsung, sampel disimpan dalam freezer pada suhu minus 4 oC.
Pengukuran konsentrasi hormon estradiol 17β belut sawah dalam plasma
darah dilakukan dengan menggunakan metode ELISA dengan Vidas ELISA kit untuk 17-estradiol (REF 30 330) dengan langkah kerja sebagai berikut :
1. Semua reagen harus dibiarkan dalam suhu kamar (18 sampai 25 °C) sebelum digunakan
2. Pipet 50 μl standar, sampel dan QC ke dalam Mikro Plate
3. Tambahkan 100 μl Estradiol Enzym Conjugate untuk tiap Mikro Plate, kemudian shaker 2 sampai 5 menit
4. Inkubasi pada suhu 37 °C selama 2 jam
5. Setelah diinkubasi, buang larutan yang ada di Mikro Plate kemudian dicuci dengan Washing Solution sebanyak 300 μl. Pencucian Shaker diulang sebanyak lima kali selama 3 menit, setelah selesai balikkan shaker dan tekan kuat dengan kertas penyerap untuk mengeringkan.
6. Tambahkan 100 μl larutan TBM Substrate pada setiap Mikro Plate sesuai dengan urutan
7. Inkubasi tabung selama 20 menit pada suhu ruang tertutup dengan kaca film, kemudian dibungkus dengan aluminium poil.
8. Menghentikan reaksi dilakukan dengan menambahkan 50 μl Stop Solution
kedalam tiap Mikro Plate dengan lembut, campuran bahan digoyang selama 5 detik
9. Kemudian masukkan Mikro Plate ke dalam Elisa Spectrophotometere, baca dan obserpasi pada panjang gelombang 450 nm.
Gonado Somatik Indeks (GSI)
Pengukuran gonado somatik indeks dilakukan pada awal (M0), minggu ke-1, ke-2, ke-3 dan akhir penelitian (minggu ke-4). Belut sawah sebelum dibedah harus dilakukan penimbangan bobot tubuh terlebih dahulu, kemudian diambil gonadnya dan ditimbang menggunakan timbangan digital (tingkat ketelitian 0.01 g). Gonado Somatik Indeks(GSI) yaitu suatu nilai dalam persen sebagai hasil
dari perbandingan antara berat gonad dengan berat tubuh ikan termasuk gonad dan dikalikan dengan 100%. Rumus GSI menurut Crim et al. (1988) yaitu:
% 100 x W Wg GSI Keterangan :
GSI : Gonado Somatik Indeks(%) Wg : Bobot gonad (g)
W : Bobot tubuh ikan (g)
Hepatosomatik Indeks(HSI)
Belut sawah dibedah, kemudian diambil hatinya dan ditimbang menggunakan timbangan digital (tingkat ketelitian 0.01 g). Pengukuran HSI dilakukan pada awal (M0), minggu ke-1, ke-2, ke-3 dan minggu ke-4 dengan menggunakan rumus: (Bucacker et al.(1990)
%
100
x
W
Wh
HSI
Keterangan :HSI : Hepatosomatik Indeks(%) Wh : Bobot hati (g)
W : Bobot tubuh ikan (g) Histologi gonad
Histologi gonad dilakukan pada awal, minggu ke-1, ke2, ke-3 dan minggu ke-4. Histologi gonad dilakukan berdasarkan metode Gunarso (1989) dengan tahapan proses sebagai berikut:
1. Fiksasi, ikan dibedah dan diambil jaringan gonadnya, kemudian dicuci dengan NaCl fisiologis 0.65%, difiksasi dalam larutan bouin/BNF (campuran asam pikrat, formalin dan asam asetat dengan perbandingan 15:5:1) selama 24 jam. Berikutnya dipindahkan kedalam alkohol 70% beberapa kali selang satu jam sampai kuning telur hilang.
2. Dehidrasi, organ direndam kedalam larutan alkohol bertingkat (80%, 85%, 90% dan 95%) masing-masing selama 2 jam dan dipindahkan kedalam alkohol 100% sebanyak empat kali masing-masing selama 1 jam.
3. Clearing, organ direndam dalam alkohol 100%+xylol (1:1) selama 45 menit, kemudian kedalam xylol I, II dan III masing-masing selama 45 menit.
4. Infitrasi, organ direndam dalam xylol + parafin (1:1) selama 45 menit pada suhu 60oC. Kemudian direndam dalam parafin I, II dan III masing-masing selama 45 menit dalam suhu 63oC.
5. Embeding, organ ditanam dalam blok parafin cair pada suhu 60 oC sampai parafin mengeras selama 24 jam.
6. Pemotongan, spesimen dipotong setebal 6 sampai 7 µm, ditempel pada gelas obyek yang telah ditetesin ewid, ranggangkan diatas alat pemanas dan keringkan selama 24 jam pada suhu 45oC.
7. Deparafinasi, preparat direndam berturut-turut dengan xylol I, II, alkohol 100% I, 100% II, 95%, 90%, 85%, 80%, 70% dan 50% masing-masing selama 1 menit dan dicuci sampai warna putih.
8. Pewarnaan, preparat direndam dalam larutan haemotoxylin selama 2 menit, dicuci dengan air keran mengalir, rendam dalam larutan eosin selama 2 menit, cuci dengan air keran mengalir.
9. Dehidrasi, preparat direndam berturut-turut delam alkohol 70%, 80%, 85%, 90%, 95% I, 95% II, 100% I dan 100% II masing-masing selama 1 menit. 10. Clearing, preparat direndam dalam xylol I dan xylol II masing-masing
selama 1 menit.
11. Penutupan dengan kaca penutup. Preparat diberi zat perekat Canada balsem, ditutup dengan gelas penutup, dikeringkan selam 10 menit. Berikutnya preparat diberi label sesuai dengan perlakuan sehingga didapatkan preparat permanen histologi gonad yang dapat diamati dibawah mikroskop setiap saat.
12. Pengamatan histologi dilakukan pada awal, minggu ke-1, ke-2, ke-3 dan minggu ke-4 penelitian.
Tingkat Kematangan Gonad (TKG)
Pengamatan tingkat kematangan gonad dilakukan pada awal (M0), minggu ke-1, ke-2, ke-3 dan minggu ke-4 penelitian. Tingkat kematangan gonad diamati secara morfologi dan histologi gonad. Menurut penelitian Bahri (2000), ciri-ciri TKG belut sawah adalah seperti berikut:
TKG I : Butiran telur tidak dapat dilihat secara visual, proporsi telur lebih besar dari proporsi jantan
TKG II : Secara visual telur sudah terlihat, telur yang terlihat berukuran sangat kecil, proporsi telur sekitar 80 sampai 90% dari
isi gonad
TKG III : Telur terlihat sangat jelas, butiran-butiran telur berukuran Besar, antara butiran telur masih rekat sehingga agak sukar
dipisahkan, proporsi telur sekitar 95% dari isi gonad. TKG IV : Telur terlihat sangat jelas, butiran-butiran telur berukuran
besar, antara butiran telur sulit terpisah, gonad hampir seluruhnya berisi dengan proporsi sperma sangat sedikit. Intersex : Kondisi dimana proporsi telur dan sperma sama besar. Status kelamin
Penentuan status kelamin dari belut dilakukan dengan cara pengamatan morfologi dari warna perut, anus, gonad, status gonad dan keberadaan serta warna gamet dalam gonad. Pengamatan ini dilakukan pada akhir penelitian (minggu ke-4).
Diameter telur
Belut sawah dibius kemudian dilakukan pembedahan untuk mengambil gonad. Gonad dipotong menjadi dua bagian, salah satu bagian digunakan untuk histologi gonad. Gonad yang akan diamati diameter telurnya, direndam terlebih dahulu pada larutan sera. Selanjutnya, lapisan tipis gonad dilepas dengan menggunakan jarum agar telur dapat diambil dan dipisahkan. Diameter telur diukur dengan mikroskop mikrometer dengan perbesaran empat puluh kali. Hasil pengukuran menggunakan lensa okuler (µm) dikalibrasi dengan lensa objektif (dibagi 1000) untuk mengetahui diameter telur dalam satuan mm. Kemudian, dikalikan dengan pembesaran empat puluh kali, maka didapatkan hasil diameter telur belut sawah sebenarnya dalam satuan mm.
Tingkat kebuntingan
Tingkat kebuntingan pada penelitian ini dihitung dengan menjumlahkan belut sawah yang telah terdapat gamet (telur) di gonad. Pengamatan dilakukan pada awal hingga akhir penelitian dengan total belut yang diamati sebanyak 7 ekor.
Fekunditas
Fekunditas telur belut sawah diukur pada akhir penelitian. Effendie (1979) menjelaskan fekunditas telur dapat diukur dengan cara perhitungan langsung jumlah telur yang ada dalam gonad. Gonad pada akhir penelitian diambil 1 ekor belut sawah sebagai sampel setiap perlakuan, kemudian dilakukan pembedahan untuk pengambilan gonad. Gonad yang didapat ditimbang dengan timbangan digital (ketelitian 0.01 g), selanjutnya dibagi menjadi dua bagian (salah satunya untuk histologi gonad). Gonad direndam dilarutan sera, setelah itu dilepaskan kulit tipis gonad dan dilakukan pemisahan telur. Telur dihitung dengan cara menghitung jumlah telur pada sebagian gonad, lalu dikalikan dengan bobot gonad total dan dibagi bobot gonad yang diamati. Maka, didapatkan fekunditas telur belut sawah secara keseluruhan.
Kualitas air
Kualitas air diamati setiap minggu kecuali amoniak diamati pada awal, minggu ke-1, ke-2, ke-3, dan minggu ke-4. Parameter kualitas air yang diamati diantaranya: kandungan oksigen terlarut (DO meter mg/L), temperatur air (termometer (oC)), nilai pH (pH meter) dan amoniak (spektrofotometer (mg/L)).
Kualitas air pada saat penelitian dijaga kestabilan kondisinya seperti Tabel 2.1 dibawah ini:
