Tim Dosen Kapita Selekta Bahan Alam FFS-UHAMKA

Tim Dosen Kapita Selekta Bahan Alam FFS-UHAMKA

REFERENCES

Moharram HA, and Youssef MM, Methods for Determining the Antioxidant Activity: A Review, Alex. J. Fd. Sci. & Technol.

Vol. 11, No. 1, pp. 31-42, 2014

Pisoschi AM and Negulescu GP. Methods for Total Antioxidant Activity Determination: A Review, Biochem. and Analytical Biochemistry, 2011, 1:1

Md. Nur Alam, Nusrat Jahan Bristi, Md. Rafiquzzaman, Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity, Saudi Pharmaceutical Journal (2013) 21, 143–

152.

Sudhakar Singh & R.P. Singh (2008) In Vitro Methods of Assay of Antioxidants: An Overview, Food Reviews International, 24:4, 392-415

ANTIOKSIDAN:

Donor elektron Umumnya BM kecil Mengikat radikal bebas Menghambat reaksi oksidasi

RADIKAL BEBAS:

Atom atau molekul dengan elektron yang tidak berpasangan, bersifat sangat tidak stabil.

Dapat bereaksi dengan protein, lipid, KH, DNA dll.

Menyebabkan terjadinya reaksi berantai menghasilkan radikal bebas yang baru.

REACTIVE OXYGEN SPECIES (ROS)

REACTIVE NITROGENSPECIES (RNS) Radikal:

-Anion superoksida (O₂^•−)

-Hidroksil (^•OH)

- Alkoksil (RO^•)

- Peroksil (ROO^•)

-Hidroperoksil (HO₂^•)

Non Radikal - reaktif:

H₂O₂

Oksigen singlet

-Nitrit oksida (NO)

-Peroksi nitrat (ONOO)

-Nitrogen dioksida (NO₂)

-Dinitrogen trioksida (N₂O₃)

RADIKAL KARBON RADIKAL SULFUR

JENIS

RADIKAL BEBAS

KAITAN STRESS OKSIDATIF DAN ANTIOKSIDAN

Antioksidan Radikal bebas >>

(reaktif) Stress Oksidatif

kanker, penyakit cardiovascular, neurodegeneratif,

Alzheimer, Parkinson, atherosclerosis,

penuaan, dll Kerusakan DNA,

kerusakan sel

Penggolongan antioksidan (berdasarkan fungsi)

PRIMER

Merupakan antioksidan pemutus rantai yang bereaksi dengan

radikal lipid dan membentuk senyawa yang lebih stabil atau senyawa non-radikal (donor hidrogen)

Contoh: enzim superoksida dismutase (SOD)

SEKUNDER

menghambat oksidasi lipid (mencegah kerja pro-oksidan) melalui berbagai mekanisme:

• pengkhelat ion logam transisi,

• Pengurangan oksigen,

• Transfer hidrogen ke antioksidan primer,

• menyerap radiasi UV,

• deaktivasi spesies reaktif.

Contoh: senyawa fenolik

Penggolongan antioksidan (berdasarkan asal senyawa)

ALAMI

Merupakan antioksidan yang diperoleh dari hasil ekstraksi bahan alam

Contoh: antioksidan mineral,

antioksidan vitamin and beberapa senyawa fitokimia, seperti:

senyawa fenolik, flavonoid,

katekin, karotenoid, β-carotene, lycopene, diterpene, black

pepper, thimi, garlic, curcumin dan turunannya.

SINTETIK

Merupakan antioksidan yang diperoleh dari hasil sintesi reaksi kimia

Contoh: Butilhidroksianisol (BHA), butilhidroksitoluena (BHT), propil gallate (PG),

butilhidrokuinon tersier (TBHQ),

Antioksidan Enzymatic (endogenous)

• Diproduksi secara alami di dalam tubuh.

• Mencegah pembentukan radikal bebas yang baru

• Menonaktifkan radikal bebas yang sudah ada,

• Contoh:

- enzim superoksida

dismutase (SOD), katalase, glutation reduktase,

- kofaktor enzim

Antioksidan Non-enzymatic

• Banyak terdapat dalam berbagai sayuran dan buah

• Contoh: senyawa

polifenol (asam fenolat dan flavonoid), vitamins, carotenoids,

organosulfural and minerals

Penggolongan antioksidan (menurut Ratnam et al., 2006)

Muharram and Youssef, 2014)

METODE UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN (IN VITRO)

METODE TRANSFER ATOM HIDROGEN

ROO• + AH/ArOH → ROOH +A•/ArO•

• Oxygen radical absorbance capacity (ORAC)

• Lipid peroxidation inhibition capacity (LPIC)

• Total radical trapping antioxidant parameter (TRAP)

• Scavenging of H₂O₂, radicals

• ABTS radical scavenging

• Β-carotene bleaching assay

METODE TRANSFER ELEKTRON

• Trolox equivalent

antioxidant capacity (TEAC) decolourization

• Ferric reducing antioxidant power (FRAP)

• DPPH free radical scavenging

• N,N-dimethyl-p-

phenylenediamine (DMPD)

• Copper (II) reduction capacity

1. METODE DPPH

DPPH* (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl): suatu radikal bebas, memiliki atom Nitrogen

dengan elektron tidak berpasangan, memiliki absorbansi kuat sekitar pada 520 nm.

Prinsip uji: dengan adanya senyawa antioksidan (mendonorkan H), DPPH

tereduksi, warna berubah dari ungu menjadi kuning. Serapan diukur pada 515-528 nm menggunakan spektrofotometer.

Aktivitas antiradical digambarkan dengan nilai IC50 (konsentrasi seyawa yang mampu menurunkan absorbansi DPPH sebesar 50%)

Keunggulan:

-mudah, -akurat, - sensitive,

- relative murah

- reproduksibiltasnya tinggi

Keterbatasan:

- DPPH* berinteraksi dgn radikal lain,

- sensitif terhadap basa Lewis dan pelarut,

- Menggunakan pelarut organik

2. METODE ABTS/TEAC

ABTS•+ adalah suatu kation radikal yg tidak ditemukan dalam tubuh manusia dan memiliki absorbansi pada 743 nm (warna hijau biru).

Prinsip Uji: antioksidan mereduksi ABTS•+ → ABTS (2,2’-azinobis-(3-

ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), warna berubah dari hijau-biru menjadi tidak

berwarna. Serapan utama pada 415 nm dan serapan kedua max pada 660, 734, and 820 nm yg diukur dgn diode-array spectrophotometer

Pembanding/standar: Trolox (suatu antioksidan analog vitamin E yang larut dalam air

→ yang memberikan Hidrogen) sehingga dikenal jg dengan metode Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC).

ABTS dioksidasi oleh peroksida dan H₂O₂ atau Kalium persulfat atau Mangan dioksida (MnO₂), menghasilkan ABTS•+ dengan absorbansi pada 743 nm.

Keunggulan: mudah, cepat, dapat dialkukan pada rentang pH yang luas, dpt digunakan utk pengujian antioksidan bersifat hidrofilik dan lipofilik Keterbatasan:interval waktu pengujian harus dimonitor ketat

3. METODE FRAP

(ferric reducing antioxidant power) Pereaksi:

Komplek ferric iron-TPTZ (2,3,5-triphenyl-1,3,4-triaza-2- azoniacyclopenta-1,4-diene chloride).

Prinsip Uji: antioksidan mereduksi kompleks ferric

tripyridyltriazine (Fe⁺³-TPTZ) menjadi kompleks ferrous (Fe⁺²- TPTZ) berwarna biru pada pH rendah, setelah 30 menit suhu 37

C serapan diukur pada 593 nm menggunakan diode-array spectrophotometer

Pembanding: Trolox (TEAC) atau asam askorbat (AEAC)^{[43 as}

references.

4. METODE ORAC

(oxygen radical absorption capacity) Pereaksi:

2,2’-azobis-(2-amidino-propane) dihydrochloride (AAPH) sebagai generator radikal peroksi, pada suhu 37 C

Prinsip Uji: antioksidan menghambat proses

oksidasi β-phycoerythrin/fluorescein oleh ROS → penurunan fluoresensi yang diukur pada panjang gelombang eksitasi 485 nm dan panjang

gelombang emisi 520 nm

Standar/pembanding: Trolox

Banyak digunakan untuk sayuran dan buah, antioksidan yg bersifat hidrofilik

5. METODE PFRAP

(potassium ferricyanide reducing power)

K ferricyanida K ferrocyanida.

ferri ferrocyanide

(warna biru, panjang gelombang 700 nm)

FeCl₃

6. METODE CUPRAC

(cupric ion reducing antioxidant capacity)

- Metode pengujian kemampuan antioksidan yang larut air dalam meredam radikal hidroksil - Pereaksi: bis(neocuproine)copper(II) chloride [Cu(II)-Nc]

- Standar: Trolox (mg/L ekstrak)

- Ekstrak+ CuSO4 dan neocuproine → Setelah 30 menit, peningkatan absorbansi diukur pada 450 nm menggunakan spektrometer

- Prinsip uji: Cu(II) Cu(I) antioksidan

2.4.57. METODE PHOSFOMOLIBDAT

Prinsip Uji: mengukur reduksi Mo (VI) menjadi Mo (V) (berwana hijau) oleh antioksidan pada pH asam

Pereaksi: Phosfomolibdat (asam sulfat, Na fosfat, amonium molibdat)

Prosedur: sampel + pereaksi → inkubasi suhu 95 °C, 90 min → biarkan dingin

→ serapan diukur pada 695 nm pada spektrofotometer Sampel dan blanko → dilakukan dengan metode sama

▪ Aktivitas antioksidan dinyatakan sebagai : μg ekivalen dengan asam askorbat (AAE) per mL.

Keunggulan: murah, reproduksible, reaksi tidak terganggu olehpelarut organik

8. METODE FTC

(Ferric thiocyanate)

▪ Pereaksi: Campuran asam linoleat dan buffer fosfat

▪ Prosedur: sampel + pereaksi → inkubasi pada 40°C selama 96 jam (selama inkubasi (tiap12 jam) tambahkan amonium thiosianate dan FeCl₂ dlm HCl) → setelah 3 menit terbentuk warna merah → absorbansi diukur pada 500 nm tiap 24 jam

with sample and without reagents was used as negative control.

9. METODE RP (Reducing Power)

Pereaksi:

Buffer Na phosphate dan K ferricyanide [K₃Fe(CN)₆] Prinsip uji: Antioksidan membentuk kompleks berwarna dgn

pereaksi. Absorbansi meningkat, aktivitas antioksidan meningkat.

Prosedur: sampel + Buffer Na phosphate dan K ferricyanide → inkubasi 50 C, 20 min → tambah Trichloro acetic acid 10% →

sentrifugasi pada 3000 rpm,10 min → Supernatan + ferric chlorida 0,1% → homogenkan → absorbansi diukur pada 700 nm

Dilakukan jg percobaan pd blanko

10. METODE LPIC

(Lipid Peroxidation Inhibitory Capacity)

Substrat: emulsi asam Linoleat (asam lemak tidak jenuh)

Prosedur: Sampel + Asam linoleat + Tween-20 dalam buffer fosfat → sonikasi → inkubasi 25 min pada 37 °C. Tiap 24 jam, sampel diambil + etanol + ferrous

chloride → homogenkan → tambahkan potassium thiocyanate solution →

absorbansi diukur pada 500 nm. Blanko terdiri dari emulsi asam linoleat dan buffer fosfat.

Sampel: dapat berupa ekstrak

11. METODE H₂O₂

(Hydrogen peroxide scavenging)

• H₂O₂ cepat terurai menjadi oksigen dan air dan menghasilkan radikal hidroksil (OH^•) → menginisiasi peroksidasi lipid dan kerusakan DNA

• Pereaksi: H₂O₂ (40Mm) dlm buffer fosfat (pH 7,4)

• Prosedur: sampel + pereaksi → setelah 10 menit absorbansi diukur pada 560 nm dgn spektrofotometer UV.

• Percentage scavenged [H₂O₂] = 1- Abs (standard)/Abs (control) x100 Note: abs control (tanpa ekstrak); abs sampel (dengan ekstrak)

12. Nitric oxide scavenging activity

• Dalam larutan berair, Na nitroprusside terdekomposisi menghasilkan NO^•. Pada kondisi aerobik, NO^• bereaksi dengan oksigen menghasilkan nitrat dan nitrit.

• Pereaksi 1: Na nitroprusside dalam buffer fosfat

• Pereaksi 2: pereaksi Griess (asam sulfanilat + naphthylethylenediamine dichloride)

• Prosedur: sampel + pereaksi 1 → inkubasi pada 25 C → setelah 150 menit campur dengan pereaksi 2 → inkubasi 30 menit dan absorbansi diukur

pada 546 nm.

with sample and without reagents was used as negative control.

13. Peroxynitrite radical scavenging activity

• Peroxynitrite (ONOO^•): suatu sitotoksikan

• Pereaksi: dihydroxyrhodamine 123 (DHR 123)

• Prosedur: aktivitas peredaman ONOO^• dengan mengoksidasi DHR 123 yang diukur menggunakan fluorescence spectrophotometer dengan panjang gelombang eksitasi pada 485 nm dan emisi pada 530 nm, pada suhu ruang

with sample and without reagents was used as negative control.

14. DMPD (N,N-dimethyl-p-phenylene diamine dihydrochloride) method

Prinsip uji: ferric chloride dalam suasana asam mengubah DMPD → DMPD^·+ (berwarna ungu). Dengan adanya antioksidan (pendonor atom H) mengubah DMPD^·+ menjadi tidak berwarna. Serapan diukur pada 505 nm.

Sampel: Cocok untuk senyawa antioksidan hidrofilik Standar: Trolox

Keunggulan: stabilitas end point tinggi, waktu reaksi yang cepat, relative murah, praktis Keterbatasan: asam organic (misal asam sitrat) dapat berinteraksi pada pengujian ini, penurunan reproduksibilitas pada pengujian dengan antioksidan hidrofobik

15. β-carotene linoleic acid method/

conjugated diene assay

Prinsip uji: ROS mengoksidasi asam linoleat, produk yg terbentuk menginisiasi oksidasiβ-carotene yg akan menyebabkan perubahan warna. Adanya antioksidan akan menurunkan tingkat perubahan warna, yang diukur pada 434 nm.

Standar: vitamin C

Kelemahan: tidak cocok untuk uji antioksidan yg mengandung triasilgliserol, asam linoleat sbg substrat membentuk misel pada sistem berair.

METODE UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN (IN VIVO)

1. Ferric reducing ability of plasma (FRAP)

• Pereaksi: FRAP reagent (TPTZ (2,4,6-tripyridyl-s-triazine) and FeCl₂.6H₂O)

• Prinsip: mengukur penurunan intensitas warna biru [Fe+2-TPTZ Tripyridyltriazine] pada 593 nm (kondisi pH rendah)

2. Reduced glutathione (GSH) estimation

• Pereaksi: Ellman’s reagent (5,5-dithiobis-2nitrobenzoic acid (0.1 mM) dan buffer fosfat dengan larutan Na. sitrat ➔ ukur pada 412 nm

3. Glutathione peroxidase (GSHPx) estimation

• absorbansi pada 340 nm pada interval 1 menit selama 5 menit. Aktivitas enzim GSHPx diekspresikan dalam bentuk mg protein

In Vivo models

4. Lipid peroxidation (LPO) assay

• dilakukan dgn mengukur malondialdehyde (MDA).

• tingkat peroksidasi lipid diekspresikan sebagai n mol dari thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)/mg protein

5. Catalase (CAT)

• pengukuran pada 240 nm selama 1 menit dgn spectrophotometer.

• The molar extinction coefficient of H₂O₂ 43.6 M/cm was used to determine the catalase activity.

• satu unit aktivitas setara dgn 1 mmol H₂O₂ yg terdegradasi per minute dan hasil dilaporkan sebagai units/mg protein

In Vivo models

6. Superoxide dismutase (SOD) method

• One unit of enzyme activity is 50% inhibition of the rate of autooxidation of pyrogallol as determined by change in absorbance/min at 420 nm.

• The activity of SOD is expressed as units/mg protein

7. Glutathione reductase (GR) assay

• The oxidation of 1 µM of NADPH/min under these conditions is used as a unit of glutathione reductase activity.

• The specific activity is expressed as units/mg protein

METODE POPULER

(Alam et al 2013)

TERIMAKASIH