Volume 2, Nomor 1 (2015) Jurnal Pharmascience Jurnal Pharmascience, Vol 2, No. 1, Februari 2015, hal: 50 – 57
ISSN : 2355 – 5386 Research Article
Validasi Metode dan Analisis Penetapan Kadar
Sibutramin HCl Pada Jamu Pelangsing dengan
KCKT Fase Terbalik
*Liling Triyasmono, Rahmi Safitri, Malikhatun Ni’mah Prodi Farmasi FMIPA Universitas Lambung Mangkurat
*Email: liling_imeru@yahoo.com
Abstrak
Sibutramin hidroklorida (sibutramin HCl) merupakan bahan kimia obat yang sering ditambahkan pada jamu pelangsing. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi dan memvalidasi metode penetapan kadar sibutramin HCl pada jamu pelangsing di Banjarmasin dengan menggunakan RP HPLC dengan detektor UV-Vis. Kondisi analisis menggunakan kolom Eurospher (5 µm, 250mm x 4,6 mm), fase gerak campuran dari kalium dihidrogen fosfat 50 mM dengan asetonitril (pH 5,5 dengan menambahkan asam ortofosfat 10%) (30:70 v/v), kecepatan alir 1 mL/menit pada panjang gelombang 225 nm. Waktu retensi dari sibutramin HCl adalah 4,69 menit. Hasil validasi metode dari linieritas, akurasi dan presisi telah sesuai dengan persyaratan validitas. Linieritas memperoleh koefisien korelasi (r)= 0,998 pada kisaran konsentrasi analisis 100 ppm sampai 300 ppm. Akurasi memperoleh nilai 99,02% hingga 103,73%, dan presisi 3,34% hingga 6,84%. Batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ) masing-masing 16 ppm dan 53 ppm. Hasil menunjukan bahwa metode validasi ini akurat dan baik diaplikasikan untuk penetapan kadar sibutramin HCl pada jamu pelangsing. Metode penetapan kadar menunjukkan bahwa jamu pelangsing merek A dan merek B mengandung sibutramin HCl dengan kadar masing-masing 15,39 mg/kapsul dan 12,83 mg/kapsul.
Kata Kunci: KCKT, Fase Terbalik, validasi metode, sibutramin HCl
Abstract
Sibutramine hydrochloride (sibutramine HCl) is usually found in slimming traditional medicine as adulterant. The aims of this study were identification and validation method of quantitative determination of sibutramine HCl in slimming traditional medicine in Banjarmasin by reverse phase HPLC (High performance liquid chromatography) with UV-Vis detector. Condition analysis were used a Eurospher column (5 µm, 250 mm x 4,6 mm), mobile phase mixed buffer potassium dihydrogen phosphate 50 mM with acetonitrile (pH 5,5 adjusted with 10% Orthophosphoric acid) (30:70v/v), flow rate 1 mL/minute in 225 nm wave length. The retention time of sibutramine HCl was 4,69 minutes.Validation method result on linierity, accuracy, precision, limit of detection and quantification were effectively performed. The linierity was obtained with a correlation coefficient of 0.998 for analitycal range from 100 ppm to 300 ppm. Accuracy was 99.02% to 103.73%, and precision 3.34% to 6.84%. Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were found to be 16 ppm and 53 ppm. The results indicated that this validation method were accurate and successfully applied for quantitative determination of sibutramine HCl in slimming traditional medicine. Quantitative determination method showed the slimming traditional medicine brand A and brand B contain sibutramine HCl of 15.39 mg/capsule and 12.83 mg/capsule respectively.
Volume 2, Nomor 1 (2015) Jurnal Pharmascience
I. PENDAHULUAN
Obat tradisional adalah bahan atau ramuan berupa bahan tumbuhan, bahan hewan, bahan mineral, sediaan sarian atau campuran dari bahan tersebut, yang secara tradisional telah digunakan untuk pengobatan berbagai macam penyakit. Syarat obat tradisional menurut Permenkes RI No. 007 Tahun 2012 obat tradisional tidak boleh mengandung bahan kimia obat. Berdasarkan Riskesdas 2010 persentasi masyarakat pengkonsumsi jamu setiap tahunnya semakin meningkat. Meningkatnya penggunaan jamu dari tahun ke tahun di masyarakat mendorong semakin banyak industri obat tradisional dan jamu yang bermunculan. Banyaknya industri obat tradisional tersebut membuat pemerintah kesulitan dalam melakukan pengawasan terhadap kualitas dan peredarannya. Hal ini mendorong produsen melakukan kecurangan untuk meningkatkan penjualan dari produknya, salah satunya yaitu dengan menambahkan bahan kimia obat (BKO) dalam jamu agar dapat menimbulkan efek yang cepat (instan) (Firdaus and Utami, 2009).
Sibutramin Hidroklorida (Sibutramin HCl) merupakan BKO yang sering ditambahkan dalam jamu pelangsing. Adanya kandungan sibutramin HCl dalam jamu pelangsing membuat efek penurunan berat badan yang ditimbulkan akan semakin cepat. Sibutramin HCl yang ditambahkan dalam jamu dapat menyebabkan timbulnya pusing, mual, diare, meningkatkan denyut jantung, palpitasi, meningkatkan tekanan darah, hilangnya nafsu
makan, rasa haus berlebihan, insomnia, mediatris gangguan kardiovaskular, serangan jantung dan stroke (Jung et al., 2006).
Masih tingginya peredaran jamu yang mengandung BKO dan besarnya bahaya yang ditimbulkan, maka penelitian dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui secara kualitatif dan kuantitatif BKO sibutramin HCl dalam jamu pelangsing. Menurut Permata (2012), suatu metode analisis secara kualitatif dan kuantitatif penting untuk dilakukan validasi metode analisis. Hal ini bertujuan untuk menjamin bahwa metode analisis mampu memberikan hasil analisis yang akurat, spesifik, dan reprodusibel. Jika validasi metode telah memenuhi persyaratan parameter maka metode dapat dikatakan akurat untuk menganalisis kandungan sibutramin HCl dalam jamu pelangsing. Mengingat masih tingginya peredaran jamu yang mengandung BKO, maka sebagai upaya pengawasan terhadap penyalahgunaan BKO sibutramin HCl, beberapa peneliti telah mengembangkan metode kromatografi untuk menganalisis sibutramin HCl dalam jamu pelangsing. Metode analisis dengan KLT (Phattanawasin et al., 2012), KLT-KT (Kamil & Naji, 2011) dan KCKT (Ariburnu et al., 2012; Jung
et al., 2006) dikembangkan untuk mendapatkan
metode yang lebih sederhana, cepat, selektif dan akurat dalam mendeteksi adanya sibutramin HCl dalam obat tradisional. Menurut Ariburnu et
al.(2012), metode KLT dan KLT-KT merupakan
Volume 2, Nomor 1 (2015) Jurnal Pharmascience dan akurat dibandingkan KCKT akan tetapi matrik
dalam jamu dapat menggangu proses elusidasi sibutramin HCl sehingga memicu terjadinya tailing (berekor). Oleh karena itu, KCKT dipilih agar dapat mengatasi masalah tersebut. Analisis sibutramin HCl pada jamu pelangsing dengan KCKT sebelumnya telah dilakukan dengan menggunakan beberapa jenis detektor terbaru seperti detektor flouresensi (Ariburnu et al., 2012) dan detektor photodiode array (Jung et al., 2006). Namun, pada metode analisis tersebut detektor yang digunakan tidak selalu terdapat di semua laboratorium. Pada penelitian ini dilakukan metode analisis yang lebih sederhana yaitu dengan meggunakan detektor KCKT yang umum digunakan yaitu detektor UV-Vis. Penelitian ini diharapkan mampu memberikan hasil analisis yang akurat dan cepat yang tidak jauh berbeda dengan metode sebelumnya walaupun menggunakan detektor yang lebih sederhana yaitu detektor UV-Vis.
II. METODEPENELITIAN A. Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini dua merek dagang jamu pelangsing, Akuabides, kalium dihidrogen fosfat (analytical grade, Merck), asetonitril (HPLC grade, Merck), asam ortofosfat (analytical grade, Merck), sibutramin HCl (99,63%, baku pembanding Farmakope), nilon membran filter 0,45µg (Wathman®).
Alat yang digunakan adalah seperangkat alat KCKT (Knauer® Isokratik) terdiri dari detektor
UV-Vis, injektor manual, kolom Eurospher® 100-5 C-18 (4,6 x 250mm), komputer, pompa, wadah fase gerak, ultrasonikator (Bandelin® Sonorex Digitec), pipet volume (Pyrex®), neraca analitik (Adam®), vortex mixer (JEIO® Tech VM 98B), pH meter (Jenway® 370), dan alat-alat gelas.
B. Cara Kerja
1. Pembuatan fase gerak
Sebanyak 3,4005g kalium dihidrogen fosfat ditambahkan ke dalam labu ukur 500mL kemudian ditambahkan akuabides sampai tanda batas, lalu
diultrasonikasi (Suneetha & Rao, 2011). Asetonitril
dicampurkan dengan buffer kalium dihidrogen
fosfat (70:30v/v)dan membuat pH nya 5,5 dengan
asam ortofosfat 10%. Kemudian diultrasonikasi dan disaring dengan membran filter 0,45 µm
(Radhakrishna et al., 2000; Suneetha & Rao, 2011; Suthar et al., 2009).
2. Preparasi larutan baku standar
Sebanyak 50 mg sibutramin HCl ditimbang kemudian dilarutkan dengan 10 mL fase gerak sebagai pelarut, kemudian divortex selama satu menit dengan kecepatan 2500 rpm dan ditambahkan pelarut hingga 50 mL, hingga didapatkan larutan baku induk 1000 ppm. Selanjutnya dilakukan pembuatan larutan baku kerja dengan penambahan fase gerak menjadi 100, 150, 200, 250 dan 300 ppm dari larutan baku standar. Sebelum dilakukan analisis dengan KCKT, semua analit harus diultrasonikasi selama 15 menit dengan suhu 25°C
Volume 2, Nomor 1 (2015) Jurnal Pharmascience dan disaring dengan membran filter 0,45 µm.
Larutan baku standar dapat disimpan dalam suhu
5°C yang terlindung dari cahaya (Ariburnu et al.,
2012).
3. Preparasi sampel
Sampel yang digunakan adalah dua macam merek jamu pelangsing yang paling sering diperjualbelikan di Banjarmasin. Secara seksama bobot rata-rata dari masing-masing sampel yang sebelumnya telah homogen dengan menimbang serbuk jamu dari 10 kapsul. Kemudian rata-rata bobot sampel tiap kapsul dilarutkan dengan fase gerak dan dimasukkan dalam labu ukur 50 mL dan ditambahkan lagi fase gerak sampai tanda batas. Kemudian larutan sampel divortex dan diultrasonikasi, lalu disaring menggunakan kertas saring dengan dua kali penyaringan, dan dilakukan penyaringan ketiga dengan membran filter 0,45 µm (Ariburnur et al., 2012).
4. Preparasi sampel 80%, 100% dan 120% spiked Larutan standar 300 ppm dipipet dengan volume masing-masing sebanyak 2,7 mL, 3,35 mL, dan 4 mL untuk sampel jamu merek A dan 1,6 mL, 2,0 mL dan 2,4 mL untuk sampel jamu merek B ke dalam labu ukur 10 mL kemudian ditambahkan 5 mL larutan sampel terhadap masing-masing spiked ditambahkan fase gerak sampai tanda batas
(Ariburnu et al., 2012).
5. Kondisi KCKT yang digunakan
Kondisi KCKT untuk analisis sibutramin HCl adalah menggunakan detektor UV-Vis dengan panjang gelombang 225 nm dan volume injeksi sebanyak 20 µL. Waktu analisis adalah 9,5 menit untuk satu kali pembacaan kromatogram dengan elusi isokratik. Kolom menggunakan Eurospher
C-18 (5 µm, 4,6 x 250 mm) dan suhu kolom 25°C
dengan kecepatan alir 1 mL/menit (Suneetha & Rao, 2011; Suthar et al., 2009).
6. Linieritas
Larutan baku kerja dibuat dengan rentang
konsentrasi 100, 150, 200, 250 dan 300 ppm
masing-masing sebanyak 20 µL ke dalam sistem KCKT, dilakukan tiga kali pengukuran. Selanjutnya ditetapkan kurva linier: y=bx+ a, dimana a adalah intersept (perpotongan dengan garis dengan sumbu y) dan b adalah slope (kemiringan garis regresi),
kelinieran kurva ditentukan dengan cara
menghitung koefesien korelasi (r) (Ariburnu et al.,
2012). Linieritas diterima apabila nilai r ≥ 0,997
(Ahuja & Rasmussen, 2007).
7. Akurasi
Akurasi dilakukan bersamaan dengan uji presisi yaitu terhadap larutan sampel yang telah dibuat sebelumnya dengan konsentrasi 80%, 100% dan 120%, lalu menyuntikkan masing-masing sebanyak 20 µL ke dalam sistem KCKT dengan
tiga kali pengukuran tiap konsentrasi. Kemudian
Volume 2, Nomor 1 (2015) Jurnal Pharmascience dari hasil didapatkan dari pembacaan. Akurasi
diterima jika memenuhi kriteria nilai % recovery 90-107% (Gonzales et al., 2010).
8. Presisi
Presisi dilakukan yaitu dengan keterulangan (repeatability) dengan tahap intraday. Caranya menyuntikkan masing-masing sebanyak 20 µL larutan sampel recovery yang telah dibuat sebelumnya ke dalam sistem KCKT. Uji intraday adalah melakukan pengulangan tiga kali pada tiap konsentrasi dan melakukannya pada satu hari yang sama (Ariburnu et al., 2012). Kemudian melakukan evaluasi hasil yang didapat dengan regresi data linier dan kemudian menentukan standar deviasi (SD) dan persentase standar deviasi relatif (%RSD).
Presisi diterima bila memenuhi kriteria
nilai %RSDH ≤ 8,63% (Gonzales et al., 2010).
9. Batas deteksi dan batas kuantitas
Uji penentuan batas deteksi (LOD) dan batas kuantitas (LOQ) adalah dengan menghitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linier y=a +bx,
sedangkan simpangan baku sama dengan
simpangan baku residual (Sy/x) (Harmita, 2004). Menghitung nilai LOD dan LOQ berdasarkan garis regresi linier dari kurva kalibrasi adalah sebagai berikut.
LOD = dan LOQ =
(Singh, 2013).
10. Penetapan kadar sibutramin HCl dalam jamu pelangsing
Melakukan pengulangan pada masing-masing sampel yang telah dibuat sebelumnya sebanyak 3 kali. Menyuntikkan masing-masing larutan uji tersebut ke dalam sistem KCKT sesuai prosedur yang telah dipilih pada uji optimasi. Sebelum melakukan penyuntikan, sampel harus melalui penyaring terlebih dahulu dengan menggunakan membran filter 0,45 µm. Mengamati hasil dari kromatogram dan menghitung kadar sibutramin HCl dalam jamu pelangsing dengan menggunakan kurva kalibrasi (Ariburnu et al., 2012).
III. HASILDANPEMBAHASAN
Penetapan kadar sibutramin HCl pada dua jamu pelangsing dilakukan dengan menggunakan KCKT. Kondisi KCKT yang digunakan adalah dengan kolom C-18 dan detektor UV-Vis dengan panjang gelombang 225 nm, volume injeksi sebanyak 20 µL, suhu kolom 25°C, kecepatan alir 1 mL/menit dan waktu analisis selama 9,5 menit untuk satu kali pembacaan kromatogram dan elusi isokratik. Sebelum penelitian lebih lanjut dilakukan yaitu penetapan kadar sibutramin HCl dalam jamu pelangsing, metode harus divalidasi terlebih dahulu.
Validasi metode dilakukan dengan tujuan untuk memastikan bahwa metode tersebut akurat dan spesifik, dan reprodusibel. Validasi metode analisis
Volume 2, Nomor 1 (2015) Jurnal Pharmascience
yang dilakukan adalah penentuan linieritas, batas deteksi dan batas kuantitas, akurasi dan presisi.
Gambar 1. Kurva kalibrasi larutan standar
sibutramin HCl
Tabel I. Hasil pengujian linieritas dengan tiga kali
replikasi
Menutut Ahuja dan Rasmussen (2007), nilai keberterimaan hasil linieritas adalah r ≥ 0,997. Dari hasil koefisien korelasi dari tiga replikasi menunjukan bahwa metode telah memenuhi
persyaratan linieritas. Berdasarkan hasil pengujian
linieritas dapat ditentukan nilai batas deteksi (LOD) dan batas kuantifikasi (LOQ). Pada metode ini nilai batas deteksi dan batas kuantifikasi adalah 0,016 µg/L dan 0,53 µg/L. Batas deteksi dan batas kuantifikasi didasarkan perhitungan statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi (Singh, 2013).
Menurut Gonzales et al. (2010), nilai %recovery yang dapat diterima untuk konsentrasi yang
digunakan adalah pada rentang 90-107%. Sedangkan nilai presisi berdasarkan tetapan Horwitz harus berada pada %RSDH ≤ 8,63%. Dari hasil yang didapatkan dari kedua uji menunjukan bahwa metode analisis yang digunakan memenuhi kriteria untuk suatu metode analisis yang akurat dan teliti. Hasil dari parameter validasi metode analisis yakni linieritas, batas deteksi dan batas kuantifikasi, akurasi dan presisi yang telah dilakukan secara keseluruhan telah memenuhi persyaratan yang ditetapkan. Hal ini menunjukan bahwa metode analisis sibutramin HCl dalam jamu pelangsing dapat memberikan hasil yang akurat dan dapat digunakan untuk penetapan kadar.
Tabel II. Hasil uji akurasi dan presisi dengan
spiked 80%, 100% dan 120% dari larutan baku standar 300 ppm terhadap sampel
Metode penetapan kadar sibutramin HCl pada jamu pelangsing dilakukan pada dua merek jamu pelangsing yang masih banyak diperjualbelikan di pasaran di wilayah Banjarmasin. Dari kedua sampel jamu, dinyatakan untuk jamu merk A merupakan jamu yang telah dicabut izin edarnya oleh BPOM sedangkan untuk jamu merk B merupakan jamu yang mencantumkan nomor izin palsu (fiktif).
Volume 2, Nomor 1 (2015) Jurnal Pharmascience
Tabel III. Hasil perolehan kadar sibutramin HCl
pada tiap kapsul dari sampel Jamu Pelangsing
Hasil analisis dilakukan dengan membandingkan waktu retensi dan spektrum yang terdeteksi pada sampel terhadap larutan standar sibutramin HCl. Sampel dikatakan positif mengandung sibutramin HCl, bila waktu retensi dari sampel sama dengan larutan standar sibutramin HCl. Dari analisis kedua merk jamu tersebut diperoleh adanya puncak pada daerah waktu retensi 4,69 menit. Hal ini menunjukkan bahwa kedua jamu tersebut mengandung BKO (Bahan Kimia Obat) sibutramin HCl. Kadar sibutramin HCl yang terhitung pada jamu merk A adalah sebesar 15,39 mg tiap kapsul sedangkan jamu merk B adalah sebesar 12,83 mg tiap kapsulnya. Adanya kandungan sibutramin HCl dalam jamu tersebut menyatakan bahwa kedua jamu tersebut tidak sesuai dengan persyaratan obat tradisional dari Permenkes RI No. 007 Tahun 2012. Adanya kandungan BKO pada jamu sangat berbahaya karena kebanyakan BKO yang ditambahkan tergolong obat keras yang dalam pemakaian harus dengan resep dokter sehingga akan timbul efek bahaya karena adanya efek
samping dan kontraindikasi. Hal ini disebabkan karena kebanyakan ditambahkan tanpa takar yang jelas sehingga jika jamu dikonsumsi secara rutin maka akan sangat membahayakan konsumen.
IV. KESIMPULAN
Validasi metode penetapan kadar sibutramin HCl dalam jamu pelangsing menggunakan KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) memberikan hasil LOD dan LOQ dengan nilai 16 ppm dan 53 ppm, akurasi dengan nilai 99,02-103,73% dan presisi dengan nilai 3,34-6,84%. Hasil ini menunjukan bahwa metode yang digunakan telah memenuhi persyaratan syarat validitas. Hasil dari analisis penetapan kadar kedua sampel merek jamu pelangsing yang digunakan mengandung sibutramin HCl dengan kadar tiap kapsulnya masing-masing sebesar 15,39 mg untuk merek jamu A dan 12,83 mg untuk merek jamu B.
DAFTARPUSTAKA
Ahuja, S & H. Rasmussen. 2007. HPLC Method
Development for Pharmaceuticals: Volume 8 of Separation Science and Technology- Elsevier
Academic Press. United Kingdom.
Ariburnu, E., M. F. Uludag, H. Yalcinkaya & E. Yesilada. 2012. Comparative Determination of Sibutramine as an Adulterant in Natural Slimming Products by HPLC and HPTLC Densitometry.
Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 65: 77-81.
Firdaus, M. I. & P. I. Utami. 2009. Analisis Kualiatif Paracetamol Pada Sediaan Jamu Serbuk Pegal Linu yang Beredar Di Porwokerto.
Pharmacy. 06: 1
González B. G., M. Á.Herrador, A. & G. Asuero. 2010. Intra-laboratory Assessment of Method
Volume 2, Nomor 1 (2015) Jurnal Pharmascience Accuracy (Trueness and Precision) by Using
Validation Standards. Talanta. 82: 1995-1008. Jung, J., M. H. Clausen., & W.W. Weinmann. 2006.
Anoretic Sibutramin Detected in a Chinese Herbal Drug for Weight Loss. Forensic Science
International. 161 : 211-222.30
Kamil, M. & M.A. Naji. 2009. Determination of Undeclared Chemicals in Herbal Slimming Medicines using HPTLC. VIVECHAN-IJR.02: 14-17.
Permata, D. 2012. Optimasi Metode Identifikasi Antalgin dan Klofeniramin Maleat Secara KCKT Photoidiode Array setelah Pemisahan dengan Solid Phase Extraction pada Sediaan Serbuk Obat Tradisional. Skripsi Program S-1, Universitas Indonesia, Depok.
Permenkes RI, 2012. Permenkes RI : No.007 Tahun
2012 Tentang Registrasi Obat Tradisional.
Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.
Radhakrishna, T., Ch. L. Narayana, D. S. Rao., K. Vyas & G. O. Reddy. 2000. LC Method for The Determination of Assay And Purity Of Sibutramine Hydrochloride And Its Enantiomers by Chiral Chromatography. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analyisis. 22:
627-639.
Singh, R. 2013. HPLC Method Development and Validation- an Overview. Journal Pharmacy
Education Research. 4: 26-33.
Suneetha, D & A. L. Rao. 2011. A Stability Indication HPLC Method for The Determination of Sibutramine Hydrochloride in Bulk and Commercial Formulations. International Journal
of Research in Pharmacy and Chem. 01: 1-6.
Suthar, A.P., S. A. Dubey & S. R. Patel. 2009. A Validated Spesific Reverse Phase HPLC for Estimation of Sibutramine Hidrochloride
Monohydrate in Bulk Drug and Capsule Dosage Forms. International Journal of ChemTech
