INTISARI
Bahan alam banyak digunakan masyarakat untuk mengobati penyakit kanker. Salah satunya yaitu daun tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) yang secara luas digunakan masyarakat untuk menghilangkan tumor. Telah dilaporkan pula bahwa tumbuhan ini toksik pada hewan yang memakannya. Sebagai langkah awal untuk mengetahui apakah daun tumbuhan tembelekan mempunyai aktivitas antikanker, maka dilakukan penelitian menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test sehingga didapatkan informasi tentang toksisitas ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan terhadap larva Artemia salina Leach (artemia).
Penelitian ini merupakan eksperimental murni dengan rancangan posttest only control group design. Penelitian dilakukan dengan menggunakan ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan yang diperoleh dengan metode maserasi. Sampel uji dibuat seri konsentrasi yaitu 40, 52, 68, 88, dan 114 μg/ml. Kontrol menggunakan air laut buatan, dan dilakukan replikasi sebanyak 5 kali. Jumlah larva artemia yang mati pada tiap konsentrasi dihitung setelah 24 jam perlakuan. Nilai LC50 dihitung dengan analisis probit. Ekstrak dikatakan toksik apabila harga LC50 < 1000 μg/ml. Ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan kemudian diidentifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung di dalamnya.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan bersifat toksik dengan harga LC50 sebesar 60,4 μg/ml. Identifikasi dengan kromatografi lapis tipis menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan diduga mengandung senyawa golongan triterpenoid dan flavonoid.
Kata kunci : Brine Shrimp Lethality Test, Lantana camara L., Artemia salina Leach., toksisitas
ABSTRACT
Natural substances are often done by people to cure cancer. One of them is by using the tembelekan leaf (Lantana camara L.) that is widely used by people to omit the tumor. It is reported that this plant is toxic for the animal that consume it. As the beginning step to find out whether the tembelekan leaf has an anticancer activity or not, the research is being conducted with the Brine Shrimp Lethality Test method so the information about toxicity of ethanol extract of tembelekan leaf to the Artemia salina Leach larva can be gained.
The research was simple pure experimental with posttest only control group design. The research was done by using an ethanol extract of tembelekan leaf that is gained from maserasi method. The experiment sample is made in concentration series, they are 40, 52, 68, 88, and 114 μg/ml. The controller that is used is artificial sea water and it is replicated 5 times. The number of artemia larva that died in every concentration is counted after 24 hours treatment. The value of LC50 was counted using the probit analysis method. The extract is considered as toxic if the LC50 < 1000 μg/ml. The ethanol extract of tembelekan leaf then identified by the thin layer of chromatography to find out the compound type that is contained inside.
The research findings show that the ethanol extract of tembelekan leaf is toxic with LC50 is 60,4 μg/ml. The identification uses the thin layer of chromatography shows that the ethanol extract of tembelekan leaf is estimated contains the compound type triterpenoid and flavonoid.
Key words: Brine Shrimp LethalityTest, Lantana camara L., Artemia salina Leach, toxicity
BRINE SHRIMP LETHALITY TEST EKSTRAK ETANOL DAUN TUMBUHAN TEMBELEKAN (Lantana camara L.) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPISNYA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Natalia Sugianti
NIM: 038114041
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
BRINE SHRIMP LETHALITY TEST EKSTRAK ETANOL DAUN TUMBUHAN TEMBELEKAN (Lantana camara L.) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPISNYA
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Natalia Sugianti
NIM: 038114041
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2007
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING
Persetujuan skripsi berjudul
BRINE SHRIMP LETHALITY TEST EKSTRAK ETANOL DAUN TUMBUHAN TEMBELEKAN (Lantana camara L.) BESERTA PROFIL KROMATOGRAFI LAPIS TIPISNYA
Yang diajukan oleh: Natalia Sugianti NIM: 038114041
Telah disetujui oleh:
Pembimbing I Pembimbing II
Yustina Sri Hartini, M.Si.,Apt. Yohanes Dwiatmaka, M.Si.
Tanggal: ………. Tanggal: ……….
H
A
L
A
M
A
N
P
E
R
S
E
M
B
A
H
A
N
TUHAN TIDAK BERJANJI
LANGIT SELALU BIRU . . .
BUNGA DI SEPANJANG JALANMU. . .
LAUTAN TANPA GELOMBANG. . .
TAPI . . . IA BERJANJI BESERTA KITA. . .
MENDAMPINGI KITA. . .
DALAM SEGALA KEADAAN!!!
Kupersembahkan karya kecilku ini teruntuk:
JESUS- MY SAVIOR
Bunda MARIA
P a p a
dan
Ma ma
tercinta
Dhe- dhe ku imoet
“
Dev i
”
OH A L U N GSahabatku
Lanny
, Indah,
Renny
,
Nike
,
Yoha
A l m a m a t e r k u
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis haturkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah
melimpahkan rahmat dan berkatnya untuk menyelesaikan penelitian dan penulisan
skripsi yang berjudul Brine Shrimp Lethality Test Ekstrak Etanol Daun Tumbuhan
Tembelekan (Lantana camara L.) Beserta Profil Kromatografi Lapis Tipisnya.
Penelitian ini dilakukan untuk memenuhi salah satu syarat tugas akhir untuk
mencapai gelar sarjana ilmu Farmasi bidang studi Farmasi Universitas Sanata
Dharma Yogyakarta.
Penulis telah banyak mendapat bantuan baik moral maupun spiritual dan
dukungan yang berupa bimbingan, dorongan, sarana, maupun fasilitas dari berbagai
pihak dalam penulisan skripsi ini, oleh karena itu penulis ingin mengucapkan terima
kasih kepada:
1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing atas bimbingan
dan pengarahan selama penelitian sampai penyusunan skripsi.
3. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen pembimbing atas bimbingan
dan pengarahan selama penelitian sampai penyusunan skripsi.
4. Ibu dr. Luciana Kuswibawati, M. Kes. selaku dosen penguji yang telah
memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.
5. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah
memberikan masukan dan saran dalam penyusunan skripsi ini.
6. Papa dan Mama serta adikku Devi atas cinta, pengorbanan, dukungan,
semangat, dan doa nya yang tak pernah berhenti.
7. Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Sarwanto selaku staf laboratorium
Farmakognosi Fitokimia . Terima kasih atas bantuan yang diberikan.
8. Lanny, sahabat dalam berbagi suka dan duka.
9. Indah, Renny, Nike, Yohana, ci Meta, ci Listy, ci Ricka, ci Maria, Chicka,
Selvi, Aning, Ratih, dan teman-teman kost DEWI lainnya. Terima kasih atas
kebersamaan dan kekompakkannya selama ini.
10. Mas Wondo, Novi, Apri, Rosa, Mba Sinta. Terima kasih atas kerja sama dan
bantuannya selama penelitian.
11. Teman-teman angkatan 2003, khususnya kelas A. Terima kasih atas
kebersamaan dan kerja samanya selama ini.
12. Teman-teman BPM, khususnya PD Missio Dei dan PD Ignatius Loyola,
Meidi, Yandy, Iyonk, Ko Hendy, dan Ko Ari. Terima kasih atas dukungan
doanya.
13. Pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh penulis.
Penulis menyadari masih ada kekurangan dalam penyusunan skripsi ini,
maka penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari berbagai
pihak demi kemajuan dan kesempurnaan penelitian yang telah dilakukan. Semoga
skripsi ini memberikan manfaat bagi kita semua.
Yogyakarta, 25 Januari 2007
Penulis
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ... ii
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii
HALAMAN PENGESAHAN... iv
HALAMAN PERSEMBAHAN ... v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... vi
KATA PENGANTAR ... vii
DAFTAR ISI... ix
DAFTAR TABEL... xiii
DAFTAR GAMBAR ... xiv
DAFTAR LAMPIRAN... xv
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG ... xvi
INTISARI... xvii
ABSTRACT ... xviii
BAB I. PENGANTAR ... 1
A. Latar Belakang ... 1
1. Perumusan masalah... 3
2. Keaslian penelitian ... 3
3. Manfaat penelitian... 4
B. Tujuan Penelitian ... 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA... 5
A. Tumbuhan Tembelekan... 5
1. Keterangan botani ... 5
2. Nama daerah dan nama asing... 5
3. Deskripsi tumbuhan ... 6
4. Kandungan kimia ... 6
5. Kegunaan ... 6
B. Senyawa Yang Diidentifikasi... 7
1. Triterpenoid... 7
2. Flavonoid ... 9
C. Artemia... 11
1. Keterangan zoologi ... 11
2. Morfologi artemia ... 12
3. Lingkungan hidup artemia ... 16
4. Siklus hidup artemia... 17
5. Penggunaan artemia pada metode BST... 19
D. Uji Toksisitas Akut ... 22
E. Brine Shrimp Lethality Test ... 23
F. Kanker ... 24
G. Penyarian... 26
H. Kromatografi Lapis Tipis... 27
I. Landasan Teori... 29
J. Hipotesis... 30
BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ... 31
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 31
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ... 31
1. Variabel penelitian ... 31
2. Definisi operasional ... 32
C. Bahan dan Alat Penelitian... 32
1. Bahan penelitian... 32
2. Alat penelitian ... 33
D. Tata Cara Penelitian ... 34
1. Determinasi tumbuhan tembelekan... 34
2. Pengumpulan bahan ... 34
3. Penyiapan bahan ... 34
4. Maserasi ... 34
5. Pembuatan air laut buatan ... 35
6. Penetasan telur artemia ... 35
7. Penyiapan sampel untuk uji toksisitas ... 36
8. Pembuatan larutan sampel... 36
9. Uji toksisitas akut dengan BST ... 37
10.Uji KLT pada ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan... 37
11.Analisis hasil ... 38
BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ... 39
A. Determinasi Tumbuhan... 39
B. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan... 39
C. Maserasi Daun Tumbuhan Tembelekan... 41
D. Pembuatan Air Laut Buatan ... 43
E. Penetasan Siste Artemia ... 44
F. Uji Toksisitas dengan Metode BST ... 45
G. Uji Kualitatif Ekstrak Etanol dengan KLT ... 53
1. Identifikasi triterpenoid... 54
2. Identifikasi flavonoid ... 57
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN... 61
A. Kesimpulan ... 61
B. Saran... 61
DAFTAR PUSTAKA ... 62
LAMPIRAN... 66
BIOGRAFI PENULIS ... 83
DAFTAR TABEL
Tabel I Perbedaan uji toksisitas akut, uji toksisitas sub kronis dan uji
toksisitas kronis... 23
Tabel II Seri konsentrasi larutan sampel daun tumbuhan tembelekan ... 36
Tabel III Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak etanol
daun tumbuhan tembelekan ... 49
Tabel IV Hasil KLT pemeriksaan triterpenoid dalam ekstrak etanol daun
tumbuhan tembelekan ... 55
Tabel V Hasil KLT pemeriksaan flavonoid dalam ekstrak etanol daun
tumbuhan tembelekan ... 58
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Struktur pentasiklik triterpenoid ...7
Gambar 2. Mekanisme penghambatan enzim topoisomerase...8
Gambar 3. Struktur umum flavonoid ...9
Gambar 4. Mekanisme kematian sel yang terprogram (apoptosis) pada sel normal (A) dan sel tumor yang kekurangan p53 menyebabkan kanker (B) ...10
Gambar 5. Larva artemia ...13
Gambar 6. Perubahan bentuk artemia ...13
Gambar 7. Bagian-bagian tubuh artemia dewasa ...14
Gambar 8. Artemia dewasa jantan dan betina ... 15
Gambar 9. Siklus hidup artemia biseksual ...18
Gambar 10. Kerja RNA polymerase dalam transkripsi ...20
Gambar 11. Mekanisme kerja Na+and K+ ATP ase ...21
Gambar 12. Siklus sel ...25
Gambar 13. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan ...50
Gambar 14. Kromatogram ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan untuk pemeriksaan triterpenoid dengan jarak pengembangan 10 cm ...56
Gambar 15. Kromatogram ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan untuk pemeriksaan flavonoid dengan jarak pengembangan 10 cm ...59
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat keterangan determinasi tumbuhan tembelekan ...66
Lampiran 2. Foto tumbuhan tembelekan ...67
Lampiran 3. Foto aquarium untuk uji BST ...67
Lampiran 4. Orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi yang akan
digunakan dalam pengujian ...68
Lampiran 5. Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak etanol
daun tumbuhan tembelekan ...73
Lampiran 6. Perhitungan data statistik SPSS 10.00 dengan analisis probit
terhadap ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan ...74
Lampiran 7. Foto kromatogram identifikasi triterpenoid ...77
Lampiran 8. Jurnal penggunaan uji Brine Shrimp Lethality Test...78
DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG
6. KLT = Kromatografi Lapis Tipis
7. LC50 = Median Lethal Concentration
8. LD50 = Median Lethal Dose
9. mm = millimeter
10.mg = milligram
11.MgCl2 = magnesium klorida
12.MgSO4 = magnesium sulfat
INTISARI
Bahan alam banyak digunakan masyarakat untuk mengobati penyakit
kanker. Salah satunya yaitu daun tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) yang
secara luas digunakan masyarakat untuk menghilangkan tumor. Telah dilaporkan pula bahwa tumbuhan ini toksik pada hewan yang memakannya. Sebagai langkah awal untuk mengetahui apakah daun tumbuhan tembelekan mempunyai aktivitas
antikanker, maka dilakukan penelitian menggunakan metode Brine Shrimp Lethality
Test sehingga didapatkan informasi tentang toksisitas ekstrak etanol daun tumbuhan
tembelekan terhadap larva Artemia salina Leach (artemia).
Penelitian ini merupakan eksperimental murni dengan rancangan posttest
only control group design. Penelitian dilakukan dengan menggunakan ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan yang diperoleh dengan metode maserasi. Sampel uji
dibuat seri konsentrasi yaitu 40, 52, 68, 88, dan 114 μg/ml. Kontrol menggunakan air
laut buatan, dan dilakukan replikasi sebanyak 5 kali. Jumlah larva artemia yang mati
pada tiap konsentrasi dihitung setelah 24 jam perlakuan. Nilai LC50 dihitung dengan
analisis probit. Ekstrak dikatakan toksik apabila harga LC50 < 1000 μg/ml. Ekstrak
etanol daun tumbuhan tembelekan kemudian diidentifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis untuk mengetahui golongan senyawa yang terkandung di dalamnya.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun tumbuhan
tembelekan bersifat toksik dengan harga LC50 sebesar 60,4 μg/ml. Identifikasi
dengan kromatografi lapis tipis menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan diduga mengandung senyawa golongan triterpenoid dan flavonoid.
Kata kunci : Brine Shrimp Lethality Test, Lantana camara L., Artemia salina
Leach., toksisitas
ABSTRACT
Natural substances are often done by people to cure cancer. One of them is
by using the tembelekan leaf (Lantana camara L.) that is widely used by people to
omit the tumor. It is reported that this plant is toxic for the animal that consume it. As the beginning step to find out whether the tembelekan leaf has an anticancer activity
or not, the research is being conducted with the Brine Shrimp Lethality Test method
so the information about toxicity of ethanol extract of tembelekan leaf to the Artemia
salina Leach larva can be gained.
The research was simple pure experimental with posttest only control group design. The research was done by using an ethanol extract of tembelekan leaf that is gained from maserasi method. The experiment sample is made in concentration
series, they are 40, 52, 68, 88, and 114 μg/ml. The controller that is used is artificial
sea water and it is replicated 5 times. The number of artemia larva that died in every
concentration is counted after 24 hours treatment. The value of LC50 was counted
using the probit analysis method. The extract is considered as toxic if the LC50 <
1000 μg/ml. The ethanol extract of tembelekan leaf then identified by the thin layer
of chromatography to find out the compound type that is contained inside.
The research findings show that the ethanol extract of tembelekan leaf is
toxic with LC50 is 60,4 μg/ml. The identification uses the thin layer of
chromatography shows that the ethanol extract of tembelekan leaf is estimated contains the compound type triterpenoid and flavonoid.
Key words: Brine Shrimp LethalityTest, Lantana camara L., Artemia salina Leach,
toxicity
BAB I PENGANTAR
A. Latar Belakang
Penyakit kanker dikenal sebagai penyakit yang sukar disembuhkan dan
dapat menyebabkan kematian penderitanya jika tidak dirawat sejak awal. Kasus
kanker di Indonesia dari tahun ke tahun menunjukkan peningkatan. Walaupun telah
banyak ditemukan obat antikanker dan telah banyak dilakukan kemoterapi, namun
hasilnya belum memuaskan dan biayanya juga sangat mahal. Hal inilah yang
mendorong masyarakat untuk melakukan pengobatan menggunakan bahan alam atau
obat tradisional (Mills and Bone, 2000).
Penggalian obat-obat antikanker dari bahan alam terus dilakukan. Salah
satunya yaitu daun tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) yang secara luas
digunakan untuk pengobatan tumor, tetanus, rematik, malaria, sebagai antiseptik, dan
perangsang muntah (Rana, Prasad, and Blazquez, 2005). Untuk menghilangkan
bengkak, biasanya daun tumbuhan tembelekan dihaluskan lalu ditempel pada bagian
yang sakit (Hembing, 2000). Daun tumbuhan tembelekan mengandung beberapa
senyawa antara lain lantadene A dan B, lantanolic acid, lantic acid, humulene
(mengandung minyak atsiri), -caryophyllene, -terpidene, α-pinene, dan p-cymene
(Rana, 2005).
Tembelekan merupakan spesies tumbuhan yang toksik pada binatang yang
memakan daunnya (Sharma and Sharma, 1989). Beberapa ahli menghubungkan
toksisitas tumbuhan tembelekan dengan dua pentasiklik triterpenoid yaitu lantadene
A dan B (Tyler, Brady, and Robbers, 1988). Senyawa flavonoid dalam daun
tumbuhan tembelekan yaitu jenis flavon juga diketahui bersifat toksik pada sel
dengan menginduksi apoptosis, yang merupakan suatu mekanisme kematian sel yang
terprogram (Middleton, Kandaswami, and Theoharides, 2000). Dari penelitian yang
telah dilakukan oleh Asterina (1994), diketahui bahwa ekstrak etanol 95% daun
tumbuhan tembelekan mengandung senyawa flavonoid.
Etanol dapat melarutkan flavonoid (Anonim, 1986) serta sebagian besar
senyawa terpenoid (Mursyidi, 1990). Maka dalam penelitian ini digunakan ekstrak
etanol daun tumbuhan tembelekan.
Pencarian senyawa antikanker baru dari tanaman dapat dilakukan pertama
kali dengan cara skrining bioaktivitas dengan metode Brine Shrimp Lethality Test
(BST). Prinsip metode ini adalah uji toksisitas akut terhadap larva Artemia salina
Leach (artemia) dengan penentuan nilai LC50 setelah perlakuan 24 jam (Meyer,
Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nichols, and Laughlin, 1982). Digunakan artemia
sebagai hewan uji karena artemia memiliki kesamaan tanggapan dengan mamalia,
misalnya tipe DNA-dependent RNA polymerases artemia serupa dengan yang
terdapat dalam mamalia dan organisme ini memiliki ouabaine-sensitive Na+ and K+
dependent ATPase, sehingga senyawa maupun ekstrak yang memiliki aktivitas pada
sistem tersebut dapat terdeteksi (Solis, Wright, Anderson, Gupta, and Phillipson,
1993). Jika suatu larutan memiliki nilai LC50 < 1000 μg/ml maka larutan tersebut
memiliki efek toksik yang besar yang nantinya diharapkan memiliki efek sitotoksik,
3
Metode BST tidak spesifik untuk pengujian antikanker dan sebagian aksi
fisiologis, namun metode ini dapat memonitor kemungkinan adanya efek sitotoksik
dengan waktu dan biaya penelitian yang lebih sedikit dibandingkan dengan
pengujian sitotoksisitas menggunakan biakan sel kanker. Senyawa yang bersifat
toksik pada uji BST belum tentu bersifat sitotoksik, sehingga perlu dilakukan uji
tingkat lanjut dengan menggunakan sel kanker. Namun, suatu senyawa yang bersifat
sitotoksik akan bersifat toksik bila diuji dengan metode BST (Meyer et al., 1982).
Maka diharapkan metode BST dapat digunakan sebagai langkah awal untuk
menentukan senyawa yang memiliki efek sitotoksik.
1. Perumusan masalah
Apakah ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan bersifat toksik terhadap
larva artemia?
2. Keaslian penelitian
Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya dengan menggunakan daun
tumbuhan tembelekan antara lain isolasi dan identifikasi komponen kimia daun
tembelekan asal Tamalanrea, Ujung Pandang oleh Aida (1990); penelitian
farmakognosi dan kandungan kimia dari daun Lantana camara L. oleh Soelastru
(1986); pemeriksaan flavonoid dan verbaskosid daun Lantana camara L. oleh Rini
Asterina (1994); dan uji potensi antibakteri ekstrak etanol daun tembelekan terhadap
Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Escherichia coli ATCC 35218 oleh Asteria
(2006). Tetapi sejauh penelusuran pustaka belum pernah dilakukan penelitian
mengenai toksisitas ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan terhadap larva
3. Manfaat penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi yang lebih jelas,
yang berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan terutama dalam bidang farmasi
mengenai toksisitas ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan terhadap larva artemia.
B. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang ada, maka penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui toksisitas ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Tumbuhan Tembelekan 1. Keterangan botani
Tumbuhan tembelekan (Lantana camara L.) termasuk dalam familia
Verbenaceae. Tumbuhan ini mempunyai sinonim antara lain Lantana aculeata L.,
Lantana antillana Rafin., Lantana mutabilis Salisb., Lantana polyacanthus SCH.,
Lantana scabrida Soland (Becker and Bakhuizen, 1963).
2. Nama daerah dan nama asing a. Nama daerah
1) Sumatera : tembelekan, kembang telek, bunga pagar, kayu singapur, tahi ayam
2) Jawa : kembang telek, oblo, puyengan, pucengan, tembelek, tembelekan,
teterapan, waung, wilweran
3) Sunda : kembang satek, saliyara, saliyare, tahi hayam, tahi kotok, cente
4) Madura : kamanco, mainco, tamanjho
(Hembing, 2000)
b. Nama asing
1) Cina : wu se mei, ma ting tan
2) Tagalog: sapinit, koronitas, kantutay
3) Inggris : prickly lantana, hedge flower
(Dalimarta, 1999)
3. Deskripsi tumbuhan
Tembelekan kadang tumbuh liar atau ditanam sebagai tanaman hias dan
tanaman pagar. Tumbuhan asal Amerika tropis ini bisa ditemukan dari dataran
rendah sampai 1.700 meter di atas permukaan laut, pada tempat-tempat terbuka yang
terkena sinar matahari atau agak ternaung. Perdu, tegak, atau agak memanjat, tinggi
0,5-4 m, berbau. Batang berkayu, bercabang banyak, ranting bentuk segi empat,
berduri, berambut. Daun tunggal, berhadapan, bundar telur, ujung runcing, pangkal
tumpul, tepi bergerigi, pertulangan menyirip, kedua permukaan berambut, perabaan
kasar, panjang 5-8 cm, lebar 3,5-5 cm, warnanya hijau tua. Perbungaan majemuk
berbentuk bulir, mahkota bagian dalam berambut, warnanya putih, merah muda,
jingga, kuning, dan sebagainya. Buah buni, tangkai berambut, masih muda hijau, bila
masak hitam mengkilap (Dalimartha, 1999).
4. Kandungan kimia
Daun mengandung lantadene A (0,31-0,68%), lantadene B (0,2%),
lantanolic acid, lantic acid, humulene (mengandung minyak menguap 0,16-0,2 %),
caryophyllene, terpidene, α pinene, p-cymene (Rana, 2005) dan flavonoid
(Asterina ,1994).
5. Kegunaan
Akar berkhasiat mengatasi influenza yang disertai demam tinggi, TBC
kelenjar (skrofuloderma), rematik, bengkak terbentur (memar), keputihan (leukorea),
kencing nanah (gonore), gondongan (parotitis, mumps), dan sakit kulit yang
berkaitan dengan gangguan emosi (neurodermatitis). Bunga berkhasiat mengatasi TB
7
untuk pengobatan tumor, tetanus, rematik, malaria, sebagai antiseptik, dan
perangsang muntah (Rana, 2005).
B. Senyawa yang Diidentifikasi 1. Triterpenoid
Terpenoid berasal dari molekul isoprene CH2=C(CH3)-CH=CH2. Terpenoid
terdiri atas beberapa macam senyawa mulai dari komponen minyak atsiri yaitu
monoterpenoid dan sesquiterpenoid yang mudah menguap sampai ke senyawa yang
tidak mudah menguap yaitu triterpenoid dan sterol (C30) serta pigmen karotenoid
(C40) (Harborne, 1984). Terpenoid tersebar luas dalam damar, getah, dan kutin
tumbuhan (Robbers, Speedie, Tyler, 1996).
HO
Gambar 1. Struktur pentasiklik triterpenoid (Kaufman, Cseke , Warbers, Duke, Brielmann, 1988)
Triterpenoid secara biosintesis terbentuk dari 6 unit isoprene sehingga
triterpenoid merupakan suatu terpenoid dengan 30 atom C. Triterpenoid di alam
dapat berbentuk ester atau glikosida dan kemungkinan berstruktur alifatik, tetrasiklik
atau pentasiklik. Triterpenoid saponin biasanya dalam bentuk pentasiklik. Senyawa
serta asam turunannya yaitu asam ursolat dan asam oleanolat (Evans and Trease,
2002). Pentasiklik triterpenoid dapat menghambat kerja enzim topoisomerase I dan II
serta menghambat RNA polymerase sehingga mengakibatkan kematian sel (Lee,
Fang, Wang, Li, Cook, 1991).
Gambar 2 . Mekanisme penghambatan enzim topoisomerase (Albert, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter, 2002)
Untuk mendeteksi adanya triterpenoid salah satunya dapat dilakukan
dengan metode kromatografi lapis tipis. Metode ini dapat menggunakan fase diam
silika gel dan dengan memakai pengembang seperti heksan, etil asetat (1:1);
9
digunakan penyemprotan dengan asam sulfat pekat, diteruskan dengan pemanasan
pada 100°C - 105°C sampai pembentukan warna sempurna (Harborne, 1984). Untuk
senyawa terpenoid, akan menghasilkan warna abu-abu, merah violet atau ungu
(Wagner, Brady, and Zgainski, 1984).
2. Flavonoid
Flavonoid adalah senyawa fenol alam yang terdapat dalam hampir semua
tumbuhan dari bangsa Algae hingga Gymnospermae. Di dalam tumbuhan flavonoid
biasanya berikatan dengan gula sebagai glikosida (Mursyidi, 1990). Glikosida
flavonoid merupakan senyawa polar, maka umumnya cukup larut dalam pelarut yang
polar anatara lain seperti etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dan air
(Markham, 1988).
Gambar 3. Struktur umum flavonoid (Harborne, 1984)
Flavonoid terdapat pada hampir semua bagian tanaman seperti daun, bunga,
tepung sari, akar dan batang. Secara khusus flavonoid terutama terdapat pada bagian
yang di atas tanah dan masih muda misalnya daun, pucuk-pucuk yang berbunga;
yang terlokalisasi dalam jaringan epidermis dan sel palisade (Markham, 1988).
Flavonoid berfungsi untuk pengaturan tumbuh, pengaturan fotosintesis, kerja
antimikroba, antivirus, dan kerja terhadap serangga (Robinson, 1991). Flavonoid
kematian yang terprogram) pada sel kanker salah satunya dengan mencegah
terjadinya mutasi p53. Dengan adanya apoptosis, sel yang telah rusak (abnormal) dan
tidak berfungsi lagi akan mati dengan sendirinya, tidak terus menerus membelah dan
menghasilkan sel neoplastik yang dapat berkembang menjadi sel tumor dan kanker
(Middleton, 2000).
Gambar 4. Mekanisme kematian sel yang terprogram (apoptosis) pada sel normal (A) dan sel tumor yang kekurangan p53 menyebabkan kanker (B)
(Albert et al., 2002)
Adanya senyawa flavonoid dalam suatu bahan dapat dianalisis dengan
kromatografi lapis tipis. Biasanya digunakan fase diam selulosa dan fase gerak
seperti n-butanol, asam asetat, air (4:1:5 v/v lapisan atas); kloroform, etil asetat
11
bercak yang timbul setelah pengembangan dapat menggunakan sinar UV, pereaksi
semprot seperti sitroborat, pereaksi aluminium klorida, dan antimon triklorida
(Wagner et al.,1984).
Flavonoid pada sinar UV 254 nm menyebabkan terjadinya pemadaman dan
pada sinar UV 366 nm memberikan warna kuning, biru, atau ungu yang tergantung
pada struktur flavonoidnya (Markham, 1988).
Pedoman umum flouresensi flavonoid di bawah UV 366 nm menurut
Marhkam (1988) adalah
a. pada sinar UV tanpa NH3 berfluoresensi biru muda, dan dengan NH3
berfluoresensi hijau-kuning, kemungkinan merupakan flavonoid jenis flavon atau
flavonol yang tidak mengandung 5-OH
b. pada sinar UV tanpa NH3 berfluoresensi biru muda, dan dengan NH3 nampak
perubahan sedikit warna atau tanpa perubahan, mungkin merupakan flavonoid
jenis isoflavon yang tidak mengandung 5-OH bebas
c. pada sinar UV tanpa NH3 berfluoresensi biru muda, dan dengan NH3
berfluoresensi murup biru muda, kemungkinan merupakan flavonoid jenis
isoflavon yang tidak mengandung 5-OH bebas
C. Artemia 1. Keterangan zoologi
Artemia termasuk dalam familia Artemidae. Artemia merupakan
udang-udangan tingkat rendah yang hidup sebagai zooplankton, yang menghuni
lakunya menunjukkan bahwa artemia tidak mempunyai alat atau cara untuk
mempertahankan diri terhadap serangan musuh-musuhnya. Penyesuaian hidupnya di
perairan berkadar garam tinggi merupakan suatu perlindungan alam sehingga mereka
bebas dari pemangsanya. Karena di perairan yang demikian, para pemangsanya (ikan,
udang, serangga, dan lainnya) sudah tidak dapat hidup lagi (Mudjiman, 1989).
2. Morfologi artemia
a. Telur
Istilah untuk telur artemia yang benar adalah siste, yaitu telur yang telah
berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian diselubungi oleh
cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi embrio
terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultraviolet dan
mempermudah pengapungan. Oleh karena itu, ia sangat tahan menghadapi
keadaan lingkungan yang buruk (Mudjiman, 1989).
b. Larva
Apabila siste artemia direndam dalam air laut bersuhu 25°C, maka akan
menetes dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah burayak
(larva) yang juga dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan
selanjutnya, larva akan mengalami 15 kali perubahan bentuk atau metamorfosis.
Setiap kali larva mengalami perubahan bentuk merupakan satu tingkatan. Larva
tingkat I dinamakan instar I, tingkat II dinamakan instar II, tingkat III dinamakan
instar III, demikian seterusnya samapi instar XV. Setelah itu berubahlah menjadi
13
Gambar 5. Larva artemia (Mudjiman, 1989)
Larva yang baru saja menetas masih dalam tingkatan instar I. Warnanya
kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan. Oleh
karena itu mereka masih belum perlu makan. Anggota badannya terdiri dari
sepasang sungut kecil (antenula atau antena I) dan sepasang sungut besar (antena
atau antena II). Di bagian depan di antara kedua sungut kecilnya terdapat bintik
merah, yaitu mata larva (oselus). Di belakang sungut besar terdapat sepasang
mandibulata (rahang) yang kecil, sedangkan di bagian perut (ventral) terdapat
labrum.
Sekitar 24 jam setelah menetas, larva akan berubah menjadi instar II. Pada
tingkatan instar II, larva sudah mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan dan
dubur. Oleh karena itu mereka mulai mencari makanan. Bersamaan dengan itu,
cadangan makanannya juga sudah mulai habis. Pengumpulan makanannya
mereka lakukan dengan menggerak-gerakkan antena II nya. Selain untuk
mengumpulkan makanan, antena II tersebut juga berguna untuk bergerak.
Pada tingkatan selanjutnya mulai terbentuk sepasang mata majemuk, selain
itu berangsur-angsur tumbuh tunas-tunas kakinya. Setelah menjadi instar XV,
kakinya sudah lengkap sebanyak 11 pasang, maka berakhirlah masa larva, dan
berubah menjadi artemia dewasa.
15
c. Artemia dewasa
Artemia dewasa bentuknya telah sempurna dan menyerupai udang kecil
dengan ukuran panjang sekitar 1 cm, dengan kaki yang sudah lengkap sebanyak
11 pasang yang secara khusus disebut torakopoda. Baik pada yang jantan
maupun yang betina, antena I nya (antenula) tetap saja sebagai sungut, yang
fungsinya sebagai alat peraba. Pada artemia jantan, antena II berubah menjadi
alat penjepit yang membesar dan berotot yang kegunaannya untuk berpegangan
pada betina pada waktu menjelang perkawinan. Pada betina, antena II-nya
mengalami penyusutan yang akhirnya berubah menjadi alat peraba. Di belakang
kaki torakopoda yang jantan terdapat sepasang alat kelamin luarnya (penis),
sedangkan pada yang betina terdapat sepasang indung telur (ovarium) yang
terletak di sebelah kanan dan kiri saluran pencernaan.
3. Lingkungan hidup artemia
Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6° C atau lebih
dari 35° C, tetapi hal ini sangat tergantung pada ras dan kebiasaan tempat hidup
mereka. Pertumbuhan artemia yang baik berkisar pada suhu antara 25°C -30°C. Daya
tahan artemia terhadap perubahan kandungan ion-ion kimia dalam air ternyata juga
sangat tinggi. Apabila kandungan ion natrium dibandingkan dengan ion kalium di
dalam air laut alami adalah 28, maka artemia masih dapat bertahan pada
perbandingan antara 8-173 (Mudjiman, 1989).
Untuk perkembangan artemia yang baik, mereka membutuhkan kadar
garam air yang tinggi sebab pada kadar garam yang tinggi itu musuh-musuhnya
sudah tidak dapat hidup lagi, sehingga mereka akan dapat hidup lebih aman tanpa
gangguan. Untuk pertumbuhan telur, ternyata dibutuhkan air yang kadar garamnya
lebih rendah dari pada suatu batas tetentu. Batas ini berlainan untuk setiap jenis
artemia. Secara umum, apabila kadar garam air lebih tinggi dari 85 permil, maka
telur tidak akan dapat menetas karena tekanan osmosis di luar telur lebih tinggi
sehingga telur tidak dapat menyerap air yang cukup untuk proses metabolismenya
yang semula berada dalam keadaan diapauze. (Mudjiman, 1989).
Artemia dapat hidup dan menyesuaikan diri pada tempat yang kadar
oksigennya rendah atau mengalami kejenuhan oksigen. Pengaruh pH terhadap
kehidupan artemia muda dan dewasa belum jelas namun berpengaruh terhadap
penetasan siste. Apabila pH untuk penetasan kurang dari 8, maka efisiensi penetasan
akan menurun. Siste banyak yang tidak menetas atau waktu penetasan lebih panjang
17
4. Siklus hidup artemia
Ditinjau dari segi cara berkembang biaknya, ada 2 jenis artemia yaitu jenis
biseksual dan partenogenesis. Jenis biseksual tidak dapat berkembangbiak secara
partenogenesis, demikian pula sebaliknya. Baik pada perkembangbiakan biseksual
maupun partenogenesis, keduanya dapat terjadi secara ovovivipar maupun ovipar
(Mudjiman, 1991).
Pada ovovivipar yang keluar dari induknya sudah berupa anak atau larva
yang dinamakan nauplius, jadi sudah langsung hidup sebagai artemia muda. Pada
cara ovipar yang keluar dari induknya berupa telur bercangkang tebal yang disebut
siste. Untuk menjadi nauplius harus melalui proses penetasan lebih dahulu
(Mudjiman, 1991).
Setelah sel telur masak menjadi oosit, dikeluarkan dari indung telur
kemudian masuk ke dalam saluran telur (oviduct). Di dalam kantung telur ini pada
perkembangbiakan secara biseksual perlu dibuahi lebih dahulu oleh sel kelamin
jantan (spermatozoid) agar dapat berkembang lebih lanjut. Namun pada
perkembangbiakan secara partenogenesis, pembuahan ini tidak diperlukan karena
telur dapat berkembang lebih lanjut dengan sendirinya (Mudjiman, 1991).
Sel telur yang telah dibuahi di dalam uterus akan berkembangbiak lebih
lanjut menjadi embrio melalui tingkatan blastula dan gastrula. Dalam keadaan
lingkungan yang baik, gastrula akan berkembang lebih lanjut hingga menjadi larva
yang akhirnya dikeluarkan dari tubuh induknya. Apabila keadaan lingkungannya
buruk, perkembangannya berhenti sampai tingkat gastrula. Gastrula ini akan
dihasilkan oleh kelenjar cangkang telur. Setelah itu barulah mereka dikeluarkan dari
tubuh induknya berupa telur yang berbutir-butir (Mudjiman, 1991).
Proses pembentukan cangkang telur dimulai dengan memburuknya keadaan
lingkungan terutama kadar oksigennya yang rendah. Pada lingkungan dengan kadar
oksigen yang rendah ini artemia akan kesulitan bernafas. Oleh karena itu untuk
mengatasinya dibentuklah hemoglobin di dalam darahnya. (Mudjiman, 1991).
Artemia dapat hidup sampai 6 bulan. Sementara itu setiap 4-5 hari sekali
mereka dapat beranak (pada lingkungan yang baik) atau bertelur (pada lingkungan
yang buruk) sebanyak 50-300 ekor atau butir. Anak artemia sudah menjadi dewasa
dalam waktu 14 hari (Mudjiman, 1991).
19
5. Penggunaan artemia pada metode BST
Artemia secara luas telah digunakan untuk pengujian aktivitas farmakologi
ekstrak suatu tanaman. Artemia juga merupakan hewan uji yang digunakan untuk
praskrining aktivitas antikanker di National Cancer Institude (NCI), Amerika Serikat.
Uji BST dengan hewan uji artemia dapat digunakan untuk skrining awal terhadap
senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor karena uji ini
mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai antitumor meskipun
penggunaan artemia ini memang tidak spesifik untuk antitumor maupun fisiologis
aktif tertentu (Anderson, Goets, and Laughin, 1991).
Artemia dapat digunakan sebagai hewan uji karena artemia memiliki
kesamaan tanggapan dengan mamalia, misalnya tipe DNA-dependent RNA
polymerases yang terdapat pada artemia serupa dengan yang terdapat pada mamalia
dan organisme ini juga memiliki ouabaine-sensitive Na+ and K+ dependent ATPase
(Solis et al., 1992).
DNA-dependent RNA polymerases merupakan DNA yang mengarahkan
proses transkripsi RNA yang bergantung pada RNA polymerases. Enzim ini
membuka pilinan kedua untai DNA sehingga terpisah dan mengkaitkannya
bersama-sama nulkeotida RNA pada saat nukleotida-nukleotida ini membentuk pasangan-basa
di sepanjang cetakan DNA. Eukariotik mempunyai 3 macam RNA polymerases yaitu
mRNA (messenger RNA) yang merupakan pembawa kode genetik dari DNA ke
ribosom, tRNA (transfer RNA) yang berfungsi untuk menterjemahkan kodon dan
mengikat asam amino yang akan disusun menjadi protein dan mengangkutnya ke
ribosom. Jika RNA polymerases tersebut dihambat, maka DNA tidak dapat
mensintesis RNA dan RNA tidak dapat terbentuk sehingga sintesis protein juga
dihambat. Protein merupakan komponen utama semua sel. Protein berfungsi sebagai
unsur struktural, hormon, imunoglobulin, serta terlibat dalam kegiatan transport
oksigen, kontraksi otot, dan lainnya (Nuswantari, 1998). Tidak terbentuknya protein
dapat mengganggu metabolisme sel, sehingga pada akhirnya akan menyebabkan
kematian sel.
Gambar 10. Kerja RNA polymerase dalam transkripsi (Michael, 2007)
Artemia juga memiliki ouabaine-sensitive Na+ and K+ dependent ATPase.
Na+ K+ ATPase merupakan enzim yang mengkatalisis hidrolisis ATP menjadi ADP
serta menggunakan energi untuk mengeluarkan 3 Na+ dari sel dan mengambil 2 K+
ke dalam, tiap sel bagi tiap mol ATP dihidrolisis. Na+ K+ ATPase ditemukan dalam
semua bagian tubuh. Aktivitas enzim ini dihambat oleh ouabaine. Adanya ouabaine
menyebabkan keseimbangan ion Na+ dan K+ tetap terjaga (homeostasis). Selain itu,
sekarang ini ouabaine juga digunakan untuk terapi payah jantung. Di dalam jantung,
Na+ K+ ATPase secara tak langsung mempengaruhi transport Ca2+ karena Na+
21
maka lebih sedikit Ca2+ intrasel dikeluarkan dan Ca2+ intrasel meningkat, sehingga
memudahkan kontraksi otot jantung (Ganong, 1995).
Gambar 11. Mekanisme kerja Na+and K+ ATP ase (Michael, 2007)
Jika suatu senyawa bekerja mengganggu kerja salah satu enzim ini pada
artemia dan menyebabkan kematian artemia, maka senyawa tersebut bersifat toksik
dan dapat menyebabkan kematian sel mamalia. Metode BST dengan hewan uji
artemia tidak dapat digunakan untuk pengujian senyawa yang dalam mengganggu
kerja salah satu enzim tersebut memerlukan aktivasi dalam sel mamalia, seperti
6-mercaptopurine yang harus dimetabolisme terlebih dahulu dalam sel mamalia.
Sehingga jika senyawa 6-mercaptopurine diujikan pada artemia, maka akan
memberikan LC50 yang lebih besar dari 1000 (bersifat tidak toksik pada artemia)
(Solis et al.,1992).
Keuntungan penggunaan artemia sebagai hewan uji adalah kesederhanaan
dalam pelaksanaan, waktu relatif singkat, dan konsentrasi kecil sudah dapat
D. Uji Toksisitas Akut
Toksisitas merupakan sifat relatif toksikan berkaitan dengan potensinya
mengakibatkan efek negatif bagi makhluk hidup. Toksisitas juga dapat diartikan
sebagai kualitas bersifat racun, khususnya derajad virulensi mikroba toksik atau
racun (Nuswantari, 1998). Toksisitas dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain
komposisi dan jenis toksikan, konsentrasi toksikan, durasi dan frekuensi pemaparan.
Toksikan dapat menghasilkan efek negatif bagi semua atau sebagian dari tingkat
organisasi biologis (populasi, individu, organ, jaringan, sel, biomolekul) dalam
bentuk merusak struktur maupun fungsi biologis, baik secara akut, sub kronis
maupun kronis (Halang, 2004).
Uji toksisitas akut merupakan uji toksisitas dengan pemberian suatu
senyawa pada hewan uji pada suatu saat, atau suatu ketoksikan suatu senyawa yang
diberikan dengan dosis tunggal pada hewan tertentu dan diamati selama 24 jam
(Loomis, 1978). Prosedur awal untuk menentukan toksisitas akut senyawa baru
adalah dengan membuat suatu kisaran dosis untuk diberikan pada hewan uji. Takaran
dosis yang dianjurkan paling tidak 4 peringkat dosis, berkisar dari dosis terendah
yang belum memberikan efek kematian hewan uji sampai dosis tertinggi yang dapat
mematikan seluruh atau hampir seluruh hewan uji (Donatus, 1990).
Adapun data yang diperoleh pada uji toksisitas dapat berupa data kuantitatif
yang dinyatakan dengan LD50 (median lethal dose) atau LC50 (median lethal
concentration). Harga LD50 dan LC50 suatu senyawa harus dilaporkan sesuai dengan
lamanya pengamatan. Bila lamanya pengamatan tidak ditunjukkan dianggap bahwa
23
Tabel I. Perbedaan uji toksisitas akut, uji toksisitas sub kronis, dan uji toksisitas kronis
Hal Uji toksisitas akut Uji toksisitas sub
kronis
Uji toksistas kronis
Waktu singkat (24 jam) < 3 bulan > 3 bulan
Dosis tunggal berulang berulang
Tujuan menentukan efek
toksik suatu
E. Brine Shrimp Lethality Test
Brine Shrimp Lethality Test merupakan salah satu metode pengujian awal
aktifitas antikanker suatu senyawa dengan menggunakan hewan uji Artemia salina L.
selama 24 jam. Uji toksisitas akut dengan hewan uji artemia ini dapat digunakan
sebagai uji pendahuluan pada penelitian yang mengarahkan pada uji sitotoksik
karena ada kaitan antara uji toksisitas akut dengan uji sitotoksik jika harga LC50 dari
uji toksisitas akut lebih kecil dari 1000 μg/ml. Parameter yang digunakan untuk
menunjukkan adanya aktivitas biologis suatu senyawa pada artemia adalah kematian.
Tingkat toksisitas dari ekstrak dapat ditentukan dengan melihat harga LC50.
Nilai LC50 dihitung dengan analisis probit. Dari persentase data kematian larva
artemia dikonversikan ke nilai probit untuk menghitung harga LC50. Apabila harga
LC50 < 1000 μg/ml maka senyawa dapat dikatakan toksik. Apabila pengujian dengan
larva artemia menghasilkan harga LC50 < 1000 μg/ml maka dapat dilanjutkan dengan
pengujian antikanker menggunakan biakan sel kanker. Cara ini akan menghemat
waktu dan biaya penelitian (Meyer et al., 1982). Metode ini juga masih sering
F. Kanker
Kanker merupakan suatu penyakit sel dengan ciri gangguan atau kegagalan
mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostasis lainnya pada organisme
multiseluler (Nafrialdi dan Ganiswarna, 1995). Sel-sel kanker akan terus membelah
diri, terlepas dari pengendalian pertumbuhan dan tidak lagi menuruti hukum-hukum
pembiakan. Sel-sel kanker dapat menyusup ke jaringan sekitarnya (invasi) dan dapat
menyebar ke seluruh jaringan (metastasis). Selain itu sel kanker juga kehilangan
fungsinya dan bersifat destruktif/merusak sel lainnya (Schunack, 1990).
Tahap-tahap pembentukan sel kanker adalah
1. inisiasi yaitu tahap pembentukan metabolit reaktif yang mampu berikatan secara
kovalen dengan DNA sehingga menyebabkan terjadinya mutasi pada DNA
2. promosi yaitu ekspresi mutasi yang dapat menyebabkan perubahan fungsi seluler
(ekspresi gen dan fungsi reseptor) serta pertumbuhan neoplasma (sel yang
pertumbuhannya tidak normal)
3. progresif yaitu manifestasi pertumbuhan dan perkembangan tumor menjadi ganas
(kanker) dengan invasi dan metastasis
Pada organisme eukariotik, terdapat empat fase dalam siklus sel yaitu
1. fase Gap 1 (G1) atau fase pascamitosis merupakan fase awal dimana terjadi
sintesis asam ribonukleat dan protein
2. fase Sintesis (S) dimana terjadi replikasi identik dari DNA sehingga dihasilkan
dua set komplit DNA
3. fase Gap 2 (G2) atau fase pramitosis merupakan fase persiapan untuk memasuki
25
4. fase Mitosis (M) merupakan fase dimana material inti diturunkan identik kepada
sel anak, yang ditandai dengan pembagian kromosom dan dihasilkan dua sel
anakan
Untuk selanjutnya sel dapat memasuki fase G0 dan dapat juga masuk
kembali ke fase G1. Hormon pertumbuhan, cyclins dan Cdk (cyclin dependent
kinase) merupakan sinyal transduksi yang dapat memacu sel untuk memasuki daur
sel kembali. Sedangkan protein penekan tumor (misalnya p53), dan Cdk inhibitor
akan memacu sel untuk memasuki fase istirahat (G0). Pada sel kanker, tidak terdapat
p53 atau jumlah p53 kurang (antara lain karena terjadinya mutasi p53), sehingga sel
kanker tidak dapat memasuki fase G0 dan sel tersebut akan memasuki siklus sel
dalam jangka waktu yang tidak terbatas, sehingga sel akan terus membelah
(Schunack, 1990).
Karsinogen dapat merangsang pembentukan kanker. Beberapa karsinogen
yang diduga dapat menaikkan resiko terjadinya kanker antara lain senyawa kimia
(zat karsinogen), faktor fisika (radiasi bom atom dan radioterapi agresif), virus (virus
hepatitis B dan C), dan hormon (Dalimartha, 2003).
Sebagai langkah pengobatan, telah banyak dilakukan penanganan terhadap
para penderita kanker, baik secara medis maupun tradisional. Obat antikanker
diharapkan memiliki toksisitas selektif, artinya menghancurkan sel kanker tanpa
merusak sel jaringan normal (Nafrialdi dan Ganiswarna, 1995).
Senyawa-senyawa aktif dari berbagai macam tanaman telah banyak
digunakan untuk mengobati kanker. Lebih dari 1400 macam tanaman digunakan
untuk mengobati kanker, misalnya Phyllanthus acuminatus, Marati oreganos,
Catharanthus roseus, dan masih banyak tanaman yang lain (Evans, 2002). Senyawa
aktif antikanker tersebar luas pada tanaman tingkat tinggi meliputi berbagai golongan
senyawa seperti flavonoid, alkaloid, saponin, oligosakarida, kuasinoid, terpenoid dan
polifenol (Cheng, 2003).
G. Penyarian
Penyarian adalah kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang
tidak dapat larut dengan pelarut cair. Untuk melakukan penyarian harus diketahui zat
aktif yang dikandungnya sehingga mempermudah pemilihan cairan penyari serta cara
penyarian yang tepat (Anonim, 1986).
Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan
27
menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif,
zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif
di dalam sel dengan yang di luar sel, maka larutan yang terpekat akan didesak ke luar.
Peristiwa tersebut berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan
di luar sel dan di dalam sel (Anonim, 1986).
Maserasi pada umumnya dilakukan dengan memasukkan 10 bagian
simplisia dengan derajat halus yang cocok ke dalam bejana kemudian dituangi 75
bagian cairan penyari, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari terlindung dari cahaya,
sambil berulang-ulang diaduk. Setelah 5 hari sari diserkai, ampas diperas. Ampas
ditambah cairan penyari secukupnya diaduk dan diserkai, sehingga diperoleh seluruh
sari sebanyak 100 bagian. Bejana ditutup, dibiarkan di tempat sejuk, terlindung dari
cahaya selama 2 hari. Kemudian endapan dipisahkan. Penggunaan mesin pengaduk
yang berputar terus menerus dapat mempersingkat waktu maserasi menjadi 6-24 jam
(Anonim, 1986).
H. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis merupakan metode pemisahan fisikokimia. Lapisan
yang memisahkan terdiri dari bahan berbutir (fase diam) ditempatkan pada
penyangga berupa pelat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan
dipisahkan berupa larutan yang ditotolkan pada fase diam dan hasil totolannya
berupa bercak atau pita. Setelah itu pelat dimasukkan ke dalam bejana tertutup rapat
pengembangan. Selanjutnya senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan atau
dideteksi (Stahl, 1985).
Fase diam pada kromatografi lapis tipis terdiri dari bahan padat atau serbuk
halus yang terbuat dari kaca, polimer, atau logam. Larutan melekat pada permukaan
dengan bantuan bahan pengikat, biasanya kalsium sulfat atau amilum. Penyerap yang
umum adalah silika gel, aluminium oksida, kieselguhr, poliamida, selulosa dan
turunannya. Untuk analisis, tebal penyerap 0,1-0,3 mm. Sebelum digunakan, lapisan
penyerap disimpan dalam lingkungan yang tidak lembab dan bebas dari uap lain
(Stahl, 1985).
Fase gerak adalah medium angkut yang terdiri dari satu atau beberapa
pelarut yang bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan yang berpori yang
disebabkan adanya gaya kapiler. Pelarut yang digunakan hanyalah yang memiliki
tingkat mutu analitik dan apabila diperlukan dapat digunakan pelarut yang
merupakan campuran sedikit mungkin pelarut dan paling banyak terdiri dari tiga
jenis pelarut (Stahl, 1985).
Jarak pengembangan senyawa pada kromatografi biasanya dinyatakan
dalam angka Rf atau hRf, dimana angka tersebut dapat digunakan untuk identifikasi
senyawa yang dianalisis. Harga Rf merupakan karakteristik KLT. Perkiraan
identifikasi diperoleh dengan pengamatan dua bercak dengan harga Rf dan ukuran
yang hampir sama. Harga Rf untuk suatu senyawa dapat dibandingkan dengan harga
standar (Stahl, 1985).
Jarak titik pusat bercak dari titik awal Rf=
29
Deteksi bercak pada lempeng kromatografi yang telah dikembangkan dapat
menggunakan sinar UV 254 nm dan UV 365 nm dan pereaksi semprot. Deteksi
paling sederhana adalah dengan sinar UV pada lapisan yang mengandung indikator
fluoresensi, terbatas pada senyawa yang mempunyai cincin aromatik dan ikatan
rangkap terkonjugasi. Apabila dengan sinar UV senyawa tidak terdeteksi, maka
digunakan pereaksi semprot yang sesuai (Stahl, 1985).
I. Landasan Teori
Tembelekan merupakan salah satu tumbuhan obat yang banyak digunakan
masyarakat untuk menghilangkan tumor dan dilaporkan toksik pada binatang yang
memakan daunnya. Toksisitas tumbuhan tembelekan dihubungkan dengan
pentasiklik triterpenoid dan flavonoid yang terkandung didalamnya. Flavonoid dan
pentasiklik triterpen dalam tumbuhan tembelekan larut dalam etanol.
Untuk mengetahui toksisitas daun tumbuhan tembelakan digunakan metode
Brine Shrimp Lethality Test yang merupakan metode pengujian bioaktivitas suatu
bahan dengan organisme uji berupa larva artemia. Larva artemia digunakan karena
memiliki kesamaan sistem enzim pada mamalia antara lain DNA-dependent RNA
polymerase dan ouabaine sensitive Na+ and K+ dependent ATPase. Suatu senyawa
dikatakan toksik jika mempunyai LC50 kurang dari 1000 μg/ml. Jika suatu senyawa
berefek toksik terhadap larva artemia, maka senyawa tersebut dapat diuji lebih lanjut
J. Hipotesis
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis eksperimental murni dengan rancangan
Postest Only Control Group Design.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas
Ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan yang diujikan pada larva
artemia dengan konsentrasi 40, 52, 68, 88, dan 114 μg/ml.
b. Variabel tergantung
Jumlah kematian larva artemia setelah pemberian ekstrak etanol daun
tumbuhan tembelekan.
c. Variabel pengacau terkendali
1) Faktor lingkungan tempat percobaan yaitu sinar lampu 5 Watt; suhu penetasan
yaitu 25°C-30°C; pH air laut buatan yaitu antara 8-9; dan kadar garam 5
permil.
2) Faktor hewan uji yaitu umur larva artemia (48 jam).
3) Faktor tumbuhan yaitu jenis atau varietas tumbuhan tembelekan.
d. Variabel pengacau tidak terkendali
Kondisi lingkungan tempat tumbuh tumbuhan tembelekan.
2. Definisi operasional
a. Daun tumbuhan tembelekan yang digunakan adalah daun tumbuhan tembelekan
yang masih muda, yang merupakan daun ke-4 sampai ke-5 dari ujung tangkai.
b. LC50 (lethal concentration-50) merupakan kadar senyawa uji yang mampu mengakibatkan terbunuhnya 50% jumlah hewan uji dan ditentukan setelah 24
jam perlakuan.
c. Larva artemia merupakan larva yang telah berumur 48 jam dari penetasan telur
artemia.
d. Ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan merupakan ekstrak kering yang
diperoleh dengan menyari menggunakan etanol p.a. dengan cara maserasi.
C. Bahan dan Alat Penelitian 1. Bahan penelitian
a. Bahan utama
Daun tumbuhan tembelekan diperoleh pada bulan Agustus di belakang
RSJ Grahasia, Pakem, Sleman, Yogyakarta.
b. Bahan untuk ekstraksi
Bahan yang digunakan untuk penyarian yaitu etanol pro analysis.
c. Bahan untuk BST
Bahan yang digunakan untuk uji BST antara lain telur artemia Viper
(Jeannie Hoo., LTD, China), air laut buatan berkadar garam 5 per mil, ekstrak
33
d. Bahan untuk air laut buatan
Bahan kimia yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan berderajad
teknis, yaitu natrium klorida, magnesium sulfat, magnesium klorida, kalsium
klorida, kalium klorida, dan natrium bikarbonat, serta aquadest, aquadest bebas
CO2 dan aquadest panas.
e. Bahan untuk KLT
1) Flavonoid. Bahan yang digunakan antara lain selulosa, n-butanol, asam asetat,
aquadest, ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan, pembanding rutin 1%, uap
ammonia, dan pereaksi AlCl3.
2) Triterpenoid. Bahan yang digunakan antara lain silika gel GF 254 (MERCK),
toluene, etil asetat, ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan, ekstrak etanol
Liquiritiae Radix dan pereaksi semprot vanillin asam sulfat.
2. Alat penelitian
Alat yang digunakan antara lain shaker (Innova 2100), vacuum rotary
evaporator (Janke & Kunkel), neraca analitik (Mettler Toledo AB 204), mikropipet
50 μl dan 200-1000 μl (Socorex ISBA S.A), waterbath (Memert), aquarium penetas
artemia (lokal), aerator (Niko Nk 1200), lampu 5 watt (dop), bejana kromatografi,
alat semprot, lampu ultraviolet dengan panjang gelombang 254 nm dan 365 nm,
gelas ukur (Pyrex), gelas Beaker (Pyrex), Erlenmeyer (Pyrex), cawan porselen,
flakon, pipet khusus BST, pipet tetes, pipet ukur, pipet volume, batang pengaduk,
D. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tumbuhan tembelekan
Determinasi tumbuhan tembelekan bertujuan untuk memastikan bahwa
tumbuhan yang digunakan adalah Lantana camara L.. Determinasi dilakukan di
Laboratorium Kebun Obat, Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta dengan
menggunakan buku acuan menurutBecker and Backhuizen (1963).
2. Pengumpulan bahan
Daun tumbuhan tembelekan diperoleh pada bulan Agustus 2006 di
belakang RSJ Grahasia, Pakem, Yogyakarta.
3. Penyiapan bahan
Daun tumbuhan tembelekan yang sudah diambil dicuci dengan air yang
mengalir, lalu dianginkan. Jika sudah bersih, daun dikeringkan di bawah sinar
matahari secara tidak langsung dengan ditutupi kain hitam. Daun diasumsikan kering
apabila daun diremas sudah dapat hancur. Setelah kering daun diserbuk dan diayak.
4. Maserasi
Sebanyak 30 gram serbuk daun tumbuhan tembelekan ditimbang dan
dimasukkan dalam Erlenmeyer dengan ditambah 225 ml etanol p.a.. Erlenmeyer
ditutup dengan aluminium foil, lalu diletakkan pada mesin pengaduk (shaker) dengan
laju konstan (130 rpm) selama 24 jam lalu larutan disaring dengan kertas saring.
Maserat ditampung dan disimpan pada suhu kamar sedangkan ampasnya dimaserasi
lagi dengan 225 ml etanol p.a. menggunakan shaker 130 rpm selama 24 jam, lalu
disaring dan maserat ditampung untuk digabungkan dengan maserat hasil maserasi
35
Maserat yang terkumpul lalu dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator
sampai kental (volume kira-kira 1/3 nya). Setelah itu, dengan menggunakan cawan
porselen yang sudah ditimbang terlebih dahulu, ekstrak diuapkan di atas waterbath
dengan suhu 50°C dan dengan kipas angin sampai didapatkan ekstrak kering.
5. Pembuatan air laut buatan
Bahan yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan berkadar garam 5
per mil yaitu 5 g NaCl; 1,3 g MgSO4; 1 g MgCl2; 0,3 g CaCl2; 0,2 g KCl; dan 2 g
NaHCO3 dicampur dalam 1 liter aquadest. Bahan-bahan sebagian dilarutkan dalam
sebagian aquadest dalam labu takar 1 liter. Khusus untuk MgSO4 dilarutkan dalam
air panas, sedangkan NaHCO3 dilarutkan dengan air bebas CO2. Lalu ditambah
aquadest sampai volume 1 liter (Mudjiman, 1991).
6. Penetasan siste artemia
Artemia ditetaskan dengan media air laut buatan berkadar 5 per mil. Siste
artemia ditetaskan dalam aquarium yang disekat menjadi dua bagian, bagian terang
dan gelap, dengan sekat berlubang. Siste artemia ditaburkan pada bagian gelap
aquarium. Siste akan menetas setelah ± 24-39 jam lalu menjadi larva (Mudjiman,
1991). Larva yang aktif akan bergerak menuju tempat terang melalui lubang pada
sekat. Setelah 48 jam, larva diambil menggunakan pipet, digunakan sebagai hewan
uji (Meyer et al., 1982).
7. Penyiapan sampel untuk uji toksisitas
Ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan dibuat seri konsentrasi 40, 52,
68, 88, dan 114 μg/ml. Kelompok ini merupakan kelompok perlakuan. Selain itu
yang sama dengan jumlah ekstrak etanol yang ditambahkan dalam tiap-tiap flakon.
Dilakukan 5 kali replikasi untuk masing-masing seri konsentrasi.
8. Pembuatan larutan sampel
a. Pembuatan larutan A dan larutan B
Larutan A dengan konsentrasi 10 mg/ml atau 10 μg/μl dibuat dengan
menimbang 100,0 mg ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan kemudian
dilarutkan dalam etanol p.a. sampai 10,0 ml. Larutan B dengan konsentrasi
1 μg/μl dibuat dengan mengambil 1,0 ml dari larutan A kemudian dilarutkan
dalam etanol p.a. sampai 10,0 ml.
b. Pembuatan larutan sampel
Dari larutan B, dibuat seri konsentrasi 40, 52, 68, 88, dan 114 μg/ml.
Tabel II. Seri konsentrasi larutan sampel daun tumbuhan tembelekan
Konsentrasi
9. Uji toksisitas akut dengan BST
Sepuluh ekor larva artemia yang telah berumur 48 jam diambil, dimasukkan
dalam flakon yang berisi sampel dengan konsentrasi tertentu yang sebelumnya telah
dikeringanginkan, kemudian ditambahkan air laut buatan sebanyak 3 ml. Lalu
37
laut buatan sampai 5 ml. Setiap pengujian selalu disertai dengan kontrol dan tiap
konsentrasi dibuat dalam 5 kali replikasi. Flakon dijaga agar selalu mendapat
penerangan. Setelah 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung untuk mengetahui nilai
probit dan dianalisis untuk mengetahui harga LC50 (Meyer et al., 1982).
10. Uji KLT ekstrak etanol daun tumbuhan tembelekan
Pada lempeng KLT ditotolkan masing-masing sebanyak 3 totol ekstrak
(larutan A) dan pembanding dengan menggunakan mikropipet 5 μl. Setelah totolan
kering, lempeng dimasukkan dalam bejana yang berisi fase gerak yang telah jenuh
lalu dielusi sampai jarak rambat 10 cm lalu diangkat dan dikeringkan. Setelah itu
elusi yang terjadi diamati dengan melihat bercak yang timbul. Sistem KLT yang
digunakan adalah sebagai berikut
a. flavonoid
1). fase diam : selulosa
2). fase gerak : n-butanol:asam asetat:air (4:1:5 v/v fase atas)
3). pembanding : rutin
4). deteksi : visibel, UV 254 nm dan UV 365 nm sebelum dan
sesudah diuapi amonia dan dengan pereaksi AlCl3
b. triterpenoid
1). fase diam : silika gel GF 254 (MERCK)
2). fase gerak : toluen:etil asetat (93:7 v/v)
3). pembanding : ekstrak etanol Liquiritiae Radix
4). deteksi : visibel, UV 254 nm dan UV 365 nm, dan vanillin
11. Analisis hasil
Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh dianalisis
menggunakan analisis probit SPSS untuk menghitung harga LC50. Dalam
perhitungan analisis probit secara manual, konsentrasi ditransformasikan menjadi log
konsentrasi (sebagai nilai x) dan % kematian ditransformasikan menjadi nilai probit
(sebagai nilai y). Setelah didapatkan persamaan garis data di atas, dicari nilai LC50
dengan menghitung nilai x pada y=5. Setelah itu, nilai x di anti-log kan untuk
mendapatkan konsentrasi dimana dapat membunuh 50% hewan uji.
Jika pada kontrol ada artemia yang mati, maka persen kematian ditentukan
dengan rumus Abbot :
% kematian pada perlakuan – % kematian pada kontrol
% kematian = X 100%
100 – % kematian pada kontrol
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tumbuhan
Determinasi pertama-tama dilakukan dengan melihat ciri-ciri morfologi
tumbuhan secara keseluruhan yaitu daun, bunga, batang yang kemudian dicocokkan
dengan menggunakan kunci determinasi menurut Becker and Bakhuizen (1963).
Determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran tumbuhan yang akan digunakan
dalam penelitian.
Berdasarkan determinasi yang telah dilakukan (lampiran 1), diperoleh
kesimpulan bahwa tumbuhan yang digunakan adalah benar-benar tumbuhan
tembelekan (Lantana camara L.).
B. Pengumpulan dan Pengeringan Bahan
Daun tumbuhan tembelekan diperoleh dari tumbuhan tembelekan yang
diambil di belakang RSJ Grahasia, Pakem. Lokasi tumbuh diusahakan sama untuk
menghindari variasi kandungan kimia yang terlalu besar karena perbedaan kondisi
lingkungan. Daun yang diambil merupakan daun ke-4 sampai ke-5 dari ujung tangkai.
Pemilihan ini bertujuan agar daun yang digunakan memiliki umur yang relatif sama
sehingga kadar senyawa aktifnya tidak berbeda secara bermakna (Anonim, 1985).
Daun tumbuhan tembelekan diambil dalam keadaan segar pada kondisi sedang
berbunga karena pada saat itu kandungan kimia mencapai kadar optimum sehingga
senyawa aktif yang terbentuk juga dalam keadaan optimal (Anonim, 1985).
Daun tumbuhan tembelekan yang telah dikumpulkan lalu dibersihkan dan
dicuci dengan air mengalir. Pencucian dengan air mengalir ini bertujuan agar tanah
dan pengotor lainnya yang melekat pada daun dapat terlepas serta tidak menempel
lagi. Kemudian daun diangin-anginkan lalu dikeringkan di bawah sinar matahari
secara tidak langsung dengan ditutup menggunakan kain hitam agar senyawa aktif
yang terdapat didalamnya tidak rusak. Pengeringan bertujuan untuk mempermudah
pembuatan serbuk, menurunkan kadar air sehingga tidak ditumbuhi jamur, dan
menjamin agar kualitasnya tetap baik sehingga dapat disimpan dalam waktu yang
lebih lama. Reaksi enzimatis serta perubahan kimiawi juga dapat diminimalkan,
sehingga senyawa aktif yang terkandung dalam daun tumbuhan tembelekan tidak
hilang terurai (Anonim, 1986).
Pengeringan daun dapat dihentikan jika kadar air yang terkandung dalam
simplisia kurang dari 10% karena reaksi enzimatis yang dapat menguraikan senyawa
aktif sudah tidak berlangsung (Anonim, 1985). Untuk mengetahui kapan proses
pengeringan dihentikan juga dapat dilakukan dengan meremas daun sampai dapat
hancur. Jika kadar air dalam daun masih tinggi, maka daun tersebut masih lemab dan
jika diremas tidak hancur.
Simplisia yang telah kering kemudian diserbuk menggunakan blender.
Pembuatan serbuk ini bertujuan untuk memperluas permukaan yang kontak dengan
cairan penyari sehingga kandungan kimia yang terlarut dalam proses penyarian lebih
banyak dan penyarian dapat berlangsung lebih sempurna (Anonim, 1986). Maka
semakin halus serbuk simplisia seharusnya semakin baik penyariannya. Tetapi dalam
