Plasma Seminalis Sapi Memperbaiki Membran Plasma Spermatozoa Kambing dalam Bahan Pengencer Susu pada Proses Pembekuan Semen
Effect of Seminal Plasm of Cow on Goat’s Spermatozoa Plasma Membran in Milk Diluter on Semen Freezhing
Suherni Susilowati
Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo Surabaya-60115
Telp.031-5992785, Fax. -031-5993015 Email:scorpios_girl88@yahoo.co.id
Abstract
Up till now semen freezing process of ram’s spermatozoa has not yet satisfying, this is because ram’s seminal plasma contain phospholipase A from bulbourethral gland, that can coagulate with egg yolk in diluter. Because of that researchers want to replace ram’s seminal plasma with bull’s seminal plasma in milk diluter media.
Special aim of this research is to understand the benefit of bull’s seminal plasma in diluter of ram’s spermatozoa. General purpose of this research is using bull’s seminal plasma in diluter of ram’s spermatozoa to improve fresh semen quality and even frozen semen.
This research consists of three treatments. Control treatment (PO) are diluter + ram’s semen (without seminal plasma). Treatment I (PI) are diluter + spermatozoa + bull’s seminal plasma (1:1), treatment II (PII) are diluter + spermatozoa + bull’s seminal plasma (1:2). All of treatments observed everyday of motility, viability, plasma membran integrity and spermatozoa’s DNA integrity.
Observation in diluter without seminal plasma shows lowest spermatozoa’s membrane plasma integrity in day I, II, III, IV, and V. Anova test for spermatozoa’s membrane plasma integrity shows significant different (p <0,05) between PO, PI, PII, and PIII. Duncan's multiple range test for observation PI group produce highest spermatozoa’s membrane plasma integrity percentage.In conclusion, addition of bull’s seminal plasma can mantain, membrane plasma integrity in skim milk diluter.
Keywords: seminal plasma, bull, ram’s, membran plasma integrity Pendahuluan`
Semen Beku merupakan proses pembekuan semen pada suhu -196oC dengan menggunakan media nitrogen cair (Direktorat Jenderal Produksi Peternakan, 2007). Proses pembekuan menyebabkan kerusakan fungsi maupun struktur membrane dan kemampuan spermatozoa untuk mempertahankan hidup (Lessard et al, 2000). Tujuan dari proses pembekuan adalah mempertahankan sesempurna mungkin beberapa sifat dari materi biologis terutama viabilitasnya (Supriatna dan Pasaribu, 1992). Kendala utama dari proses pembekuan ini adalah terjadinya kerusakan sel. Penyebabnya antara lain karena proses dehidrasi tidak terjadi sehingga terbentuk kristal-kristal es intraseluler yang dapat merusak sel. Selain itu juga dapat karena peningkatan osmolaritas media
pembekuan sehingga krioprotektan bersifat racun selanjutnya terjadi kerusakan fisik yaitu terbentuknya Kristal es ekstraseluler, toksisitas dari elektrolit yang pekat atau terjadinya osmotic swelling (Kassai, 1996). Kerusakan selama pembekuan biasa terjadi pada membrane plasma maupun pada inti spermatozoa. Kerusakan pada inti spermatozoa dapat menyebabkan mutasi gen.
Plasma seminalis dari semen terdiri dari bermacam-macam komponen biokimia yang spesifik yang mengatur fungsi spermatozoa. Menurut Riadi (2004) komposisi utama plasma semen air dan juga beberapa substansi organic dan anorganik. Plasma seminalis juga mengandung factor dekapasitasi (DF) yang pada waktu ejakulasi melapisi permukaan spermatozoa. Faktor-faktor dekapasitasi tersebut akan mengikat permukaan spermatozoa mengaktifkan kalsium intraseluler-ATP ase untuk mempertahankan konsentrasi kalsium intaseluler tetap rendah (Baldi et al, 2000).Factor yang terdapat didalam plasma seminalis dapat mempengaruhi viabilitas, motilitas dan integritas membrane spermatozoa dalam keadaan dingin (Beatriz et al, 2000). Perbaikan terhadap membrane plasma sel akan berpengaruh positif terhadap proses-proses biokimia di dalam sel dan pada akhirnya dapat memperbaiki kualitas spermatozoa yang lain seperti motilitas dan viabilitas spermatozoa. Penelitian biomolekuler membuktikan bahwa dengan penambahan beberapa protein saja dapat memperbaiki proses fertilisasi tetapi juga dapat mempertahankan kehidupan sel.
Sampai saat ini proses pembekuan semen kambing masih belum memuaskan, hal ini disebabkan karena plasma seminalis kambing mengandung fosfolipase A dari kelenjar bulbourethralis yang dapat mengkoagulasi kuning telur dalam bahan pengencer (Evans and Maxwell, 1988) .Selain itu membrane plasma spermatozoa rentan terhadap cekaman dingin.oleh karena itu peneliti ingin meneliti penggantian plasma semen kambing dengan plasma semen sapi dalam medium pengencer susu.
Materi dan Metode Penelitian 1. Penampungan Semen Sapi
Semen ditampung dari sapi pejantan Simental dengan menggunakan vagina buatan yang dilengkapi dengan tabung gelas penampung berskala. Vagina buatan disiapkan dengan memasang kedua selubung dan alat penampung yang telah disterilkan, sedangkan ruangan antara selubung luar dan dalam diisi dengan air hangat yang bersuhu 45o C dengan tujuan memberi suhu terhadap selubung dalam sebesar 42-43oC dan sepertiga bagian depan selubung dalam vagina buatan diolesi vaselin. Setelah vagina buatan selesai dipersiapkan, pejantan diberi rangsangan dengan betina pemancing kemudian dilakukan penampungan semen. Segera setelah penampungan, semen dibawa kelaboratorium untuk dipisahkan dari spermatozoa dan plasmanya digunakan untuk ditambahkan kedalam bahan pengencer semen kambing. Sebelumnya dilakukan pemeriksaan terhadap motilitas spermatozoa. Jika motilitas spernmatozoa > 70 % maka plasmanya dapat digunakan untuk penelitian lebih lanjut (Susilowati dkk, 2010).
Semen kambing ditampung dengan vagina buatan dan diperiksa secara makroskopis dan mikroskopis. Pemeriksaan makroskopis meliputi volume, warna, bau, konsistensi dan pH serta pemeriksaan mikroskopis meliputi gerakan massa, gerakan individu, viabilitas, konsentrasi dan resistensi test.
2. Pembuatan Bahan Pengencer Susu Dan Pengujian Membran Plasma Spermatozoa Susu skim ditimbang sebanyak 10 gram kemudian ditambah air 100 ml kemudian dipanaskan 92-95o C dan selanjutnya didinginkan smapai suhu 20-27oC. Ditambah Penicillin 1.000 IU/ ml dan Streptomycin 1 mg/ ml/ bahan pengencer.
Setelah bahan pengencer susu disiapkan kemudian semen kambing yang ditampung ditambahkan plasma seminalis sapi. Perlakuan Kontrol (PO) ada
lah bahan pengencer + semen kambing (tanpa penambahan plasma seminalis). Perlakuan I (PI) adalah bahan pengencer + spermatozoa + plasma seminalis sapi (1:1), Perlakuan II (PII) adalah bahan pengencer + spermatozoa + plasma seminalis sapi (1:2). Kemudian ketiga perlakuan tersebut diperiksa setiap hari terhadap keutuhan membran plasmanya spermatozoa. Pengujian keutuhan membrane plasma spermatozoa dengan Hipoosmotic Swelling Test.
Sebanyak 1 ml larutan hipoosmotic (7,35 gram Na Sitrat 2 H2O, 13,52 gram fruktosa dilarutkan dalam 1000 ml aquades) ditambah dengan 0,1 ml spermatozoa kemudian diinkubasi pada suhu 37o C selama 30 menit dan diamati dengan mikroskop perbesaran 400 x. Spermatozoa dengan membran plasma utuh ditandai dengan ekor spermatozoa yang melingkar karena membran plasma spermatozoa masih berfungsi dengan baik dalam penyerapan air pada lingkungan yang bersifat hipotonik. Spermatozoa yang membrannya rusak ditandai dengan ekor yang lurus.
Data hasil yang diperoleh ditabulasikan sesuai dengan variabel yang diamati. Hasil pengamatan membran plasma utuh spermatozoa dilakukan dengan F test dan bila ada perbedaan dilanjutkan dengan Uji BNT (Santoso dan Fandy, 2001)
Hasil dan Pembahasaan
Penampungan Semen Sapi untuk diambil plasma semennya
Pada penelitian ini dibutuhkan semen segar sapi yang diperiksa secara makroskopis dan mikroskopis. Pemeriksaan makroskopis meliputi : volume, warna, bau, kossistensidan derajat keasaam atau pH. Pemeriksaan mikroskopis meliputi : gerakan masssa, gerakan inidu, konsentrasi dan daya tahan hidup spermatozoa. Dibawah ini tercantum hasil pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis (Tabel 1). Tabel 1. Pemeriksaan Rata-rata Makroskopis dan Mikroskopis Semen Sapi
Indikator Volume Konsistensi Warna Bau pH Gerakan massa Gerakan individu Motilitas Konsentrasi 5.5 ml Kental Putih susu Khas 6,5 +++ Progresif (P) 80% 2.318x106 spz/ml
Menurut Salisbury and Van Demark (1985), volume semen pejantan yang diejakulasikan tidaklah sama antara jenis pejantan dan pejantan itu sendiri. Pada umumnya volume semen akan bertambah banyak sesuai dengan umur, besar tubuh, perubahan keadaan, kesehatan organ reproduksi dan frekuensi penampungan semen. Warna, konsistensi dan konsentrasi mempunyai hubungan erat satu sama lain. Semakin encer suatu semen maka konsentrasi spermatozoa akan rendah dan warna semen semakin pucat. Sedangkan konsistensi semen tergantung pada perbandingan spermatozoa dan plasma semen (Evans and Maxwell, 1987). Derajat keasaman (pH) sangat mempengaruhi daya hidup spermatozoa. Bila pH tinggi atau rendah akan
menyebabkan spermatozoa tersebut mati. Derajat keasaman (pH) semen kemungkinan dipengaruhi oleh konsentrasi asam laktat yang dihasilkan dalam proses akhir metabolisme. Menurut Toelihere (1985), metabolisme spermatozoa dalam keadaan anerobik akan menghasilkan asam laktat yang tertimbun dan meningkatkan atau menurunkan pH semen.
Membran plasma spermatozoa kambing yang diencerkan dengan susu skim yang ditambah dengan plasma semen sapi
Spermatozoa dengan membran plasma utuh ditandai dengan ekor spermatozoa yang melingkar sebagai akibat masih berfungsinya membran dalam penyerapan air pada lingkungan yang bersifat hipotonik. Spermatozoa yang membrannya rusak ditandai dengan ekor yang lurus dapat dilihat pada Gambar 1.
Rerata persentase membran plasma utuh (MPU) spermatozoa dilakukan dengan menggunakan mikroskop fase kontras pembesaran 400 x hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2
Tabel 2. Rerata dan SD Membran Plasma Utuh spermatozoa kambing yang diencerkan dengan susu skim dan diperiksa setiap hari setelah perlakuan (6 kali ulangan) Perlakuan Hari I(%) Hari II(%) Hari III (%) Hari IV
(%) Hari V (%) P0(Tanpa plasma semen sapi) 55± 2,75c 52 ± 2,75c 47 ± 1,80c 43 ± 1,35c 31 ± 1,20c P1 (1:1) 76 ± 2,55a 70 ± 2,70a 67 ± 1,90a 57 ± 1,30a 50 ± 1,30a P2 (1:2) 68 ±2,15b 65 ± 2,65b 60 ± 1,85b 56 ± 1,20b 48 ± 1,25b Huruf yang berbeda pada kolom yang sama berbeda nyata (p<0,05)
Keterangan :
P0 : spermatozoa kambing + pengencer susu
P1 : 1 bagian spermatozoa kambing + pengencer susu + 1 bagian plasma semen sapi P2 : 1 bagian spermatozoa kambing + pengencer susu + 2 bagian plasma semen sapi
Gambar 1. Membran plasma spermatozoa yang utuh dan rusak
Keterangan : A. Spermatozoa yang membran plasmanya rusak (ekor lurus) B. Spermatozoa yang membran plasmanya utuh (ekor melingkar)
Pada tabel 2 dapat dilihat bahwa penambahan plasma seminalis sapi dalam bahan pengencer spermatozoa kambing menghasilkan pola perbedaan yang nyata pada
B
membran plasma spermatozoa. Pengamatan dalam bahan pengencer semen tanpa penambahan plasma seminalis menghasilkan persentase membran plasma spermatozoa yang paling rendah baik pada hari I, II, III, IV dan V. Uji Anava terhadap membran plasma spermatozoa terdapat perbedaan yang nyata (p<0,05) antara P0, PI dan PII. Uji Jarak Berganda Duncan pengamatan pada kelompok P1 menghasilkan persentase membran plasma spermatozoa yang paling tinggi.
Keutuhan membran plasma spermatozoa diperlukan untuk menjamin kelangsungan hidup dan keberhasilannyadalam membuahi sel telur. Selain itu membran plasma juga tidak dipertahankan dalam proses metabolisme (Garner and Hafez, 2000). Dampak buruik dari hasil pemisahan plasma seminalis adalah adanya peningkatan pembentukan Reacttive Oxygen Species (ROS) oleh spermatozoa.meningkatnya produksi ROS oleh spermatozoa se dalam organel maupun sel bahkan berasal dari luar sel (Agarwal, et al;2003). Dalam konsentrasi rendah ROS berperan penting sebagai mediator pada fungsi spermatozoa normal dan terlibat dalam hiperaktivasi, kapasitasi , reaksi akrosom serta fusi spermatozoa dengan sel telur. (de Lamirande et al, 1997; Suherni, 2008), akan tetapi bila kenaikan konsentrasi ROS diatas nilai normal dan tidak mampu dinetralisir oleh anti okdsidan yang ada pada spermatozoa, dapat menyebabkan peroksidasi lipid (Alvarez and Storey, 1982) yang akhirnya dapat merusak membran (Halliwell and Gutteridge, 1999). Rusaknya membran sel akan meningkatkan permeabilitas membran sel , sehingga bahan-bahan yang semestinya tidak boleh melewati membran sel dapat dengan bebas keluar masuk sel dan akhirnya integritas spermatozoa terganggu (Agarwal et al, 2003).
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwadalam mempertahankan membran plasma utuh terlihat pada penambahan dengan plasma seminalis sapi. Hal ini kemungkinan plasma seminalis sapi tidak mengandung enzim fosfolipase A dan dapat bertindak sebagai antioksidan., tetapi apakah dengan jalan mencegah terhimpunnya senyawa-senyawa oksidan secara berlebihan ataukah mencegah reaksi rantai berlanjut belum jelas.
Makin lama waktu penyimpanan ROS yang terbentuk makin banyak sehingga tidak mampu diredam oleh sistem antioksidan yang ada. Makin banyak produksi ROS yang terbentuk maka tingkat peroksidasi lipid pada membran spermatozoa juga meningkat. . hal tersebut karena terjadi reaksi rantai dan putusnya rantai asam lemak menjadi berbagai senyawa yang toksik terhadap sel (Suryohudoyo, 2000).
Kesimpulan
Penambahan plasma semen sapi dapat mempertahankan membran plasma utuh spermatozoa kambing dalam bahan pengencer susu skim pada proses pembekuan. Daftar Pustaka
Agarwal, A, R.A.Saleh and M.A. Bedalwy. 2003. Role of Sperm Parameter to level of Reactive Oxpecies in Semen Specimens. Urol. 152 : 107-110
Alvarez, J.G. and B. Storey. 1995. Differential Incorporation of Fatty Acid Into and peroxidative Loss of Fatty Acid from Phospholipid of Human Spermatozoa Mol. Reprod.Dev. 42: 334-345.
Bald,i E, M. Luconi, L. Bonaccorsi, C. Krausz and G. Forti. 1996. Human Sperm Activation during Capacitation and Acrosom Reaction: Role of Calcium, protein
phosphorylation and Lipid Remodelling pathways. Frontiers in Bioscience. 1: 189-205.
Beatriz, B, Perez-Pe, A. Gallego Tato, J. Osada, T. Muino Blanco and J.A.Cebrian Perez. 2000. Seminal Plasma Protein Revert the Cold Shock Damage on Ram Sperm Membrane. Biology Reproduction. 63:1531-1537.
Garner and E.S.E. Hafez. 2000. Reproduction in Farm Animal. 7th Edition. Philadelphia. Baltimore. New York London.
Kassai, M. 1996. Simple and Efficient Methods for Vitrification of Mammalian Embryos. Animal Reproduction Sciences. 42(1): 67-75.
Lamirande, E.H., A. Jiang, H. Kodana, and C. Gagnon. 1997. Reactive Oxygen Species and Sperm Physiology. Rev.Reprod. 2(1) :48-54.
Lessard, C, S. Parent, P. Leclerc, J.L. Bailey and R. Sulivan. 2000. Cryopreservation Alters the Levels of the Bull Sperm Surface Protein P25b. J. Andrology. 21:700-707.
Ramukhiti, F, L. N. Tshimangadzo, B. Sutherland and C.L. Khoboso. 2011. Cryopreservation of South African indgenous goat semen. African Journal of Biotechnology. 10 (77): 17898-17901.
Riadi. 2004. Perubahan Karakter Ejakulat dan Aktifitas Antioksidan Pada Masa Reproduksi Kambing Kacang dan Kambing Peranakan Ettawa. Disertasi. Program Pasca sarjana. Unair. 18-25.
Santoso, S dan T. Fandy. 2001. Riset Pemasaran. Konsep dan Aplikasi dengan SPSS. P.T. Gramedia Jakarta.
Suryohudoyo, P. 2000. Ilmu Kedokteran Molekuler. Cetakan Pertama. Jakarta. CV Sagung Seto. 31-47.
Susilowati, S, Hardijanto, T.Sardjito, T. Hernawati dan T.W.Suprayogi. 2010. Penuntun Praktikum Inseminasi Buatan. Fakultas kedokteran Hewan Universitas Airlangga.langga University Press.
Susilowati, S. dan T. Hernawati. 2010. Penambahan Protein Insulin Like Growth Factor –I Complex Plasma Seminalis Dalam Medium Pengencer Guna memperbaiki Mutu Semen Beku Kambing.Laporan Hibah Kompetensi.
