i LAPORAN AKHIR PKM-P
DIABETIC WOUND HEALING : EKSTRAK CACING TANAH (Pheretima aspergillum) SEBAGAI AKSELERATOR PENYEMBUHAN ULKUS DIABETIK PADA TIKUS MODEL DIABETES MELITUS MELALUI
INDUKSI DENSITAS AKSON SECARA IN VIVO
Oleh :
Fetreo Negeo P. 105070200111004 Angkatan 2010 Ni Putu Jeny M. 105070201111013 Angkatan 2010 Arinda Nur Y. 105070200111010 Angkatan 2010 Dwi Astika Sari 105070201111021 Angkatan 2010 I Wayan Gede S. 115070200111021 Angkatan 2011
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
ii LEMBAR PENGESAHAN
1. Judul Kegiatan : Diabetic Wound Healing : Ekstrak Cacing Tanah (Pheretima aspergillum) Sebagai Akselerator Penyembuhan Ulkus Diabetik Pada Tikus Model Diabetes Melitus Melalui Induksi Densitas Akson Secara In Vivo
2. Bidang Kegiatan : (√) PKM-P ( ) PKM-M ( ) PKM-KC ( ) PKM-K ( ) PKM-T
3. Ketua Pelaksana Kegiatan
a. Nama Lengkap : Fetreo Negeo Putra
b. NIM : 105070200111004
c. Jurusan : Ilmu Keperawatan
d. Universitas : Universitas Brawijaya
e. Alamat Rumah dan No Telp/HP: RT 20/ RW 03 Ds Buluagung Kec. Karangan Kab. Trenggalek
085755172513
f. Alamat email : fetreonegeo@gmail.com 4. Anggota Pelaksana Kegiatan : 4 orang
5. Dosen Pendamping
a. Nama Lengkap dan Gelar : Ns.Heri Kristianto,S.Kep.,M.Kep.Sp.KMB
b. NIDN : 0026118201
c. Alamat Rumah dan No Telp/Hp: Pondok Alam Sigura-gura Blok A2/20 Karang Besuki Malang
085234068944 6. Biaya Kegiatan Total
a. Dikti : Rp. 11.200.000,00
b. Sumber lain : -
7. Jangka Waktu Pelaksanaan : 4 bulan
Menyetujui
Pembantu Dekan I FKUB
dr. Sri Andarini, M.Kes NIP. 195804141987012001
Pembantu Rektor III Bidang Kemahasiswaan
Ir. H. RB. Ainurrasjid, MS NIP. 195506181981031002
Malang, 20 Agustus 2013 Ketua Pelaksana Kegiatan
Fetreo Negeo Putra NIM. 105070200111004
Dosen Pendamping
Ns. Heri Kristianto, S.Kep., M.Kep.Sp.KMB NIDN. 0026118201
iii DIABETIC WOUND HEALING : EKSTRAK CACING TANAH
(PHERETIMA ASPERGILLUM) SEBAGAI AKSELERATOR
PENYEMBUHAN ULKUS DIABETIK PADA TIKUS MODEL DIABETES MELITUS MELALUI INDUKSI DENSITAS AKSON SECARA IN VIVO
Fetreo Negeo Putra1, Ni Putu Jeny Mardiati1, Arinda Nur Yunitasari1, Dwi AstikaSari1, I Wayan Gede Saraswasta1, Heri Kristianto2 1. Ilmu Keperawatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya 2. Departemen Keperawatan Medikal Bedah FK UB-RSUD dr Saiful Anwar Abstrak
Latar Belakang: Neuropati merupakan komplikasi serius penyebab ulkus diabetik pada penderita diabetes melitus (DM). Kondisi ini menyebabkan kerusakan pada saraf perifer akibat degenerasi akson. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) mampu meregenerasi saraf perifer. Kemampuan regenerasi ini melibatkan proliferasi dan diferensiasi sel schwan dalam mendukung regenerasi akson saraf perifer.
Tujuan: Penelitian ini ditujukan untuk membuktikan pengaruh pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) terhadap akselerasi penyembuhan ulkus diabetik melalui induksi densitas akson saraf perifer pada tikus Rattus norvegicus jantan galur wistar yang diiduksi Diabetes Melitus (DM).
Metode: Penelitian ini menggunakan desain true experimental in vivo dengan metode Randomized Posttest Only Controlled Group Design. Dalam penelitian ini terdapat 5 kelompok : kontrol (-) yang diinduksi DM dan diberi perawatan ulkus diabetik dengan normal saline (NaCl 0,9%), kontrol (+) yang diinduksi DM dan diberi perawatan ulkus diabetik dengan hidrogel (sodiumcarboxymethylcellulose), kelompok perlakuan yang diinduksi DM dan diberi perawatan ulkus diabetik secara topikal, oral, dan topikal-oral. Pengambilan jaringan kulit dilakukan pada hari ke-21 dan dilakukan pengukuran kontraksi luka dan penghitungan densitas akson.
Hasil: Uji ANOVA menunjukkan bahwa pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) mampu meningkatkan persentase kontraksi luka dan jumlah densitas akson saraf perifer secara bermakna dengan nilai p=0,013 (p<0,05) dan p=0,000 (p<0,05). Uji Post Hoc dilakukan untuk melihat kelompok mana yang berbeda secara bermakna.
Kesimpulan: Pemberian ekstrak tanah (Pheretima aspergillum) dapat meningkatkan persentase kontraksi luka dan jumlah densitas akson saraf perifer pada tikus putih (Rattus novergicus) galur Wistar yang diinduksi Diabetes Melitus. Kata Kunci: Diabetes Melitus, Ulkus Diabetik, Cacing Tanah (Pheretima aspergillum), Regenerasi Saraf Perifer.
iv KATA PENGANTAR
Puji syukur bagi Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberi petunjuk dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini dengan judul Diabetic Wound Healing : Ekstrak Cacing Tanah (Pheretima aspergillum) Sebagai Akselerator Penyembuhan Ulkus Diabetik Pada Tikus Model Diabetes Melitus Melalui Induksi Densitas Akson Secara In Vivo.
Topik penelitian ini diangkat setelah melihat kenyataan tingginya kasus komplikasi kronik yang terjadi pada pasien dengan Diabetes Melitus (DM). Salah satu komplikasi kronik tersebut adalah terjadinya proses neuropati atau kerusakan pada jaringan saraf perifer dengan diikuti timbulnya ulkus diabetik. Kondisi ini pada akhirnya dapat menimbulkan kematian jaringan dan berujung pada tindakan amputasi yang sangat berpengaruh pada quality of life pasien. Dalam penelitian ini kami membuat desain akselerator penyembuhan ulkus diabetik melalui induksi densitas akson yang kami istilahkan dengan nama “Diabetic Wound Healing”.
Penulis menyadari bahwa baik dalam perjalanan penelitian maupun penyelesaian penelitian ini banyak memperoleh bimbingan dan motivasi dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa syukur dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Dr. dr. Karyono Mintaroem, Sp.PA selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
2. Dr. dr. Kusworini, M. Kes, Sp. PK selaku Ketua Jurusan Ilmu Keperawatan Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
3. Ns.Heri Kristianto,S.Kep.,M.Kep.Sp.KMB sebagai pembimbing yang selalu memberi masukan, saran serta bimbingan yang sangat berharga selama proses penelitian ini.
4. Dr. dr. I Ketut Gede Muliartha, Sp. PA dan dr. Indriati Dwi Rahayu yang telah memberikan masukan dan saran untuk terselesaikannya penelitian ini.
5. Pak Satuman, Mas Didin, dan Mas Mijan selaku analis Laboratorium Faal dan Patologi Anatomi FKUB yang telah membantu kami dalam melakukan penelitian.
6. Semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian penelitian ini Akhir kata, penulis berharap semoga penelitian ini dapat menambah khasanah ilmu pengetahuan dan bermanfaat bagi semua pihak. Penulis menyadari dalam penyelesaian penelitian ini masih jauh dari sempurna. Oleh karena itu, saran dan kritik yang sifatnya membangun sangat diharapkan oleh penulis demi tersempurnanya penelitian selanjutnya.
Malang, Agustus 2013
1
I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Masalah
Diabetes melitus (DM) telah menempatkan Indonesia di urutan ke-4 dunia setelah negara India, China dan Amerika dengan jumlah Diabetesi sebesar 8,4 juta orang dan diperkirakan akan terus meningkat sampai 21,3 juta orang di tahun 2030 (King et al., 2003). Komplikasi menahun DM terdiri atas neuropati 60%, penyakit jantung koroner 20,5%, ulkus diabetik 15%, retinopati 10%, dan nefropati 7,1% (Waspadji, 2006). Neuropati baik neuropati sensorik maupun motorik dan autonomik akan mengakibatkan berbagai perubahan pada kulit dan otot. Hal ini kemudian menyebabkan terjadinya perubahan distribusi tekanan pada telapak kaki dan selanjutnya akan mempermudah terjadinya ulkus diabetik (Hastuti, 2008).
Penyembuhan ulkus diabetik berbeda dengan penyembuhan luka akut normal. Pada ulkus diabetik terjadi penurunan dan gangguan produksi NGF (Brem & Canic, 2007). Faktor neurotropik NGF memberikan respon mayor dalam meregulasi proliferasi, diferensiasi, dan remielin sel schwan (Chen et al., 2007). Sel schwan berdiferensiasi menjadi selubung mielin dan berproliferasi hingga bagian distal dari area saraf yang mengalami injuri untuk mendukung pemanjangan akson (Chang et al., 2011a). Penderita DM apabila kadar glukosa darah tidak terkendali akan menimbulkan kerusakan jaringan saraf akibat adanya penimbunan sorbitol dan fruktosa sehingga mengakibatkan akson menghilang (Waspadji, 2006).
Terapi perawatan ulkus diabetik yang ideal seharusnya dapat menghambat terjadinya neuropati dengan mempercepat proses regenerasi akson pada saraf perifer melalui peningkatan NGF. Akan tetapi, sampai saat ini belum ditemukan perawatan ulkus diabetik dengan kriteria demikian. Ulkus diabetik bila tidak ditangani dengan tepat akan menimbulkan kecacatan bahkan berujung pada amputasi. Hal ini sangat berpengaruh pada penurunan quality of life (Bradbury & Price, 2011).
Pheretima aspergillum atau lebih populer dengan sebutan cacing tanah, merupakan spesies yang memiliki komposisi senyawa kimia tinggi yaitu protein (43,31%) yang memiliki fungsi mempercepat regenerasi saraf perifer (Sofyan, 2007). Studi in vitro pada ekstrak Pheretima aspergillum memiliki efek terhadap regenerasi akson saraf perifer. Ekstrak Pheretima aspergillum menyebabkan peningkatan signifikan terhadap NGF pada sel PC12 yang berhubungan dengan protein 43 dan sinapsin I (Chen et al., 2010). Ekstrak Pheretima aspergillum dapat menstimulasi migrasi sel schwan melalui jalur mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Chang et al., 2011a).
Dari pemaparan data empiris di atas muncul hipotesis bahwa ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) dapat mempercepat proses penyembuhan ulkus diabetik melalui induksi densitas akson pada saraf perifer. Untuk membuktikannya diperlukan penelitian dalam mengungkap efek ekstrak cacing tanah terhadap regenerasi akson saraf perifer pada ulkus diabetik melalui pendekatan biomolekuler secara in vivo.
1.2 Perumusan Masalah
Apakah ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) dapat menginduksi densitas akson ulkus diabetik secara in vivo pada tikus Rattus norvegicus galur wistar?
2
1.3 Tujuan Program Tujuan Umum
Membuktikan pengaruh ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) terhadap penyembuhan ulkus diabetik pada tikus model diabetes melitus.
Tujuan Khusus
1. Mengukur kontraksi luka pada ulkus diabetik setelah pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum)
2. Menghitung densitas akson pada ulkus diabetik setelah pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum)
1.4 Luaran Yang Diharapkan
Luaran yang diharapkan berupa artikel ilmiah dan paten terkait dengan penerapan cacing tanah (Pheretima aspergillum) dalam penyembuhan ulkus diabetik pada penderita diabetes melitus.
1.5 Kegunaan Program
1. Kegunaan Praktis, dapat diketahuinya efek dari kandungan cacing tanah dalam meningkatkan densitas akson pada ulkus diabetik serta sebagai referensi dalam mengembangkan penelitian selanjutnya mengenai biota Indonesia di bidang farmakoonkologi melalui pendekatan biomolekuler. 2. Kegunaan Akademis, dapat dijadikan sebagai dasar teori untuk menambah
wawasan ilmu pengetahuan sekaligus sebagai dasar untuk pengembangan penelitian selanjutnya dalam bidang kesehatan, khususnya tentang terapi farmakologi pada ulkus diabetik untuk menghambat proses neuropati.
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Diabetes Melitus
Definisi Diabetes Melitus
Diabetes melitus (DM) merupakan suatu penyakit yang melibatkan hormon endokrin pankreas, antara lain insulin dan glukagon. Manifestasi utamanya mencakup gangguan metabolisme lipid, karbohidrat, dan protein yang pada gilirannya merangsang kondisi hiperglikemia (Nugroho, 2006).
Patogenesis Ulkus Diabetik
Ulkus diabetik adalah salah satu bentuk komplikasi kronik DM berupa luka terbuka pada permukaan kulit yang dapat disertai adanya kematian jaringan setempat (Frykberb, 2002). Ulkus diabetik disebabkan adanya tiga faktor yang sering disebut trias yaitu iskemik (vaskular insufisiensi), neuropati, dan infeksi (Sapico, 2007). Pada penderita DM apabila kadar glukosa darah tidak terkendali akan terjadi komplikasi kronik yaitu neuropati yang menimbulkan perubahan jaringan saraf karena adanya penimbunan sorbitol dan fruktosa sehingga mengakibatkan akson menghilang, penurunan kecepatan induksi, menurunnya reflek otot, atrofi otot, keringat berlebihan, kulit kering dan hilang rasa, apabila Diabetisi tidak hati-hati dapat terjadi trauma yang menyebabkan ulkus diabetik (Waspadji, 2006).
Perawatan Ulkus Diabetik
Perawatan luka modern menekankan metode moist wound healing atau menjaga agar luka dalam keadaan lembab. Luka akan menjadi cepat sembuh apabila eksudat dapat dikontrol, menjaga agar luka dalam keadaan lembab, luka tidak lengket dengan bahan kompres, terhindar dari infeksi dan permeabel
3
terhadap gas. Tindakan dressing merupakan salah satu komponen penting dalam mempercepat penyembuhan lesi. Ada beberapa jenis dressing yang sering dipakai dalam perawatan ulkus diabetik, seperti: hydrogel, hydrocolloid, calcium alginate, foam, dan sebagainya (Hastuti, 2008).
2.2 Cacing Tanah (Pheretima aspergillum) Taksonomi
Cacing tanah (Pheretima aspergillum) atau yang sering disebut dengan earthworm memiliki taksonomi sebagai berikut: (Santoso, 2002)
Kingdom : Animalia Sub-kingdom : Metazoa Filum : Annelida Kelas : Oligochaeta Famili : Megascolecidae Genus : Pheretima
Species : Pheretima aspergilum Gambar 1. Pheretima aspergillum Morfologi
Ukuran tubuh Pheretima aspergillum dapat mencapai 30cm dengan diameter mencapai 10mm. Cacing tanah jenis ini segmennya mencapai 95 - 150 segmen. Klitelumnya terletak pada segmen 14-16. Tubuhnya berbentuk gilik panjang dan silindris berwarna kemerahan. Cacing ini hidup didalam liang tanah yang lembab, subur dan suhunya tidak terlalu dingin. Untuk pertumbuhannya yang baik, cacing ini memerlukan tanah yang sedikit asam sampai netral atau pH 6 - 7,2 (Santoso, 2002).
Kandungan Protein
Kandungan protein pada Pheretima sebesar 43,31%. Protein pada cacing tanah selain berupa protein struktural juga berupa enzim dan metalloprotein. Protein tersebut tersusun dari semua asam amino esensial (Sofyan, 2007).
2.3 Densitas Akson
Sistem saraf terbagi menjadi sistem saraf pusat dan sistem saraf perifer, dimana terdapat perbedaan struktur anatomi dan kemampuan regenerasi. Regenerasi akson merupakan hasil dari aktivitas sel schwan yang menyediakan aktivitas penting bagi regenerasi saraf perifer (Chang et al.,2011a). Terdapat tiga respon mayor yang meregulasi proliferasi, diferensiasi, dan remielin sel schwan yaitu faktor neurotropik, protein extracellular matrix (ECM), dan hormon. Salah satu faktor neurotropik tersebut adalah nerve growth factor (NGF) (Chen et al., 2007). NGF adalah molekul alami dalam tubuh yang merangsang pertumbuhan dan diferensiasi simpatik dan saraf sensorik (Muangman et al., 2009).
Neurotropic signaling NGF diperantarai oleh dua tipe reseptor yaitu tropomyosine kinase receptors (Trk) khususnya TrkA yang selektif mengikat NGF dan p75NTR. Setelah berikatan dengan reseptornya, NGF akan mengaktivasi phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K) dan selanjutnya mendukung pertumbuhan akson (Chen et al., 2007). Ekstrak Pheretima aspergillum dapat menginduksi insulin-like growth factor-1 (IGF-1) dan P13K. IGF-1 merupakan hormon polipeptide yang disintesa oleh proliferasi sel schwan sebagai respon terhadap growth hormone untuk menstimulasi pertumbuhan saraf perifer. IGF-1 melindungi neuron pada saraf perifer dari apoptosis dengan mengaktivasi jalur P13K (Chang et al., 2011b).
4
III. METODE PENDEKATAN 3.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan desain true experimental in vivo dengan metode Randomized Post-test Only Controlled Group Design.
3.2 Variabel Penelitian
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah perawatan ulkus diabetik yang dibagi dalam beberapa kelompok. Kelompok 1: Kontrol Negatif (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan normal saline/ NaCl 0,9%). Kelompok 2: Kontrol Positif (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan hidrogel). Kelompok Perlakuan 1 (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan ekstrak cacing tanah secara oral pada konsentrasi 100 mg/ml). Kelompok Perlakuan 2 (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan ekstrak cacing tanah secara topikal pada dosis 100 mg/kgBB). Kelompok Perlakuan 3 (tikus DM yang diberi perawatan ulkus dengan ekstrak cacing tanah secara oral dan topikal pada konsentrasi 100mg/m dan dosis 100mg/kgBB).
Variabel terikat dalam penelitian ini adalah: (a) persentase kontraksi luka dan (b) densitas (kepadatan) akson saraf perifer
3.2 Subyek dan Sample
Sampel penelitian adalah tikus putih (Rattus norvegicus) strain Wistar jantan, berusia 10-12 minggu, berat badan 150-200 gram. Perhitungan besarnya pengulangan pada sampel adalah sebagai berikut (Hidayat, 2009):
(np-1) – (p-1) ≥ 16 (p: jumlah perlakuan, n: jumlah ulangan), p=5 sehingga (5n-1) – (5-1) ≥ 16
n ≥ 4,2 Dibulatkan ke atas menjadi 5 pengulangan 3.3 Metode Penelitian
Ekstraksi Pheretima aspergillum
Cacing tanah 500 gram dikeringkan dengan suhu 50o C kemudian dihancurkan dengan cara ditumbuk atau dihaluskan dengan blender dan disaring untuk memisahkan partikel yang relative besar dan tepung bahan. Tepung bahan yang diperoleh selanjutnya diekstrak dengan metode maserasi (Chang et al., 2011a). Timbang tepung bahan yang akan diekstrak. Masukkan kedalam baker glas dan tuangkan pelarut dengan perbandingan (1:3) 1 kg bahan dalam 3 liter pelarut etanol 70%. Rendam bahan dan diamkan pada suhu kamar selama minimal 2x24 jam kemudian saring bahan menggunakan kertas saring whatman no 40. Evaporasi untuk menghilangkan sisa pelarut. Oven sisa pelarut yang masih tersisa pada suhu 40oC hingga benar-benar tidak mengandung pelarut. Hasil ekstraksi berbentuk pasta sebanyak 36 gram.
Induksi Diabetes Melitus
Tikus diinduksi DM dengan injeksi Streptozotocin (STZ) intraperitonial single dose 40mg/kgBB dalam pelarut buffer sitrat 0,1 M pH 4.5 setelah sebelumnya dipuasakan selama 12 jam. Tiga hari setelah injeksi STZ, glukosa darah diukur melalui vena ekor dengan menggunakan glukometer (Multi-check, NESCO, Taiwan) dan tikus dengan glukosa darah diatas 200 mg/dL dinyatakan sebagai diabetik (Zangiabadi et al., 2011). Tikus di tunggu selama 4 minggu setelah induksi DM untuk proses neuropati (Kappelle et al., 1993)
Pembuatan Ulkus Diabetik
Tikus dianastesi ketamine intraperitoneal dengan dosis 25 mg/kgBB, kemudian difiksasi dalam posisi pronasi. Bulu daerah punggung dicukur, lalu
5
dilakukan desinfeksi dengan alkohol 70%. Pembuatan ulkus diabetik melalui luka eksisi berukuran 1,5x1,5 cm pada kulit dengan menggunakan pisau bedah pada epidermis hingga hipodermis/lapisan subkutan (ulkus derajat 2) (Li et al., 2011). Perawatan Ulkus Diabetik
Perawatan ulkus diabetik dilakukan 1 kali sehari selama 21 hari (Juranek et al., 2013). Teknik perawatan secara topikal menggunakan teknik steril dengan perawatan luka tertutup kasa untuk mencegah terjadinya infeksi. Teknik perawatan secara oral menggunakan sonde. Pemberian ekstrak topikal menggunakan konsentrasi 100 mg/ml sedangkan pemberian ekstrak oral menggunakan dosis 100 mg/kgBB (Chang et al., 2011a; Liu et al., 2013).
Pembuatan Preparat Jaringan Kulit
Tikus dieutanasia dengan inhalasi ether pada hari ke-21. Kulit pada daerah ulkus dan sekitarnya dieksisi menggunakan pisau bedah mencapai batas lapisan otot. Jaringan direndam dalam larutan fiksatif formalin 10% selama 24 jam, selanjutnya dilakukan pembuatan preparat jaringan kulit. Pengeringan dilakukan untuk menghilangkan air dari potongan jaringan dengan cara merendam berturut-turut secara bertahap dalam larutan etanol (70% sampai 100%). Larutan kemudian diganti dengan larutan xylene. Setelah jaringan dipenuhi dengan larutan, jaringan dimasukkan dalam parafin cair di dalam oven pada suhu 58-600 C. Blok keras yang berisi jaringan kemudian diiris longitudinal dengan pisau baja atau pisau kaca mikrotom setebal 10 µm (Junqueira & Carneiro, 2004).
Pengukuran Kontraksi Luka
Ulkus diabetik didokumentasikan menggunakan digital camera 16 Mpixel. Luas luka yang tidak sembuh setelah perawatan luka selama 21 hari diukur menggunakan program AutoCAD 2009. Kontraksi luka dihitung dengan menggunakan rumus: persentase kontraksi luka = [(luas luka awal – luas luka yang tidak sembuh) / luas luka awal] x 100% (Li et al., 2011).
Penghitungan Densitas Akson
Preparat jaringan kulit dipulas dengan menggunakan impregnasi perak (silver impregnation) (Switzer, 2000 ; Grant, Hollander, & Aldskogius, 2004). Jaringan terlebih dahulu dibasahi dengan aquades, kemudian homogenasi 5 tetes reagen potassium permanganate dengan 5 tetes reagen acid activation buffer dan teteskan selama 5 menit kemudian bilas dengan aquades. Untuk seterusnya teteskan reagen sesuai urutan kemudian bilas dengan aquades. Reagen tersebut adalah oxalic acid selama 3 menit, iron ammonium sulphate selama 2 menit, ammoniacal buffer selama 2 menit, formic aldehyde buffer selama 2 menit, sodium thiosulphate selama 4 menit, kemudian bilas dengan air mengalir selama 5 menit. Dehidrasi dengan segera, bersihkan dengan xylol, dan rekatkan (mounting) dengan balsam serta tutup dengan coverslip. Hasil pemulasan impregnasi perak adalah berwarna hitam untuk serabut saraf (nervous fibers) (Diapath, 2013). Migrasi serabut saraf diamati disekitar folikel rambut (Gagnon et al., 2011). Slide kulit hasil pemeriksaan Silver diamati menggunakan program Scan Dot Slide OlyVIA. Kemudian jumlah akson dihitung dengan pembesaran 20x obyektif pada tiap slide dari masing-masing tikus sebanyak 10 lapang pandang kemudian dirata-rata. Prosedur Pengumpulan dan Analisa Data
Hasil pengukuran tikus kontrol dan perlakuan dianalisa secara statistik dengan menggunakan program SPSS 18.0 for Windows XP dengan tingkat kebermaknaan 0,05 (p=0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α = 0,05). Langkah-langkah uji
6
hipotesis adalah uji normalitas data, uji homogenitas varian, uji One-way ANOVA dan Post hoc test (Dahlan, 2004).
IV. PELAKSANAAN PROGRAM 4.1 Waktu dan Tempat Pelaksanaan
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fisiologi dan Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya, Laboratorium Ekologi Fakultas MIPA Universitas Brawijaya, serta Laboratorium Teknik Kimia Politeknik Malang, dengan lama penelitian selama 4 bulan.
4.2 Tahapan Pelaksanaan/Jadwal Faktual Pelaksanaan
Kegiatan Waktu
Bulan 1 Bulan 2 Bulan 3 Bulan 4 Mengurus ethical clearance Mengurus perijinan laboratorium Belanja alat dan bahan penelitian Perawatan dan adaptasi tikus Proses ekstraksi cacing tanah Induksi Diabetes Melitus Pembuatan ulkus diabetik Perawatan ulkus diabetik Histo PA jaringan kulit
Pengukuran variabel
Analisa data
Penyusunan laporan akhir 4.3 Instrumen Pelaksanaan
Ekstraksi Pheretima aspergillum
Alat: baker glas, timbangan analitik, kertas saring whatman no.40, oven, blender. Bahan: cacing tanah (Pheretima aspergillum), etanol 70%.
Induksi Diabetes Melitus
Alat: spuit 1 cc, handscoon, blood lancet, glukometer, timbangan berat badan. Bahan: Streptozotocin (STZ), pelarut buffer sitrat 0,1 M pH 4.5.
Pembuatan Ulkus Diabetik
Alat: meja operasi kecil, set bedah minor, alat cukur, duk steril, penggaris, timbangan berat badan. Bahan: anastesi ketamine, alkohol 70%.
Perawatan Ulkus Diabetik
Alat: spuit 3 cc, set rawat luka steril (handscoon, kasa, kom, pinset anatomis dan sirugis, lidi kapas, gunting anatomis), masker, bengkok, underpad, sonde. Bahan: normal salin (NaCl 0,9%), hidrogel, ekstrak Pheretima aspergillum
Pembuatan Preparat Jaringan
Alat: meja operasi kecil, peralatan bedah minor, botol kecil tertutup, mikrotom, obyek glas. Bahan: anastesi ether, jaringan kulit, formalin 10%, alkohol 70%, 90%, 100%, xylene, parafin cair.
Pengukuran Kontraksi Luka
Alat: digital camera 16 Mpixel, penggaris, program AutoCAD 2009. Penghitungan Densitas Akson
Alat: program Scan Dot Slide OlyVia, coverslip. Bahan: silver staining kit, xylol, balsam
7
4.4 Rekapitulasi Rancangan dan Realisasi Biaya
No Uraian Kegiatan Total Anggaran (Rp)
Total Realisasi (Rp)
1 Proses ekstraksi 300.000 440.000
2 Penyediaan sample dan perawatan 2.250.000 2.227.200
3 Induksi Diabetes Melitus 2.250.000 2.630.227
4 Perawatan ulkus diabetes 1.500.000 1.360.350
5 Pembuatan preparat 1.500.000 1.341.000
6 Pengukuran densitas akson 3.200.000 3.003.933
7 Lain – lain 200.000 195.000
Total (Pemasukan dan Pengeluaran) 11.200.000 11.197.710 V. HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1 Hasil Penelitian
Hasil Pengukuran Persentase Kontraksi Luka
Tabel 1. Persentase Kontraksi Luka Kelompok Mean + SD 1 Kontrol (-) 81,30 + 8,02 2 Kontrol (+) 90,80 + 4,09 3 Ekstrak Topikal 100 mg/ml 91,66 + 5,25 4 Ekstrak Oral 100 mg/kgBB 91,10 + 2,68 5 Ekstrak Topikal-Oral 100 mg/ml dan 100 mg/kgBB 93,52 + 4,71
Grafik 1. Menunjukkan rata-rata persentase kontraksi luka pada tikus dengan ulkus diabetik. Uji ANOVA didapatkan nilai p=0,013 (p<0,05) yang menunjukkan ada beda antar kelompok. Uji Post Hoc Bonferroni menunjukkan perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol (-) dengan kelompok perlakuan yang diberikan ekstrak topikal-oral (p=0,015).
Hasil Penghitungan Densitas Akson
Tabel 2. Jumlah Densitas Akson Kelompok Mean + SD 1 Kontrol (-) 0 + 0 2 Kontrol (+) 0,2 + 0,45 3 Ekstrak Topikal 100 mg/ml 15,6 + 4,78 4 Ekstrak Oral 100 mg/kgBB 4,8 + 1,92 5 Ekstrak Topikal-Oral 100 mg/ml dan 100 mg/kgBB 6,8 + 3,63
Grafik 2. Jumlah Densitas Akson Grafik 1. Persentase Kontraksi Luka
8
Pada pemulasan impregnasi perak (silver impregnation) dan pengamatan dengan program Scan Dot Slide OlyVIA pada perbesaran 20x obyektif dapat dihitung jumlah densitas (kepadatan) akson pada jaringan kulit (Gambar 2). Grafik 2. Menunjukkan rata-rata jumlah densitas akson. Uji ANOVA didapatkan nilai p=0,000 (p<0,05) yang menunjukkan ada beda antar kelompok. Uji Post Hoc Games-Howell menunjukkan perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol (kontrol negatif dan kontrol positif) dengan kelompok perlakuan yang diberikan ekstrak topikal dan ekstrak oral.
5.2 Pembahasan
Efektifitas Pemberian Ekstrak Cacing tanah (Pheretima aspergillum) dalam Mempercepat Penyembuhan Ulkus Diabetik
Pada penelitian ini, pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) dapat meningkatkan persentase kontraksi luka secara bermakna (p=0,013). Hasil penelitian ini membuktikan bahwa terjadi proses penyembuhan pada ulkus diabetik. Penyembuhan luka secara makroskopis ditandai dengan peningkatan kontraksi luka (Li et al., 2011). Pada penelitian ini perbedaan secara bermakna terjadi antara kelompok kontrol (-) dengan kelompok perlakuan topikal-oral. Hal ini menunjukkan pemberian ekstrak secara oral memiliki efek sistemik yang mendukung pemberian ekstrak secara topikal terhadap proses akselerasi penyembuhan ulkus diabetik.
Efektifitas Pemberian Ekstrak Cacing tanah (Pheretima aspergillum) dalam Menginduksi Densitas Akson Saraf Perifer
Pada penelitian ini, pemberian ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) dapat meningkatkan densitas akson saraf perifer secara bermakna (p=0,000). Hasil penelitian ini membuktikan bahwa terjadi proses proliferasi dan migrasi sel schwann pada daerah ulkus diabetik. Proliferasi dan migrasi sel schwan merupakan proses penting yang mendukung regenerasi akson saraf perifer. Ekstrak Pheretima aspergillum menstimulasi migrasi sel schwan melalui jalur mitogen-activated protein kinase (MAPK) (Chang et al., 2011a). Ekstrak Pheretima aspergillum mampu menginduksi insulin-like growth factor-1 (IGF-1) yang merupakan hormon polipeptide yang disintesa oleh proliferasi sel schwan sebagai respon terhadap growth hormone untuk menstimulasi pertumbuhan saraf perifer (Chang et al., 2011b).
Gambar 2. Densitas akson saraf perifer pada jaringan kulit dengan pemulasan perak. Kontrol negatif (1), Kontrol Positif (2), Perlakuan topikal 100 mg/ml (3), Perlakuan oral 100 mg/kgBB (4), Perlakuan topikal-oral 100 mg/ml dan 100 mg/kgBB (5). Scale bars=20µm
9
V. KESIMPULAN DAN SARAN 6.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adalah:
Pemberian ekstrak tanah (Pheretima aspergillum) dapat meningkatkan persentase kontraksi luka dan densitas akson saraf perifer pada tikus putih jantan (Rattus novergicus) galur Wistar yang diinduksi Diabetes Melitus. 6.2 Saran
Saran dari penelitian ini adalah:
1. Diperlukan penelitian lebih lanjut terkait keadaan densitas akson saraf perifer hingga fase remodelling untuk memperkuat hasil penelitian ini.
2. Perlu dilakukan eksplorasi dosis dan penelitian lebih lanjut terkait formulasi ekstrak cacing (Pheretima aspergillum) secara topikal, oral, dan topikal-oral untuk mengetahui terapeutic window terutama pada pemberian oral.
3. Penelitian pengembangan diperlukan terkait perawatan ekstrak cacing tanah (Pheretima aspergillum) pada jenis ulkus diabetik dengan komplikasi infeksi atau gangrene yaitu pada ulkus derajat 3 atau derajat 4.
VI. DAFTAR PUSTAKA
Bradbury, Sarah & Patricia Price. 2011. The Impact of Diabetic Foot Ulcer Pain on Patient Quality of Life. Wound UK Vol 7 No.4
Brem, Harold & Marjana Tomic-Canic. 2007. Cellular and Molecular Basis of Wound Healing in Diabetes. The American Society for Clinical Investigation Vol. 177 (5):1219-1222
Chang, Yung-Ming et al. 2011a. RSC96 Schwann Cell Proliferation and Survival Induced by Dilong through P13K/Akt Signaling Mediated by IGF-1. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Article ID 216148. Hindawi Publishing Corporation
Chang, Yung-Ming et al. 2011b. Schwann Cell Migration Induced by Earthworm Extract via Activation of PAs and MMP2/9 Mediated through ERK1/2 and p38. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Article ID 395458. Hindawi Publishing Corporation
Chen, Chao-Tsung et al. 2010. Earthworm Extracts Facilitate PC12 Cell Differentiation and Promote Axonal Sprouting in Peripheral Nerve Injury. Am. J. Chin. Med. 38, 547. DOI: 10.1142/S0192415X10008044
Chen, Zu-Lin,Wei-Ming Yu, & Sidney Strickland. 2007. Peripheral Regeneration. The Annual Review of Neuroscience 30:209-33. Rockefeller University
Dahlan, S. M. 2004. Seri Statistik: Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan; Uji Hipotesis dengan Menggunakan SPSS Program 12 Jam. Jakarta: Arkans
Diapath S.p.A. 2013. Diapath Special Stains Handbook. http://www.diapath.com/diapath-special-stains.aspx diakses pada tanggal 10 Mei 2013.
Frykberb Robert G. 2002. Risk Factor, Pathogenesis and Management of Diabetic Foot Ulcers. Lowa: Des Moines University
Gagnon, Vicky et al. 2011. Hair Follicles Guide Nerve Migration In Vitro and In Vivo in Tissue-Engineered Skin. Journal of Investigative Dermatology 131, 1375–1378; doi:10.1038/jid.2011.34
10
Grant G, Hollander H, & Aldskogius H. 2004. Suppressive Silver Methods : A Tool For Identifying Axotomy-Induced Neuron Degeneration. Brain Res Bull. Jan 15;62(4):261-9
Hastuti. 2008. Faktor-Faktor Risiko Ulkus Diabetika Pada Penderita Diabetes Melitus. Semarang :Universitas Diponegoro. http://eprints.undip.ac.id/18866/ diakses 7 Oktober 2012
Hidayat AAA. 2009. Metode Penelitian Keperawatan dan Teknik Analisis Data. Jakarta: Salemba Medika
Junqueira, Luiz Carlos & Jose Carneiro. 2004. Histologi Dasar: Teks dan Atlas. Jakarta: EGC
Juranek, Judyta K et al. 2013. RAGE Deficiency Improves Postinjury Sciatic Nerve Regeneration in Type 1 Diabetic Mice. American Diabetes Association, Vol 62 : 931-934
Kappelle et al. 1993. Amelioration by The Ca2+ Antagonist, Nimodipine of An Existing Neuropathy in The Streptozotocin-Induced, Diabetic Rats. J Pharmacol 108: 780-785
King, H., Aubert, R.E., & Herman, W.H. 2003. Diabetes Care. 21:1414
Li, Kun et al. 2011. Tannin Extract From Immature Fruits of Terminalia Chebula Fructuz Retz. Promote Cutaneous Wound Healing In Rats. BMC Complementary and Alternative Medicine. 11:86
Liu, Chung Hsiang et al. 2013. Effect of Oral Administration of Pheretima Aspergillum (Earthworm) In Rats With Cerebral Infarction Induced By Middle-Cerebral Artery Occlusion. African Journal of Traditional,
Complementary & Alternative Medi Vol. 10 Issue 1, p66
Muangman, P et al. 2009. Nerve growth factor accelerates wound healing in diabetic mice. Wound Repair and Regeneration,12:44–52
Nugrogo, Agung E. 2006. Hewan Percobaan Diabetes Melitus : Patologi Dan Mekanisme Aksi Diabetogenik. Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada
Prihatman, Kemal. 2000. Budidaya Cacing Tanah. Proyek Pengembangan Ekonomi Masyarakat Pedesaan, Bappenas. http://www.ristek.go.id diakses 27 Agustus 2012
Santoso, Marcus Adrian. 2002. Identifikasi Ekstrak Cacing Tanah Lumbricus rubellus dan Pheretima aspergillum yang Memiliki Efek Antipiretik pada Tikus Putih. FMIPA-IPB. Pdf
Sapico, F. L. 2007. Food Ulcer in Patients with Diabetes Mellitus. Journal of American Podiatric Medical Association Vol 79, Issue 482-485
Sofyan, Sashadi. 2007. Karakteristik Dan Pertumbuhan Cacing Tanah Lokal Pada Media Mengandung Limbah Tanaman Pisang Serta Jerami Padi. Universitas Brawijaya Malang
Switzer R.C. 2000. Application of Silver Degeneration Stains For Neurotoxicity Testing. Toxicol Pathol. Jan-Feb;28(1):70-83.
Waspadji S. 2006. Komplikasi Kronik Diabetes : Mekanisme Terjadinya, Diagnosis dan Strategi pengelolaan. Ilmu Penyakit Dalam, Jilid III, Edisi keempat, Jakarta: Penerbit FK UI
Zangiabadi, Nasser et al. 2011. Effects of Melatonin in Prevention of Neuropathy in STZ-Induced Diabetic Rats. American Journal of Pharmacology and Toxicology 6 (2): 59-67, ISSN 1557-4962
