Pengukuran Berat Molekul Mutlak Chitosan menggunakan GPC-MALLS Oleh
Mohd Yusof Hamzah*, Norhashidah Talip, Maznah Mahmud, Nor Akma Samsuddin, Norafifah Ahmad Fabillah
Bahagian Teknologi Sinaran
Makmal Nanoteknologi, Bangunan 64, Mint-Tech Park, Agensi Nuklear Malaysia,
43000, Kajang
Abstrak
Kajian sifat asas dan aplikasi praktikal chitosan amat memerlukan maklumat yang mendalam berkaitan ciri-ciri fizik kimia bahan semulajadi ini. Satu ciri fizik kimia yang amat penting bagi semua polimer adalah berat molekul mutlaknya. Kepentingan ciri ini dapat dilihat pada pengaruhnya yang amat besar terhadap sifat bukan koligatif satu-satu polimer itu, contohnya kelikatan, keterlarutan dan lain-lain. Berat molekul mutlak satu-satu polimer boleh diukur menggunakan GPC-MALLS. Alat ini berfungsi berasaskan pemisahan saiz molekul dan pengukuran berat molekul dibuat dengan mengintergrasi maklumat-maklumat seperti kepekatan sampel, indeks serakan cahaya dan maklumat tindak balas sampel polimer dengan cahaya laser dari 18 sudut. Dalam skop ini kami membincangkan pengukuran berat molekul mutlak chitosan menggunakan alat GPC-MALLS.
Katakunci/keyword: Penulenan, chitosan, berat molekul mutlak, laser
Pengenalan
Kitin (rajah 1) adalah bahan mukopolisakirida yang banyak terdapat dalam alam semulajadi. Ia adalah bahan utama yang terdapat pada cengkerang serangga dan krustasia seperti ketam dan udang. Ia mengandungi
2-acetamido-2-deoxy--D-glucose melalui satu sambungan (1-4). Ia boleh terdegradasi oleh enzim kitinase, ia tidak larut dalam air dan mirip seperti selulosa [1]. Chitosan (Rajah 2) adalah hasil nyah asetil kitin (Rajah 3). Ia mempunyai nilai komersil yang tinggi kerana kesesuaiannya dalam aplikasi bahan tambah makanan sebagai pemekat. Ia juga sesuai digunakan di dalam aplikasi perubatan kerana ciri-ciri seperti bioserasi, biodegradasi, tidak toksik, sifat jerapan dan lain-lain [2].
Rajah 1. Struktur kimia kitin
Rajah 2. Struktur kimia kitosan
Chitosan adalah satu bahan yang mempunyai pH asal yang agak tinggi (bes). Ia boleh membentuk filem dan menjerap bahan logam. Ia larut di dalam acid cair seperti asid asetik dan asid formic.
Salah satu sifat penting polimer adalah berat molekul. Berat molekul satu-satu polimer itu pada amnya boleh diukur menggunakan teknik kromatografi telapan gel (GPC) [3]. Kaedah ini pula terbahagi kepada 2 jenis.
Kaedah yang pertama adalah pembandingan dan yang kedua adalah teknik pengukuran mutlak [4]. Teknik pembandingan biasanya menggunakan bahan polimer piawai. Bahan polimer piawai merujuk kepada satu siri polimer yang diketahui berat molekulnya oleh makmal bebas dan pengeluarnya. Dengan kaedah ini, polimer dialirkan menggunakan pam tekanan malar ke dalam sistem yang mempunyai detektor ultra ungu (UV) dan tolok kelikatan (viscometer). Isyarat tindak balas seluruh siri polimer dengan berat molekul tertentu terhadap kedua-dua detektor dicatatkan oleh alat perakam (recorder). Dari data ini, keluk kalibrasi (Rajah 4) (log berat molekul lawan masa aliran) akan dilukis oleh sistem. Setelah selesai proses pembinaan keluk kalibrasi.
Rajah 4: Contoh keluk kalibrasi
Satu sampel yang tidak diketahui berat molekulnya dialirkan kedalam sistem yang sama dan isyarat tindakbalasnya dengan UV dan IR dibandingkan dengan keluk kalibrasi tersebut untuk mendapatkan bacaan berat molekulnya.
Walaupun kaedah pertama ini kelihatan seperti mudah dan berkesan, terdapat beberapa masalah yang sering timbul. Masalah utama ialah bukan semua polimer mempunyai piawai yang boleh didapati di pasaran. Terdapat juga di mana berat molekul satu polimer lain diukur menggunakan keluk kalibrasi dari polimer yang lain. Perkara ini biasanya menimbulkan ralat yang serius kerana faktor-faktor seperti di bawah:
Perbezaan struktur kimia di antara polimer yang hendak diukur dengan polimer piawai. Perbezaan ini boleh menyebabkan berlakunya perbezaan jejari hidrodinamik kerana kehadiran kumpulan-kumpulan berfungsi kepada salah satu polimer tersebut. Kehadiran kumpulan-kumpulan berfungsi pula menyumbang
kepada penghindaran sterik. Kesemua perbezaan ini akhirnya membawa kepada ralat serius di antara bacaan profil UV dan IR polimer yang diukur terhadap polimer piawai.
Kelemahan kaedah pertama seperti yang dibincangkan di atas dapat diatasi dengan menggunakan kaedah kedua, iaitu penggunaan GPC dengan detektor UV, detektor serakan cahaya (>5 sudut pengesanan), detektor indeks biasan dan detektor kelikatan. Kaedah ini merupakan kaedah pengukuran terus atau kaedah mutlak, iaitu ia tidak melibatkan penggunaan polimer piawai. Dengan ini masalah ketiadaan piawai akan dapat diatasi, sekali gus mengelakkan penggunaan keluk kalibrasi yang tidak sesuai [5].
Eksperimen
Bahan
Chitosan komersil dari Nibong Tebal diperoleh dari Hunza Pharmaceutical Sdn Bhd.. Bahan ini telah diampai dan diaduk di dalam air selama 1 jam. Ia kemudiannya diempar pada 5000rpm selama 20minit. Bahagian jernih telah disingkir dan mendapan di ambil. Mendapan ini kemudiannya dilarutkan dalam asid asetik pada pH 5 dan diaduk selama 20minit. Larutan ini diempar sekali lagi pada 5000rpm selama 20 minit. Bahagian jernih dikumpulkan manakala mendapan disingkir. Bahagian jernih ini kemudiannya dititis dengan natrium hidroksida sehingga pH 10. Sekali lagi ia diempar pada 5000rpm selama 20minit. Mendapan pada dasar botol empar telah diambil dan dibilas dengan air nyah ion sebanyak 3 kali dan kemudian disejukbeku selama 24jam dan akhirnya dikeringkan menggunakan pengering beku.
Pengukuran perubahan indeks biasan (dn/dc)
Bahan chitosan yang telah ditulenkan seperti diatas telah dilarutkan didalam 0.2M asetik asid/0.1M natrium asetat kepada satu siri kepekatan dari 0.1g/l hingga 2g/l. Semua larutan ini telah ditapis dengan penapis 0.22µm melalui penyuntik 20ml. Alat BI-DNDC (rajah 5) telah dihidupkan selama 1jam sebelum pengukuran. Semua sampel telah disuntik kedalam salur sampel dari kepekatan rendah ke tinggi. Satu graf ∆n lawan kepekatan telah diplotkan dan kecerunan graf adalah nilai dn/dc.
Rajah 5: Alat BI-DNDC dari Brookhaven Inc.
Pengukuran berat molekul
Alat GPC-MALLS yang dilengkapi dengan pam, penyuntik, 2 kolum pemisahan (Shimadzu OHPak 805, 806), pengesan UV, pengesan serakan laser, pengesan kepekatan dan pengesan perubahan indeks biasan (rajah 6) telah dihidupkan selama 1 jam sebelum pengukuran. 0.1ml sampel chitosan berkepekatan 2g/l (di dalam 0.2M asetik asid/0.1M natrium asetat) dimasukkan kedalam botol sampel. Pengukuran dibuat dengan menyuntik 50µl sampel kedalam sistem dengan kadar aliran 1ml/min selama 50minit pada suhu 27oC.
Perbincangan
Pengukuran perubahan indeks biasan memberi bacaan 0.206mL/g (Rajah 7).
Rajah 7: Bacaan perubahan indeks biasan dari alat BI-DNDC
Bacaan yang ditunjukkan oleh pengesan serakan laser dan pengesan kelikatan adalah seperti (Rajah 8).
Kesemua sampel chitosan telah keluar dari sistem dalam masa 50minit. Terdapat sedikit selisih antara bacaan-bacaan dari kedua-dua pengesan. Selisih ini disebabkan oleh julat berat molekul chitosan yang luas. Validasi data dibuat dengan merujuk kepada plot debye (Rajah 9). Sekiranya semua titik berada di atas garisan lurus plot debye, maka ini menunjukkan sampel telah disediakan dengan baik dan bacaan berat molekul mutlak yang diperolehi boleh diterimapakai [5].
Rajah 9: Plot debye yang digunakan untuk validasi bacaan berat molekul Integrasi kesemua isyarat dari serakan laser, kelikatan, perubahan indeks biasan dan UV memberikan data-data seperti dalam (Rajah 10).
Rajah 10: Bacaan-bacaan yang diperolehi dari pengukuran berat molekul chitosan
Kesimpulan
Dari data-data yang diperolehi seperti di (Rajah 10), polydispersity menerangkan taburan berat molekul yang diukur (1.223). Dalam kes ini, didapati chitosan yang diukur tergolong dalam kategori eka taburan atau polimer yang mempunyai julat taburan berat molekul sekitar 20%. Berat molekul purata nombor (Mn) adalah 6.566x104g/mol. Nilai ini mewakili purata berat semua rantai chitosan atau jumlah berat polimer dibahagi dengan bilangan rantai chitosan. Berat molekul purata berpemberat (Mw) adalah 8.030 x104g/mol. Nilai ini mewakili purata berat molekul dari panjang rantai chitosan yang berbeza-beza dibahagi dengan jumlah berat semua rantai chitosan. Nilai a (0.946) yang menghampiri 1, menunjukkan bahawa rantai chitosan didalam pelarut yang digunakan adalah dalam bentuk lingkaran longgar. Teknik GPC-MALLS adalah satu teknik yang canggih dan komprehensif dalam pengukuran berat molekul mutlak. Ia tidak memerlukan sebarang polimer piawai dan dalam satu pengukuran, banyak maklumat yang dapat diperolehi.
Penghargaan
Kami amat menghargai pemberian dana oleh Kerajaan Malaysia melalui RMK-9 untuk pembelian alat GPC-MALLS dan pembinaan makmal nanoteknologi.
Rujukan
[1] Muzzarelli, R.A.A., (1973), Natural Chelating Polymers, Pergamon Press, New York., 83 pp.
[2] Zikakis, J.P., (1984), Chitin, Chitosan and Related Enzymes, Academic Press, Orlando. XVII pp.
[3] Ravi Kumar, M.N.V., (2000), A review of chitin and chitosan applications, React. Funct. Polym. 46: 1–27
[4] Balke, S.T., (1991), Characterization of complex polymers by size exclusion chromatography and high performance liquid chromatography. In: Modern Methods Of Polymer Characterization. G.B. Howard and W.M. Jimmy (eds.). John Wiley & Sons, New York. 3 pp.
[5] Gregorio, R.M., (1991), Data reduction in size exclusion chromatography of polymers. In: Modern Methods Of Polymer Characterization. G.B. Howard and W.M. Jimmy (eds.). John Wiley & Sons, New York. 67 pp.
