KAJIAN MORFOPATOLOGI DAN IMMUNOLOGI PADA AYAM SPECIFIC PATHOGEN FREE (SPF) SETELAH DIVAKSINASI DENGAN VAKSIN GUMBORO AKTIF STRAIN INTERMEDIATE

Buletin Pengujian Mutu Obat Hewan No. ll Thhun 2005

KAJIAN MORFOPATOLOGI DAN IMMUNOLOGI PADA

AYAM SPECIFIC PATHOGEN FREE ^(SPF) SETELAH DIVAKSINASI DENGAN VAKSIN GUMBORO AKTIF

STRAIN INTERMEDIATE

Syahroni B.t), HandharyaniE.2), Soejoedono R. D.2), Jusa E. R.1) 1). Balai Besar Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan _, Gunung Sindur, Bogor

2). Fakultas Kedokteran Hewan , Institut Pertanian Bogor, Bogor.

ABSTRACT

A study was conducted to determine the pathomorphology and immunology in specific pathogen free (SPF) chickens after vaccination with intermediate strain of infectious bursal disease (IBD) live vaccine. In this study, 60 SPF chickens, two weeks old, were allocated into two groups. A11 42 chickens in the first group were each vaccinated orally with 5X doses of intermediate strain of infectious bursal disease (IBD) live vaccine and 18 chickens in the second group were used as controi. All animals were observed every day for the occunence of clinical signs. One week after vaccination.

six chickens from vaccinated group and three chickens from control group were weighed, bleed, and necropsied at weekly intervals. At necropsy, bursa of Fabricius, thymus and spieen were weighed and immersed in ^107o formalin in phosphate buffered saline (PBS) for histopathological examination.

Antibody titer against IBDV was measured by serum neutralization test (SNT). This study showed the value of bursa of Fabricius/body weight ratio index30.Tinbothgroupsexceptinthevaccinatedchickensnecropsiedatfirstweekpostvaccination(0,57). Thevalueofbursalesionscorewas 1-2in all vaccinated chickens and 0 in control group. From first to seventh week post vaccination, all chickens showed ³ 800 times in SNT and control group = 8.0. The antibody titers were significantly increased after vaccination and decreased at the seventh week post vaccination, lower than the minimum requirement (800X).

Key words : Infectious bursal disease (IBD), strain intermediate, specific pathogen free, bursa lesion score, serum netralization test.

PENDAHULUAN

Penyakit virus unggas menimbulkan banyak

kerugian di

Indonesia. Salah satu upaya yang dilakukan untuk penanggulangan penyakit adalah dengan melakukan program vaksinasi yang baik dan

benar. Dari sekian banyak penyakit virus unggas, penyakit Gumboro atau infectious bursal disease

(IBD) masih merupakan penyakit yang sangat sulit diberantas. Salah satu faktor penting yang menentukan suksesnya program vaksinasi adalah mutu vaksin itu

sendiri.

Beberapa tahun belakangan

ini

vaksin Gumboro aktif strain intermediate banyak digunakan

di

lapangan untuk mencegah penyakit Gumboro karena penggunaan vaksin Gumboro aktif strain mild dinilai kurang memberi hasil yang memuaskan.

Penggunaan

vaksin Gumboro aktif

strain

intermediate

sekarang semakin

meningkat

di lapangan, terutama karena banyaknya impor vaksin Gumboro aktif strain intermediate.

Di lapangan banyak dijumpai kegagalan vaksinasi (Partadireja et

al., I99I),

yang diduga disebabkan

oleh

adanya perbedaan

struktur antigen

antara beberapa galur virus IBD dalam serotipe yang sama

(Mc.

Ferran et

al.,

1980;

Ismail

dan

Saif,

1991;

Partadireja dan Soejoedono, 1997). Strain virus tersebut dikenali sebagai strain varian virus yang dapat meniadakan kekebalan ayam yang divaksinasi (Rosenberger dan Cloud, 1986; Lukert, 1992).

Vaksin Gumboro aktif strain intermediate dapat menimbulkan kerusakan pada bursa F abric ius,

timts

dan

limpa,

tetapi kerusakan yang ditimbulkan tidak bersifat permanen, dimana organ organ

ini

akan kembali normal pada jangka waktu tertentu pasca vaksinasi. Vaksin dinyatakan memenuhi syarat

uji

keamanan bila nilai bursal lesion score (BLS)

f

^2,0

(Anonimous, 2002) dan index bursal body weight ratio (IBBWR) ³ 0,7 (Palya et

al. l99l;

Anonimous, 2000).

Tujuan

dari

penelitian

ini

adalah untuk menge-

tahui perubahan histopatologi pada organ bursa Fabricius,

limpa dan

timus, setelah divaksinasi dengan vaksin Gumboro aktif strain intermediate.

BAHAN DAN METODE

Tempat dan Waktu

Penelitian

ini

dilakukan di Balai BesarPengujian

Mutu

dan Sertifikasi Obat Hewan (BBPMSOH), Gunungsindur, Bogor dan Laboratorium Patologi

Buletin Pengujian Mutu Obat Hewan No. l1 Tahun 2005

Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor selama 6 bulan mulai bulan Pebruari 2004 ^sampai dengan bulan

Juli

^2005.

Alat dan Bahan

Alat ^yang digunakan dalam penelitian ini ^adalah:

kandang i s o lat or, spuit, cl e an b e nch, s c alp e

l,

^gunting,

pinset, inkubator 37" C, tabung reaksi, tabung plastik, plate 96 well (tipe ^datar),

parafin drayer,

parafin stracher, gelas objek, gelas penutup, microtome, auto technicon, mikroskop, kamera dan mikropipet untuk pengerjaan ELISA.

Sedangkan bahan yang dipergunakan adalah ^: ayam SPF umur 2 minggu, vaksin

IBD

aktif strain intermediate

(winterfild 2512)

1000 dosis

2

vial, phosphate buffer saline ^(PBS

), formalin I0

^7a,

alkohol, ethyl alkohol 30Va, 507o, J}Va, 80Vo, 957o

dan alkohol absolut, parafin, hematoksilin Mayer, lithium carbonat, balsam Kanada, bursa Fabricius, limpa, timus, serum darah ayam, minimum essential medium (MEM), maintenanc e medium (MM), growth medium (GM) dan reagen -reagen ELISA.

Metode

Penelitian

ini

menggunakan 60 ekor ayam SPF

umur

2

minggu. Ayam tersebut dibagi menjadi ² kelompok, kelompok

I

^sebanyak 42 ekor divaksinasi secara per oral dengan vaksin IBD strain intermediate sebanyak 5

x

dosis/ekor, sedangkan kelompok

II

sebanyak 18 ekor sebagai kelompok kontrol tidak divaksinasi.

Ayam diamati setiap hari terhadap gejala klinis yang timbul. Setelah satu minggu ^pasca vaksinasi diambil 6 ekor ayam kelompok vaksinasi dan 3 ekor ayam kelompok kontrol. Ayam

ditimbang

berat badannya dan diambil darahnya. Kemudian ^ayam dinekropsi dan diperiksa ^secara patologi anatomi terhadap perubahan yang terjadi pada organ bursa F abricius,timus dan limpa. Lalu ditimbang juga berat organnya dan disimpan dalam buffer normal formalin (BNF)

l0

^{Vo seLama2-3} hari.

Pembuatan Preparat Histopatologi

Organ barsa Fabricizs, timus dan limpa ^yang telah difiksasi dalam BNF 10 Vo didehidrasi secara bertahap pada alkohol dan xylol, kemudian dibuat blok paraffin dengan metode standar. Jaringan yang sudah dibuat blok paraffin dipotong ^dengan ketebalan 3-5

mm

dan

dilekatkan pada gelas obyek kemudian dilakukan pewarnaan den gan hematorylin- eb sin (I7E).

Selanjutnya slide dipeiksa di bawah mikroskop untuk melihat perubahan histopatologi.

Serum N eatralization Test (SNT) dan Enzym Linke d Immuno Sorbent Assay (ELISA)

Darah yang diambil disimpan dulu di ruang37"C selama lebih

kurang 2

jam, kemudian disimpan di ruang 4o

C

selama satu malam, keesokan harinya serum dipisahkan dan disentrifugasi dengan kecepatan 1000-2000 rpm selama 5 menit. Serum yang didapat dititrasi antibodinya dengan SNT sesuai dengan prosedur yang dipergunakan oleh FOHI (Anonimous, 2004).

Pembuatan

Biakan Jaringan

^{Chicken Embryo} Fibroblast (CEF)

Terlebih dahulu dilakukan pembuatan biakan jaringan dad telur embryo tertunas (TET) umur 8-10 hari yaitu chicken embryo fibroblast (CEF). ^Setelah monolayer CEF tumbuh diinokulasi dengan ^serum yang telah diencerkan dan dinetralisir dengan virus

standar IBD. Diinkubasi menggunakan inkubator pada

suhu 37"C mengandung

5

Vo

CO'

Selanjutnya

dilakukan

pengamatan setiap

hari

terhadap sel tersebut. Amati timbulnya cytophatic

effict

^(CPE)

pada sel dan dihitung titer antibodinya (Anonimous, 2000; Soejoedono, 1998). Serum yang ^sama juga dititrasi dengan metode ELISA indirek.

Data yang diamati adalah berat badan, berat bursa,

limpa dan timus, titer antibodi, indeks rasio bursa Fabricius, lesi patologi anatomi, dan histopatologi.

HASIL

DAN PEMBAHASAN

Hasil studi ini menunjukkan bahwa pada minggu pertama pasca

vaksinasi IBBWR

mengalami penurunan hingga di bawah 0.7, namun akan segera naik hingga di atas 0,7. Berdasarkan data pada Grafik 1, angka indeks bwsa Fabricius di minggu ^pertama pasca vaksinasi adalah 0,57 berada di bawah standar 0,7 (Palya et

al., I99l)

lalu naik di atas stdndar pada minggu kedua 1,17 kemudian turun lagi pada minggu ketiga dan keempat sampai

di

bawah standar 0,68.

Minggu kelima, ^keenam dan ketujuh angka indeks

Buletin Penguiian Mutu Obat Hewan No. 11 Tahun 2005

bursa relatif stabil

di

angka

0,85.

Sedangkan nilai IBBWR ayam kelompok kontrol pada setiap interval pengamatan selalu berada

di

^atas

nilai

kelompok vaksinasi. Hal

ini

menunjukkan bahwa kelompok

ayam yang tidak mengalami vaksinasi

tidak menunjukkan adanya kerusakan pada bursa Fabricius.

Karena strain vaksin yang diaplikasikan cukup keras, sehingga satu minggu setelah vaksinasi menyebabkan

btrsa

Fabricius mengalami

atrofi

atau mengecil.

Reaksi vaksin Gumboro

aktif

strain intermediate sering merusak organ

limfoid

primer seperti bursa Fabricius dan timus kemudian

diikuti

oleh limpa, ginjal dan ceca tonsil, diikuti oleh perdarahan pada otot dada dan paha (Craig, 1919). Jika dibandingkan dengan ayam kontrol angkaIBBR kelompok vaksinasi di bawah 0,7. Hal ini mengindikasikan bahwa vaksin yang digunakan dalam penelitian

ini

masuk dalam kategori aman atau memenuhi persyaratan minimum pengujian.

Hasil yang sama diperlihatkan pada Graflk 2,

dimana tingkat kerusakan bursa

Fabricius

ayam kelompok vaksinasi (BLS) didapat =

2.

Hal ini juga mengindikasikan vaksin yang sedang

diuji

aman karena memenuhi kriteria standar pengujian vaksin (Anonimous,

2002).

Bursa Fabricius ayam tidak mengalami kerusakan parah seperti nekrosa folikel limfatik, edema jaringan intertisial, adanya vakuola/

cystic cavity dari korteks

folikel,

fibroblasia ^pada jaringan ikat interfolikuler dan bentuk plica bursa F abricius tidak teratur.

234567

Pasca Vaksinasi (minggu)

-- _Konhol -* Vaksimsi

Grafik 1. Perbandingan index bursa body weight ratio

(IBBWR)

antara kelompok ayam ^yang

divaksinasi dengan vaksin Gumboro aktif strain intermediate dan ayam kontrol

345

Pasca Vaksinasi (Minggu) --.- Kontrol * Vaksinasi

Grafik 2. Perbandingan kelompok ayam Gumboro aktif kontrol

Bursa Score

Lesio

antara yang divaksinasi dengan vaksin sttain intermediate dan ayam

Kegagalan vaksinasi Gumboro

di

lapangan banyak disebabkan oleh kerusakan bursa Fabricius, dimana

virus

vaksin strain intermediate banyak berperan (Partadiredja _et al.,

l99l).

Kerusakan bursa Fabricius dapat juga disebabkan oleh virus lapangan yang ganas, dimana vaksin yang dipakai tidak dapat melawan virus lapangan tersebut. Diduga karena adanya perbedaan struktur antigen antara beberapa

strain

virus

Gumboro dalam serotipe yang sama (Mc.Ferran et

al.,

1980;

Ismail

dan

Saif, I99l;

Partadiredja dan Soejoedono, 1997). Pada penelitian ini didapatkan hasil bahwa nilai BLS ayam kelompok vaksinasi dan kontrol ₌ 2,halini menunjukkan bahwa vaksin yang digunakan masuk dalam kategori aman.

Grafik

3 dan 4, menunjukkan bahwa kelompok ayam yang divaksinasi dengan vaksin Gumboro aktif strain intermediate menghasilkan titer antibodi SNT dan

ELISA

yang cukup

tinggi.

Kelompok ayam kontrol dengan SNT menunjukkan titer antibodi 1: 8 dan dengan metode ELISA < 5 EU sepanjang interval pengamatan.

Untuk

SNT nilai protektif

IBD

³ 800 (Anonimous, 2002) sedangkan dengan metode ELISA nilai positip IBD adalah > 5 EU (Affini Teech. ELISA Test

Kit.

2004). Hal ini menunjukkan bahwa semua ayam kelompok kontrol tidak mempunyai antibodi protektif. Sedangkan pada ayam kelompok vaksinasi dengan SNT memperlihatkan titer

>

1 : 800 mulai minggu perlama sampai dengan minggu ke tujuh post vaksinasi dan dengan metode ELISA semua ayam kelompok vaksinasi memperlihatkan nilai titer > 5 EU.

Buletin Penguiian Mutu Obat Hewan No. I I ^Tahun 2005

Angka titer antibodi meningkat secara teratur sampai minggu keempat pasca vaksinasi atau hari ke 28 dimana virus vaksin Gumboro mampu bertahan pada bursa dan mampu menstimulir produksi antibodi (Bayyari et

al.

1996) dan menurun lagi secara teratur sampai minggu ketujuh pasca vaksinasi.

Hasil penelitian ini mendukung penelitian yang dilaksanakan

Kim

et

al.

(1999) yang menyatakan bahwa recovery kemampuan memproduksi antibodi

dan repopulasi dari folikelbursa Fabricius pada ayam SPF umur satu minggu yang divaksinasi dengan vaksin Gumboro aktif strain intermediate akan terlihat pada minggu ketujuh pasca vaksinasi. Kondisi

ini

menggambarkan bahwa organ limfoid primer sebagai

kelenjar

pertahanan

tubuh

ayam seperti bursa Fabricius,limpa dan timus cukup stabil memproduksi antibodi setelah 7 minggu pasca vaksinasi.

23456

Pasca Vaksinasi (1t4inggu)

- ^Kontrol + Vaksinasi

Grafik 3. Perbandingan Titer Antibodi antara Vaksinasi dan Kontrol dengan SNT.

Kelompok

*

Kontrol

*

Vaksinasi

Grafik 4. Perbandingan Titer Antibodi antara Kelompok Vaksinasi dan Kontrol dengan Metode ELISA.

walaupun

divaksinasi dengan 5 x

dosis yang direkomendasikan oleh produsen ternyata nilai BLS dan

IBBWR

masih berada dibawah persyaratan

minimum (Grafik

I

^dan 2)

.

Titrasi antibodi secara

serologis baik dengan

SNT

maupun ELISA tidak berbeda,

grafik titer

menunjukkan kenaikan dan penurunan yang sama. Hasil titer antibodi dengan SNT

secara keseluruhan mulai dari minggu pertama sampai minggu ketujuh berada di atas persyaratan minimum

1 : 800

(Anonimous, 2000). Sedangkan dengan metode

ELISA juga

menghasilkan

titer

antibodi Gumboro yang positip kuat (Moderately positive

for

antibodies to IBD), titer berada pada range 15 EU

-

75 EU (Affini Teech. ELISA Test

Kit,

^2004).

Data berat organ limfoid primer yang lain yaitu timus dan

limpa

ditampilkan pada Grafik 5 dan 6 menunjukkan berat rata-rata timus dan limpa ayam kelompok vaksinasi lebih rendah pada setiap interval mingguan dibandingkan dengan ayam kelompok

kontrol Diduga

ayam

kelompok

vaksinasi mengalami tekanan berat karena pengaruh _virus Gumboro dari vaksin. Reaksi virus vaksin tersebut mempengaruhi kedua organ

limfoid

(Craig et al.,

197 9). Menurut hasil penelitian Tanimura et

al

⁽¹⁹⁹⁸⁾

terjadi insitu apoptosis bursa Fabricizs dan timus pada ayam SPF yang diinokulasi dengan virus IBD strain yang virulen. Hasil histopatologi menunjukkan adanya peningkatan endogenous apoptosis pada limfosit bursa Fabricius dan peningkatan apoptosis sel pada limfosit cortical timus, hal ini bermakna dan berpengaruh negatif terhadap kinerja bursa tersebut.

Hasil penelitian ini menunjukkan

adanya penunrnan kwalitas sel-sel bwsa Fabricius karena pengaruh

dari vaksinasi

menggunakan vaksin Gumboro aktif strain intermediate, akan tetapi tidak sampai menurunkan titer antibodi yang diproduksi, hal ini ditunjukkan dari hasil titer antibodi dengan SNT

dan ELISA yang paralel meningkat mulai dari minggu pertama sampai minggu ketiga dan keempat ialu cenderung menurun pada minggu kelima sampai minggu ketujuh (Grafik 6).

Menurut hasil penelitian Eddy et

al.

(1985) persembuhan dari bursa Fabricius,limpa dan usus pada ayam umur 36 hari yang diinokulasi isolat lapang

virus

Gumboro terjadi pada minggu ketujuh dan kedelapan, tetapi timus mengalami persembuhan pada minggu kedelapan. Pada penelitian

ini,

vaksinasi Gumboro diduga menyebabkan penurunan berat timus dan limpa kelompok ayam vaksinasi disebabkan karena kedua organ

limfoid

bekerja keras dalam memproduksi antibodi dan pengaruh dari supresor sel

60 50

40 30 20 t0

5

0

Grafik

5.

Perbandingan berat (gram) timus kelompok vaksinasi dan kontrol

Buletin Pengujian Mutu Obat Hewan No. 1l Tahun 2005

T yang ada didalam kedua organ. (Soedijar, 1989).

Untuk itu dimungkinkan adanya penelitian lebih lanjut tentang pengaruh

vaksin

Gumboro

aktif

strain intermediate terhadap organ timus dan limpa.

345

Pas c a Vaksinasi (Minggu) --r- Vaksinasi --r- Konfol

Anonimous.

2000.

Balai

Pengujian

Mutu

dan

Sertifikasi Obat Hewan. Petunjuk

Teknis Pengujian Vaksin Viral.

Anonimous. 2004. Farmakope Obat

Hewan

Indonesia. Direktorat

Kesehatan Hewan.

Direktorat Jenderal Bina Produksi Peternakan.

Departemen Pertanian

Bayyari

G.

R.,

Story

J. D.,

Beasley

J. N.

and Skeeles J.

K.

1996. Pathogenicity Studies of an Arkansas Variant Infectious Bursal Disease Virus.

Avian Diseasess;40: 516

-

⁵³²

Craig

D.

W.,

Brown

J.

and

Lukert P.D.

^19'79.

Effect of

Standard and

Variant Strains of

Infectious Bursal Disease Virus on Infections

of

Chickens. Am J

of

Res 51:

Il92 - ^ll97

Eddy R.

K.,

Chettle N. J. and Wyeth P.

J.

¹⁹⁸⁵

Antibody Responses and

Virus

Reisolation in

Turkeys Experimentally

Infected

with

^an

Infectious Bursal Disease Isolate. Vet RecApril:

368

-

³⁶⁹

Ismail N. M. and Saif Y. M . 1991. Immunogenicity of Infectious Bursal Disease Viruses in Chickens.

Avian Diseases 35: 460-469.

Kumar K.o Singh K. C. P. and Prasad C.

B.

2000.

Immune Respons

to

Intermediate Strain IBD Vaccine at Different Levels of Maternal Antibodi in Broiler Chickens. Trop Anim Health and Prod 32:357

-

^360.

Kim I. J.,

Gagic

M. and

Sharma

J. M.

^1999.

Recovery of Antibodi

-

^Producing

^Ability

^and

Lymphocyte Repopulation of Bursal Follicles in Chickens Exposed to Infectious Bursal Disease

Virus.

Avian Diseasess 43 :

401-

4I3.

Lukert

P.D.1992. Didalam Soejoedono RD. 1996.

Pathogenic and

Antigenic

Characteristic

of

Variant Infectious Bursal Disease Virus. Personal Communication

antara

1,6

r,4

1,2

I 0,8 0,6 0,4 0,2 0

345

Pasc a Vaksinasi QAinggu)

-r-

^{Vaksinasi --r- Kontrol}

Grafik 6. Perbandingan berat (gram)

limpa

antara kelompok vaksinasi dan kontrol

DAFTAR

PUSTAKA

Anonimous. 1990. Pedoman Pengendalian Penyakit Hewan Menular. Direktorat Kesehatan Hewan.

Direktorat Jenderal Peternakan. Departemen Perlanian.

Anonimous.

I99I.

Pedoman Pengkajian Penyakit Gumboro . Balai Pengujian Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan / BPMSOH.

Buletin Pengujian Mutu Obat Hewan No' 91 N@fiMOs

Mazariegos L.

A., Lukert

^{P. D.}

and

Brown J' 1990. Pathogenicity and Immunosupresive Properties

of Infectious Bursal

Disease "

Intermediate Strain

".

Avian Diseases 34:203'

208.

McFerran JB ^et at' ^{1980. Isolation and} Serological Studies of

IBDV in

Fowl' Turkeys and Ducks' Avian PathologY 9:395

-

^404.

PaylaV. 1991. Manual for the Production of Mareks Disease, Gumboro Disease' and Inactivated Newcastle Disease

Vaccine. FAO

Annual Production

&

Health PaPers.

Partadiredja M., Soejoedono R. D., Nurhadayani A. dan Leksmono C. S. 1991. Mempelajari ^Cara Pembuatan Vaksin Gumboro

Inaktif '

^Seminar

Penelitian Dirlitbanmas. Ditjen Dikti'

Depdikbud. ^{Sawangan .} Bogor'

Partadiredja M. and Soejoedono ^R. D' ¹ 997' Cross Protection Study of Chickens Vaccinated with an

Imported IBD

Vaccine Challenged

with

³

Pathogenic IBDV ^{Isolates in} Indonesia. Hemera Zoa

79:22-29.

Rosenberger

J.K.

^{and Cloud S. S. 1986. Antigenic}

and Cross Protection Studies of Infectious Bursal Diseae

Virus

Variants.

NECAD - ^86'

^Univ'

Delware. Newark.

America.

Soedijar

I. L.

^{1989. Response of Japanese} Quail ^to Various Vaccines. Animal Hygiene Department' Agriculture Faculty' ^Tohoku University' ^Japan'

Soejoedono R.

D.

1998. Native Virus ^Challenge

Test Againts Vaccinated Chicken With

Commercial Active and Inactive

IBD

Vaccine' MediaVeteriner ^{5 : 19-23.}

Tanimura

N.

and

Sharma J.

M.

1998. In-situ Apoptosis in Chickens Infected with Infectious Bursal Disease

Virus . J of

Comparative Pathology

ll8

: 15-27.