Analisa Flow Cytometry pada Subpopulasi Sel T-Limfosit Bursa Fabricius Ayam Pedaging Pasca Infeksi Salmonella typhimurium dan Pemberian Pakan Tambahan
Polyscias obtusa
Septi Utami Dewi1, Mochammad Sasmito Djati1, Muhaimin Rifa’i1
1Jurusan Biologi, Universitas Brawijaya Malang
Alamat korespondensi : septiutamidewi@gmail.com
ABSTRAK
Tujuan penelitian ini adalah mengetahui adanya aktivitas imunomodulator daun Polyscias obtusa pada organ bursa fabricius ayam pedaging yang terinfeksi bakteri Salmonella typhimurium, serta mengetahui dosis optimum penambahan daun Polyscias obtusa dalam mempengaruhi jumlah subpopulasi T-limfosit pada organ bursa fabricius ayam pedaging yang terinfeksi Salmonella typhimurium. Prosedur kerja yang dilakukan adalah konfirmasi isolat bakteri Salmonella typhimurium, pemberian daun Polyscias obtusa, infeksi bakteri Salmonella typhimurium, pembedahan, isolasi sel, analisis Flow Cytometri, analisis data. Hasil penelitian menunjukkan bahwa Pemberian pakan alami dengan tambahan daun Polyscias obtusa dengan variasi dosis 0,08%, 0,16%, tidak memberikan pengaruh terhadap jumlah relatif CD8+ dan B220+ pada Bursa fabricius. Sehingga, tidak ada perbedaan yang signifikan antara pakan pabrik dan pakan alami dengan tambahan daun Polyscias obtusa.. Namun, pada dosis 0,26 % fase finisher terlihat peningkatan jumlah relatif sel CD4+ yang siginifikan dibandingkan fase starter. Dapat disimpulkan bahwa, dosis 0,26% merupakan dosis optimum dalam meningkatkan proses proliferasi jumlah sel CD4+ sebagai agen imunomodulator pada bursa fabricius ayam pedaging.
Kata kunci : Ayam pedaging, bursa fabricius, flow cytometry, Polyscias obtusa, Salmonella
typhimurium typhymurium
ABSTRACT
This study aimed to determine the development of T lymphocytes from bursa fabricius of broiler that have been given additional feed Polyscias obtusa after infected Salmonella typhimurium and determine the optimum dose of the addition of leaf Polyscias obtusa in influencing the number of T-lymphocyte subpopulations in organ bursa fabricius Salmonella thypimurium infected broiler. The procedure is the confirmation of the Salmonella typhimurium isolates, giving the leaves Polyscias obtusa, Salmonella
typhimurium bacterial infections, surgery, cell isolation, Flow Cytometry analysis, data analysis. The
results showed that natural feeding with additional Polyscias obtusa leaves with a dose variation of 0.08%, 0.16%, does not give effect to the relative amount, CD8+ and B220+ on the Bursa fabricius. There wasn’t significant between the feed mill and natural food with Polyscias obtusa. Dose of 0.26% proved to increase the relative number of CD4 + cells significantly in organ bursa fabricius. The results of CD4 + T cell activation would play an important role in establishing and maximizing the body's immune system. Keywords : broiler, bursa fabricius, flow cytometry, Polyscias obtusa, Salmonella typhimurium
PENDAHULUAN
Indonesia merupakan negara dengan sentra peternakan hewan unggas yang cukup tinggi, salah satunya adalah sentra peternakan ayam pedaging (broiler). Pakan ayam pedaging pada umumnya tersusun atas
kebutuhan pertumbuhan, energi, dan
membantu sistem metabolisme serta
meningkatkan ketahanan tubuh ayam. Oleh sebab itu, para peternak ayam pedaging selalu memberikan vaksin dan antibiotika untuk
mengurangi penyakit-penyakit tersebut.
Namun, beberapa vaksin dan antibiotika
merupakan zat bioaktif yang memiliki dampak negatif pada kesehatan konsumen daging ayam [1]. Sehingga diperlukan adanya
alternatif untuk melindungi kesehatan
konsumen dari efek samping penggunaan vaksin dan zat antibiotika.
Pakan alternatif ini diharapkan dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh ayam.
Pakan alternatif tersebut adalah daun
Kedondong Laut (Polyscias obtusa) yang merupakan salah satu obat herbal dengan kandungan senyawa polysciosida [2].
Senyawa tersebut memiliki peran dalam sistem imunitas dan humoral serta merupakan
senyawa dari kelompok asam oleanic saponin. Saponin adalah senyawa yang berperan dalam proses mengalirnya nutrisi pada hewan dan manusia. Saponin juga diketahui dapat berperan dalam permeabilitas membran, sebagai imunostimulan, agen karsinogen, dan hypocholesterolaemic [3].
Selain saponin, terdapat pula flavonoid. Senyawa flavonoid dikenal berperan sebagai
agen imunomodulator, antiviral dan
antioksidan. Senyawa flavonoid juga diduga
dapat memacu proliferasi limfosit,
meningkatkan jumlah sel T dan meningkatkan aktivitas IL-2 [4]
Berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan dengan menggunakan hewan coba
mencit dan terinfeksi Salmonella
typhimurium, khasiat daun Polyscias obtusa
dapat memobilisasi haematopoetic stem cells [5]. Oleh karena itu, penelitian ini menggunakan hewan coba ayam pedaging (broiler) agar lebih aplikatif dan mengetahui secara spesifik pada organ bursa fabricius.
Pendewasaan limfosit B terjadi di bursa fabricius pada unggas, sedangkan pada mamalia terjadi di hati fetus, tonsil, usus buntu dan jaringan limfoid dalam dinding usus. Pendewasaan limfosit T terjadi di organ timus [6]. Sehingga diharapkan dapat
diperoleh informasi mengenai aktifitas
haematopoetic stem cell (CD4+, CD8+,
B220+) dengan infeksi Salmonella
typhimurium dan diamati modulasi serta
perkembangan imunitas seluler.
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat
Percobaan ini dilakukan pada
Maret-September 2012 di laboratorium
Mikrobiologi, Laboratorium Fisiologi Hewan, Fakultas MIPA, Jurusan Biologi, serta Laboratorium Lapang Sumber Sekar-DAU Fakultas Peternakan, Universitas Brawijaya, Malang.
Deskripsi Hewan Coba dan Estimasi Besar Sampel
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah DOC broiler strain
Lohman varian platinum. Ayam akan
dipelihara selama 1 bulan. Penelitian ini menggunakan 5 perlakuan dengan setiap
perlakuan 3 ulangan, dan masing-masing ulangan di duplo. Sehingga jumlah seluru seluruh sampel ayam yang digunakan adalah 60 ekor.
Deskripsi Perlakuan dan Rancangan Percobaan
Penelitian ini menggunakan rancangan acak kelompok yang terdiri dari 5 perlakuan dengan 3 ulangan pada masing-masing perlakuan seperti pada tabel berikut:
Tabel 3.1. Rancangan Kelompok perlakuan
Perlakuan Kelompok Starter Finisher
Pakan Pabrik A1B1
(T0) A1B2 (T0) Pakan Pabrik+ Salmonella thypimurium A2B1 (T1) A2B2 (T1) Polyscias obtusa (0,08%) + Salmonella thypimurium A3B1 (T2) A3B2 (T2) Polyscias obtusa(0,16%) + Salmonella thypimurium A5B1 (T3) A5B1 (T3) Polyscias obtusa (0,26%) + Salmonella thypimurium A7B1 (T4) A7B2 (T4)
Pemberian Daun Polyscias obtusa
Bagian tanaman Polyscias obtusa yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun dewasa. Daun Polyscias obtusa kemudian dicuci dan dikering anginkan. Kemudian dihaluskan menggunakan blender kering. Hasil tersebut kemudian disaring. Bubuk
Polyscias obtusa ditimbang untuk selanjutnya
digunakan sebagai campuran pakan tambahan ayam pedaging.
Infeksi bakteri Salmonella typhimurium
Salmonella typhimurium yang telah
dikonfirmasi sebelumnya dan disimpan dalam medium NA miring ditumbuhkan pada medium cair NB dan diinkubasi selama 1 x 24
jam. Medium NB baru tersebut dihitung jumlah sel bakteri tiap 1 jam untuk
mendapatkan jumlah sel bakteri 108 sel/ml.
Perhitungan sel dilakukan dengan
menggunakan haemocytometer. Biakan
bakteri yang telah difiksasi dengan
menggunakan larutan formalin 4%, dihitung
dengan menggunakan haemocytometer.
Berdasarkan perhitungan tersebut diperoleh jumlah sel bakteri sebanyak 727 sel/ml. Selanjutnya dilakukan sentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit pada
suhu 250 C. Pellet yang diperoleh diresuspensi
dengan larutan garam fisiologis NaCl 0,9%. Suspensi trsebut kemudian diinfeksikan pada
broiler yang digunakan pada percobaan.
Pembedahan
Kegiatan ini dibagi menjadi 2 yaitu satu kali pada fase starter dan satu kali pada fase finisher. Pada fase starter pembedahan dilakukan pada saat ayam berumur 17 hari. Selanjutnya pada fase finisher ayam dibedah pada umur 35 hari.
Kegiatan ini dilakukan dengan
menyembelih ayam pedaging fase stater sejumlah 30 ekor, dan pada fase finisher sejumlah 30 ekor. Setelah disembelih dan diambil organ bursa fabricius, organ tersebut disimpan dalam suhu rendah agar sel-sel pada organ tetap stabil. Selanjutnya, organ tersebut dibawa ke Laboratorium Fisiologi Hewan, Jurusan Biologi Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya untuk diisolasi sel dari organ bursa fabricius.
Isolasi Sel
Sel yang akan dihitung populasinya, diisolasi dari organ bursa fabricius. Sel tersebut digerus dengan menggunakan ujung
spuid, dan disuspensi dengan PBS.
Selanjutnya sel-sel difilter menggunakan
wire. Kemudian hasil yang diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm pada suhu 200C selama 5 menit. Supernatan
yang diperoleh dibuang dan pellet
diresuspensi dengan PBS 1 ml. Selanjutnya
dilakukan pipeting untuk mendapatkan
homogenat, dipindahkan pada mikrosentrifuse baru dan ditambah 500 µl lalu disentrifuse pada kecepatan 1500 rpm, suhu 200C selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pellet
selanjutnya diinkubasi dengan antibodi untuk proses analisis selanjutnya.
Analisis Flowcytometri
Sel yang telah diisolasi dan diperoleh, selanjutnya dianalisis Flow Cytometry untuk
mendeteksi subpopulasi T-limfosit (CD4+,
CD8+, B220+ ). Analisis dilakukan dengan
komputer dan diatur pada keadaan acquiring serta dilakukan setting sesuai parameter yang akan dianalisis. Kemudian sampel yang telah diberi antibodi ditambah 1 ml PBS dan ditempatkan pada kuvet flowcytometer. Selanjutnya dipilih acquire dan flowcytometer akan menghitung jumlah sel total serta jumlah sel yang terdeteksi oleh label antibodi. Hasil yang diperoleh akan diolah dengan program
BD cellquest Pro TM.
Analisis Data
Analisis data dilakukan dengan
menggunakan metode One Way ANOVA pada program SPSS 16 for Windows.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Senyawa flavonoid yang terkandung dalam daun Polycias obtusa adalah sebagai imunomodulator, yaitu dengan meningkatkan aktivitas IL-2 dan proliferasi limfosit. Telah diketahui bahwa IL-2 adalah sitokin yang berfungsi sebagai salah satu faktor limfosit berdiferensiasi. Resistensi hewan terhadap infeksi mikroba sangat tergantung pada aktivasi dari sel T-CD4+ yang berdiferensiasi menjadi dua kelompok berdasarkan pola sekresi sitokin, yaitu pola respon Th1 dan pola respon Th2 [7].
Ayam adalah salah satu sumber
penularan penting Salmonella typhimurium. Masalahnya berawal dari peternakan, dimana anak ayam yang dipelihara dalam kondisi komersial sangat rentan terhadap infeksi
Salmonella typhimurium karena mikroflora
usus lambat berkembang sehingga kalah bersaing jika ada serangan bakteri pathogen enterik [8].
Perbandingan Jumlah Relatif Sel CD4+ pada organ Bursa Fabricius Kelompok Starter dan Finisher
Gambar 1. Jumlah Relatif Sel T CD4+
(%)fase Starter dan Finisher (p>0.05)
Berdasarkan gambar 1, dapat
disimpulkan bahwa semua perlakuan dengan
menggunakan pakan pabrik maupun
Polyscias obtusa tidak memberikan pengaruh
yang berbeda nyata (p>0,05) dalam
meningkatkan jumlah relatif sel CD4+ pada
fase starter dan finisher ayam pedaging, khususnya pada organ bursa fabricius.
Namun, pada dosis 3 (T4) terlihat
peningkatan jumlah relatif sel CD4+ yang
siginifikan. Hal ini berarti bahwa, dosis 0,26% merupakan dosis optimum dalam meningkatkan proses proliferasi jumlah sel
CD4+ pada bursa fabricius ayam pedaging.
Hasil yang tidak signifikan ini
disebabkkan karena waktu perlakuan masih dalam tahap adaptasi. Respon imunologik hewan muda masih berada pada tingkatan imunologis paling rendah [9]
Perbandingan Jumlah Relatif Sel CD8+ pada organ Bursa Fabricius Kelompok Starter dan Finisher
Gambar 2. Jumlah relatif sel CD8+ (%) bursa fabricius fase Starter dan Finisher (p>0,05)
Berdasarkan gambar diatas, jumlah
relatif sel CD8+ pada fase starter
menunjukkan bahwa perbedaan tiap
perlakuan tidak signifikan. Perlakuan T2 memiliki jumlah relatif sel CD8+ lebih tinggi 2,14 % dari perlakuan T1 yang berjumlah
1,09%. Kemudian pada perlakuan T3
mengalami peningkatan sebesar 1,59% jika
dibandingkan dengan perlakuan T1.
Selanjutnya pada perlakuan T4 juga
mengalami peningkatan sebesar 1,84%
dibandingkan dengan perlakuan T1. Namun, dari seluruh perlakuan, dosis 1 (T2) memiliki
jumlah relatif sel CD8+ yang lebih tinggi. Hal
ini dikarenakan bakteri Salmonella
typhimurium merupakan bakteri intraseluler,
sehingga tubuh membutuhkan peran dari sel CD8+ yang merupakan sel T sitotoksik yang berperan dalam membunuh sel-sel yang terinfeksi oleh bakteri tersebut. Sehingga pada fase starter, dosis Polyscias 0,08% optimum
untuk meningkatkan jumlah relatif sel CD8+.
Perbandingan Jumlah Relatif Sel B220+ pada organ Bursa Fabricius Kelompok Starter dan Finisher
Sel limfosit B berasal dari sumsum tulang belakang dan mengalami pendewasaan pada jaringan ekivalen bursa. Jumlah sel limfosit B dalam keadaan normal berkisar antara 10 dan 15%. Setiap limfosit B memiliki 105 B cell receptor (BCR), dan setiap BCR memiliki dua tempat pengikatan yang identik [10].
Gambar 3. Jumlah Relatif sel B220+
pada fase Starter dan Finisher (p>0,05) Berdasarkan Gambar 3, jumlah relatif sel B220+ pada fase starter di semua perlakuan mengalami perbedaan yang tidak signifikan. Perlakuan T2 memiliki jumlah relatif sel
B220+ sebesar 7,30% jika dibandingkan T3,
T1, dan T4 yang bejumlah 4,17%, 5,22%, dan 1,33%. Hal ini berarti bahwa masing-masing
perlakuan tidak berbeda nyata dan tidak
berpengaruh terhadap jumlah relatif B220+.
Selanjutnya, pada fase finisher mengalami
peningkatan jumlah relatif sel B220+ yang
cenderung tinggi dibandingkan pada fase starter. Namun, perbedaan jumlah relatif sel antar perlakuan pada fase finisher mengalami perbedaan yang tidak siginifikan tidak memberikan pengaruh terhadap jumlah relatif sel B220+ .
KESIMPULAN
Pemberian pakan alami dengan
tambahan daun Polyscias obtusa dengan
variasi dosis 0,08%, 0,16%, tidak
memberikan pengaruh terhadap jumlah
relatif, CD8+ dan B220+ pada bursa fabricius.
Sehingga, tidak ada perbedaan yang
signifikan antara pakan pabrik dan pakan alami dengan tambahan daun Polyscias
obtusa. Dosis 0,26% terbukti mampu meningkatkan jumlah relatif sel CD4+ secara signifikan pada organ bursa fabricius. Hasil
aktivasi sel T CD4+ akan memainkan peran
penting dalam mendirikan dan
memaksimumkan sistem kekebalan tubuh.
UCAPAN TERIMA KASIH
Ucapan terimakasih diberikan kepada Project Staff Research Grant IM-HERE 2011/2012.
DAFTAR PUSTAKA
[1] Lee, Dhany. 2008. Vietnamese Ginseng. (Online), (http://Vietnam Overseas - A Worldwide Resource for Vietnamese Culture,Business,andTelecommunicati
on/2008/November.mht, diakses
tanggal 15 Juli 2012)
[2] Huan, V. D.,Satoshi Y., Kazuhiro O., Ryoji K., Kazuo Y., Nguyen T. N., Hoang M. C. 1998. Oleanane Saponins
From Polyscias Fruticosa.Abstrak
Sciencedirect, 15 Juli 2012)
[3] Francis, G., Zohar K., Harinder P. S. M., Klaus B. 2002. The biological action of saponins in animal systems. British
Journal of Nutrition, 88: 587–605
[4] Abbas, A.K., dan A.H. Lichtman. 2005. Cellular and Molecular Immunology.
Fifth Edition. W.B. Saunders
Company. California
[5]Wulan, S. 2012. Mobilisasi Hematopoietic
Stem Cells dengan Menggunakan Daun Polyscias Obtusa pada Pakan untuk Meningkatkan Imunitas Seluler Anak Ayam Pedaging. Fakultas MIPA,
Universitas Brwijaya.
[6] Eerola E, Veromma T, Toivanen P. 1987. Special Features in The Structural Organization of The Avian Lymphoid System Avian Immunology : Basic and Practice. Boca Raton : CRC Pr. hlm : 9-21
[7] Tizard, I.R. 2000. Immunology: An
Introduction 6th Ed. New York:
Saunders College Publishing. pp.98-161.
[8] Fenner J, Fransk. 1995. Virologi
Veteriner. Edisi ke-2. Harya P,
Penerjemah. Semarang : IKIP
Semarang Press
[9] Thorns, C.J., I.M. Mc Laren, and M.G. Sojka. 1994. The Use Of Latex
Agglutination To Specifically Detect Salmonella typhimurium Enteritidis.
Int. J. Food Microbiol. 21: 47– 49. [10] Samuel, C.E. 2001. Antiviral actions of
interferon. Clinical Microbiol. Rev.
