BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Natrium Diklofenak
Natrium diklofenak merupakan obat golongan anti inflamatori non steroid (AINS) yang mempunyai daya anti radang terkuat dan efek samping yang kurang kuat dibandingkan dengan obat lainnya (indometasin, piroxicam). Natrium diklofenak adalah bentuk garam natrium dari diklofenak dan merupakan turunan dari fenilasetat. Obat ini sering digunakan untuk segala macam nyeri, juga pada migrain dan encok (Tjay dan Rahardja, 2007).
Natrium diklofenak memiliki rumus molekul C14H10Cl2NNaO2 (Ar = 318,13) dengan rumus struktur seperti pada Gambar 1. Natrium [o-(2,6-dikloroanilino) fenil] asetat adalah nama kimia dari natrium diklofenak. Obat ini berbentuk serbuk hablur putih hingga hampir putih, bersifat higroskopis dan melebur pada suhu 284 OC. Sifat kelarutannya mudah larut dalam metanol, larut dalam etanol, agak sukar larut dalam air dan praktis sukar larut dalam kloroform serta eter (Depkes RI, 2009).
Gambar 1. Rumus struktur natrium diklofenak (Anonim, 2007)
Natrium diklofenak diabsorbi oleh saluran cerna dengan cepat dan lengkap. Obat ini terikat 99% pada protein plasma dan mengalami efek metabolisme lintas pertama (first-pass) sebesar 40-50%. Walaupun waktu paruh singkat yakni 1-3 jam, diklofenak diakumulasi di cairan sinovial yang menjelaskan efek terapi di sendi jauh lebih panjang dari waktu paruh obat tersebut (Gunawan et al, 2008). Lima metabolit dari natrium diklofenak telah
diidentifikasi dalam plasma dan urin manusia, dimana kelima metabolit tersebut dimediasi oleh enzim sitokrom P450 (CYP450) seperti CYP2C9, CYP2C8, CYP3A4 dan UGT2B7 (Naisbitt et al, 2007). Proses metabolisme natrium diklofenak dapat dilihat pada Gambar 2.
Gambar 2. Metabolisme natrium diklofenak (Naisbitt et al, 2007)
Efek analgetik natrium diklofenak dimulai setelah 1 jam. Pemberian secara rektal dan parenteral menghasilkan efek yang lebih cepat, masing-masing setelah 30 dan 15 menit. Penyerapan diklofenak dalam bentuk garam kalium lebih cepat dibandingkan diklofenak dalam bentuk garam natrium. Ekskresi obat ini berlangsung melalui saluran kemih dengan 60% sebagai metabolit dan 20% dalam bentuk tinja melalui empedu (Tjay dan Rahardja, 2007).
Natrium diklofenak di pasaran tersedia dalam bentuk tablet salut enterik, emugel, dan salah satunya dalam bentuk diamonium diklofenak (Katzung, 2002). Dosis natrium diklofenak untuk pemberian oral yaitu tiga kali sehari dengan dosis 25-50 mg, pemberian secara rektal yaitu sehari satu kali dengan dosis 50-100 mg, sedangkan pemberian melalui intra muskular pada nyeri kolik atau serangan encok dengan dosis 75 mg satu sampai dua kali sehari selama satu sampai tiga hari (Tjay dan Rahardja, 2007).
Efek samping yang lazim ialah mual, gastritis, eritema kulit, dan sakit kepala sama seperti semua obat AINS. Pemakaian obat ini harus berhati-hati pada pasien tukak lambung. Peningkatan enzim transaminase dapat terjadi pada 15% pasien dan umumnya kembali ke normal (Gunawan et al, 2008). Toksisitas natrium diklofenak menurut Pfizer (2011) menyebutkan bahwa uji pada tikus dengan pemberian oral diklofenak dosis 53 – 77 mg/kgBB dapat menyebabkan kematian pada 50% populasi hewan uji.
B. Bioanalisis
Bioanalisis adalah sub-disiplin kimia analitik yang meliputi pengukuran kualitatif dan kuantitatif obat-obatan serta metabolitnya dalam sistem biologi. Dalam industri farmasi, bioanalisis digunakan untuk menampilkan ukuran kuantitatif dari obat aktif maupun metabolitnya, juga untuk tujuan farmakokinetika, toksikokinetika serta biofarmasetika (Prabu dan Suriyaprakash, 2012). Cairan biologis yang biasa digunakan untuk analisis berupa darah (plasma, serum) dan urine (Munson, 1991).
Cairan biologis merupakan matriks yang sangat kompleks yang terdiri dari komponen yang dapat mengganggu proses pemisahan sampel dan analisis. Contoh cairan biologis yang umum dipakai dalam proses analisis obat dalam cairan biologis yaitu darah. Darah berperan dalam distribusi obat ke jaringan tujuan maupun tempat eliminasi. Selain berfungsi sebagai transporter obat, darah juga berperan dalam transporter banyak zat dan nutrisi untuk seluruh tubuh. Akibat fungsi tersebut banyak senyawa endogen dan eksogen pengganggu dalam analisis. Maka preparasi sampel yang baik dan benar menjadi kriteria yang utama (Prabu dan Suriyaprakash, 2012).
Darah adalah matriks yang kompleks dari cairan tubuh, dimana darah memiliki volume kurang lebih seperduabelas dari berat badan. Darah terdiri dari 55% bagian cair (plasma, beberapa protein, serta lemak terlarut) dan 45% bagian padat (sel darah merah tersuspensi). Bagian padatan penyusun darah dapat dipisahkan dari plasma dengan sentrifugasi sederhana. Perlakuan ini harus hati-hati mengingat sel darah mudah pecah dan menyulitkan pemisahan
komponen. Bagian cairan pada darah dapat berupa plasma maupun serum, kedua komponen ini serupa dalam banyak hal kecuali bahwa serum tidak lagi mengandung faktor pembekuan karena sudah digunakan pada proses pembekuan (Chamberlain, 1995).
Kehadiran protein dapat menyulitkan pemisahan obat dari plasma, sehingga perlu ada proses ekstraksi atau pra perlakuan terhadap plasma guna menghilangkan protein dari plasma. Ada beberapa prosedur ekstraksi untuk menghilangkan protein di antaranya yaitu: Liquid-Liquid Extraction (LLE), Solid Phase Extraction (SPE), metode pengendap protein, Solid phae
microextraction (SPME), Matrix Solid-Phase Dispertion (MSPD),
Supercritical fluid extraction, Column switching. Dari berbagai metode
ekstraksi tersebut metode denaturasi protein lebih sederhana dan cepat dimana sampel ditambahkan dengan pelarut khusus seperti asam trikloroasetat, asam perkolat, asam tungstat, dan pelarut organik yang berupa metanol dan asetonitril. Penggunaan pelarut-pelarut tersebut akan mengganggu ikatan antara protein dengan plasma. Selanjutnya larutan disentrifugasi dan hasilnya akan terdapat dua lapisan dimana plasma akan berada di lapisan atas, sedangkan protein akan mengendap di bawah (Prabu dan Suriyaprakash, 2012).
C. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan suatu teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan kemurnian sampel pada sejumlah bidang. KCKT adalah metode yang dapat digunakan dengan baik dalam analisa kualitatif maupun kuantitatif dan suatu metode yang tidak destruktif (Gandjar dan Rohman, 2007).
KCKT biasanya digunakan dalam menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologi; menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi (Gandjar dan Rohman, 2007). Cara kerja KCKT yaitu berdasarkan
teknik pemisahan dimana solut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan ini diatur oleh distribusi solut dalam fase gerak dan fase diam (Gandjar dan Rohman, 2007). Sampel yang akan dianalisis disuntikan secara langsung ke dalam aliran fase gerak yang mengalir di bawah tekanan tinggi menuju kolom. Di dalam kolom terjadi pemisahan dimana solut terpisah oleh perbedaan kepolaran dan kecepatan elusi.
Kromatografi cair kinerja tinggi mempunyai beberapa kelebihan dan kekurangan dibanding dengan metode lain. Kelebihan KCKT yaitu: mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah melaksanakannya, kecepatan analisis dan kepekaan tinggi, dapat dihindari kerusakan bahan yang dianalisis, resolusi yang baik, dapat digunakan bermacam-macam detektor, kolom dapat digunakan kembali serta mudah melakukan rekoveri sampel (Putra, 2007). Kelemahan KCKT yaitu : kolom KCKT bisa tersumbat oleh kotoran sepeti protein sehingga kemurnian sampel harus dijaga.
Teknik pemisahan pada KCKT dapat dilakukan dengan dua fase yaitu fase normal dimana fase diam lebih polar dari pada fase gerak, sedangkan fase terbalik yaitu fase diam kurang polar dibanding fase geraknya. Berdasarkan penggunaan fase gerak dan fase diam, KCKT dibagi menjadi beberapa jenis, di antaranya yaitu: kromatografi adsorbsi, kromatografi partisi, kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi ukuran (Gandjar dan Rohman, 2007). Kromatografi partisi disebut juga dengan kromatografi fase terikat, dimana kromatografi ini berdasarkan partisi zat padat di antara dua pelarut yang tidak dapat bercampur, salah satu pelarut bertindak sebagai fase diam sedangkan pelarut yang lain berupa fase diam (Putra, 2007). Fase diam kromatografi partisi adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat, modifikasi ini berupa hidrokarbon-hidokarbon nonpolar seperti oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Sedangkan fase geraknya adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan dapar. Peranan pH sangat berpengaruh khususnya untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah karena jika pH fase gerak tidak diatur maka akan terjadi ionisasi dan
protonisasi. Terjadinya proses ini menyebabkan ikatan dengan fase diam jadi lebih lemah dan mempercepat elusi dibanding dengan solut yang tidak terionkan (Gandjar dan Rohman, 2007). Komponen-komponen KCKT secara umum dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Komponen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (Settle, 1997)
1. Reservoir
Reservoir atau wadah fase gerak merupakan suatu tempat penampung fase gerak yang harus bersih dan bersifat inert. Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien yakni komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi (Gandjar dan Rohman, 2007).
2. Fase Gerak
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur secara keseluruhan dan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen - komponen sampel (Gandjar dan Rohman, 2007). Ada beberapa kriteria yang harus dipenuhi dalam pemilihan fase gerak di antaranya yaitu viskositas, transparansi UV, reaktif indeks, titik didih, kemurnian, inert, tidak menyebabkan korosi, toksisitas, dan harga (Mayer, 2004).
3. Pompa
Pompa pada KCKT digunakan sebagai penggerak fase gerak ke dalam kolom. Pompa yang digunakan sebaiknya memberikan tekanan sampai 5000
psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 3 mL/menit. Ada dua tipe pompa yang digunakan yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement) (Putra, 2007).
4. Injektor
Injektor merupakan komponen dari KCKT yang berfungsi untuk memasukan sampel. Pada waktu pengisian sampel, sampel dialirkan melalui keluk sampel dan kelebihannya dirilis ke pembuang. Pada saat penyuntikan, katup diputar sehingga fase gerak mengalir melewati keluk sampel dan menggelontorkan sampel ke kolom (Gandjar dan Rohman, 2007).
5. Kolom
Bagian ini merupakan organ vital pada proses KCKT, berhasil atau tidaknya analisis dengan KCKT bergantung pada pemilihan kolom serta kondisi penelitian. Kolom umumnya dibuat dari stainless steel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok yaitu: kolom analitik dan kolom preparatif (Putra, 2007).
6. Detektor
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV-Vis. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan kisaran yang lebih luas (Putra, 2007).
7. Integerator
Integerator atau recorder merupakan suatu alat yang berfungsi mengukur
sinyal elektronik yang dihasilkan oleh detektor lalu memplotkannya sebagai kromatogram (Gandjar dan Rohman, 2007). Integerator biasanya berupa komputer maupun alat penangkap data yang telah terprogram untuk fungsi tersebut.
D. Validasi Metode Analisis
Validasi metode analisis merupakan suatu tindakan penelitian terhadap parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Ada beberapa parameter validasi metode analisis yang harus dipenuhi agar suatu metode dikatakan valid. Menutrut Harmita (2004) parameter validasi tersebut meliputi :
1. Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan suatu metode yang memberikan gambaran langsung maupun melalui bantuan perhitungan matematis yang menghasilkan data yang proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linearitas suatu metode dapta dilihat dari menghitung regresi linear antara hasil pengukuran vs konsentrasi (Harmita, 2004)
Data berupa slope (b), intercept (a) dan koefisien korelasi (r) dari perhitungan hasil regresi linear antar hasil yang terukur vs konsentrasi berupa Y=bx+a akan memberikan gambaran tentang linearitas, nilai dari koefisien korelasi (r) merupakan parameter untuk mengetahui hubungan yang linear. Hubungan linear yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau -1 bergantung pada arah garis. Sedangkan nilai a menunjukan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan.
2. Batas deteksi dan batas kuantitasi
Batas deteksi adalah jumlah terkecil analit yang masih memberikan respon yang signifikan dibanding dengan blanko. Batas deteksi digunakan sebagai batas uji batas pada suatu penelitian. Sedangkan batas kuantitasi adalah kuantitas terkecil analit yang masih dapat memberikan hasil yang cermat dan seksama . Perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dilihat pada persamaan 1 (Harmita, 2004).
(1)
Keterangan :
K = 3 untuk batas deteksi dan 10 untuk batas kuantitasi
Sb = simpangan baku respon analitik blanko (simpangan baku residual Sy/x)
SI = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon
terhadap konsentrasi yaitu slope (b pada persamaan garis y=bx+a) 3. Keseksamaan (presisi)
Keseksamaan merupakan ukuran yang menunjukan kedekatan hasil uji individu dengan metode pengukuran yang dilakukan secara berulang-ulang pada sampel yang homogen. Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatiblity) atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan didefinisikan sebagai keseksamaan metode yang dilakukan oleh individu yang sama secara berulang pada kondisi yang sama serta dalam interval waktu yang pendek. Sedangkan ketertiruan didefinisikan sebagai keseksamaan metode jika dilakukan pada kondisi yang berbeda. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan simpang baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang (Harmita, 2004).
Kriteria ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah sampel dan kondisi laboratorium. Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasi relatif antara laboratorium adalah 2,5% ada pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) nilai RSD adalah 16% dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang kritis secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2% (Harmita, 2004). Penentuan presisi dapat dilihat pada perhitungan Persamaan 2, 3, dan Persamaan 4.
SD =
(2)
KV = x 100% (3)
4. Kecermatan (accuracy)
Kecermatan didefinisikan sebagai ukuran yang menunjukan drajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kemabali (rekovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan hasil analisis sangat tergantung pada sebaran kesalahan sistemik di dalam keseluruhan tahapan analisis. Oleh karena itu untuk mencapai kecermatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi kesalahan sistemik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi yang dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu dan pelaksanaan yang cermat, taat sesuai prosedur (Harmita, 2004).
Perhitungan persen perolehan kembali dapat dilihat pada perhitungan Persamaan 5.
... (5)
Nilai rata-rata perolehan kembali (recovery) analit antara 80-120%(Gandjar & Rohman, 2007).
E. Penelitian Terdahulu Analisis Natrium Diklofenak dengan Metode KCKT
Berkembangnya metode KCKT memberikan kemajuan pada analisa obat baik dalam formulasi maupun dalam cairan biologis. Berikut beberapa metode KCKT dalam analisa natrium diklofenak.
Pada monograf suplemen 1 Farmakope Indonesia, (2009) analisa tablet natrium diklofenak lepas lambat menggunakan kolom L7(end-capped) 4,6 mm x 25 cm, fase gerak metanol : dapar fosfat pH 2,5 (70:30) laju alir 1 ml/menit pada panjang gelombang 254 nm menghasilkan waktu retensi relatif 1,0 menit. Penggunaan fase gerak dengan pH 2,5 cukup riskan bila digunakan pada kolom oktadesil yang memiliki batas pH 2,5-8,5 (Watson, 2005).
Penelitian Kasperek (2008) yang menganalisa diklofenak dan papaverin hidrokloriden dalam tablet menggunakan metode KCKT, kolom zorbax SB C18, fase gerak metanol: air (60:40), laju alir 1 mL/menit dan detektor UV 278
nm menghasilkan grafik kromatogram yang baik. Kromatrogram diklofenak muncul pada menit ke 2,73 menit, walaupun hasil kromatogramnya bagus namun metode ini cukup riskan mengingat tidak menggunakan larutan dapar sehingga memungkinkan ketidakstabilan fase gerak. Penelitian ini hanya menggambarkan diklofenak dalam formulasi sehingga tidak dapat menunjukan data diklofenak dalam cairan biologis.
Penelitian Iersa (2012) yang menganalisa natrium diklofenak dan vitamin C dengan hewan uji kelinci menggunakan metode KCKT. Metode ini menggunakan kolom C18 (250 mm x 4,60 mm), detektor UV-vis dan fase gerak berupa metanol : dapar asetat (85:15) dengan laju alir 1 mL/menit. Dalam preparasi sampel biologis, darah sebanyak 1 mL ditampung dalam wadah yang berisi 2 tetes heparin kemudian ditambahkan TCA 20% sebanyak 1mL untuk mendapatkan plasma. Hasil kromatogram yang didapat menggambarkan bahwa natrium diklofenak muncul pada waktu retensi 4,5 menit dan senyawa endogen plasma muncul pada menit ke 3.
Penelitian Muntean et al (2011) menganalisa profil farmakokinetika natrium diklofenak dalam plasma manusia menggunakan metode KCKT kolom gemini NX-C18 (50 mm x 2,0mm) 3 µm, detektor berupa spektro massa dan fase gerak campuran dari asam asetat 0,2% : asetonitril (47:53) dengan laju alir 0,6 mL/menit. Preparasi sampel darah dengan cara 0,2 mL plasma ditambah dengan 0,6 mL metanol yang kemudian diultrasentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm. Keunggulan metode Muntean et al (2011) yaitu dalam jumlah plasma yang digunakan yaitu hanya sebesar 0,2 mL sangat cocok untuk analisa obat dalam cairan biologis dengan hewan uji seperti tikus yang volume darah total sedikit.
