Pencegahan Herpes SimplexVirus diinduksi Stroma Keratitis oleh
Glycoprotein B-Spesifik Antibodi monoklonal
ABSTRAK
Meningkatnya insiden asiklovir (ACV) dan strain resisten pada pasien dengan kornea HSV-1 infeksi yang menyebabkan herpes stroma Keratitis (HSK) merupakan masalah kesehatan utama di negara-negara industri dan sering mengakibatkan kebutaan. Untuk mengatasi kendala ini, kami sebelumnya telah mengembangkan antibodi monoklonal HSV-gB-spesifik (mAb 2c) yang terbukti sangat protektif di imunodefisiensi NOD / SCID-tikus terhadap infeksi genital. Dalam penelitian ini, kami menguji efektivitas mAb 2c dalam mencegah penyakitimmunopathological HSK dalam model mouse / c HSK BALB. Oleh karena itu, tikus diinokulasi dengan HSV-1 regangan KOS pada kornea diskarifikasi untuk menginduksi HSK dankemudianbaik secara sistemik atau topikal diperlakukan dengan mAb 2c. Pengobatan sistemik dilakukan dengan pemberian intravena mAb 2c 24 jam sebelum infeksi (pre-exposure prophylaxis) atau 24, 40, dan 56 jam setelah infeksi (post-exposure imunoterapi). Pengobatan topikal dilakukan oleh inokulasi berkala (5 kali per hari) dari antibodi yang mengandung tetes mata sebagai kontrol, mulai dari 24 jam pasca infeksi. Pengobatan antibodi sistemik nyata mengurangi viral load pada tempat infeksi dan benar-benar melindungi tikus dari mengembangkan HSK. Administrasi antibodi infeksi sebelumnya atau posting antivirus sama-sama efektif. Pengobatan topikal tidak berpengaruh meningkatkan pada tingkat keparahan HSK. Kesimpulannya, data kami menunjukkan bahwa mAb 2c terbukti menjadi obat yang sangat baik untuk pengobatan infeksi HSV kornea dan untuk pencegahan HSK dan kebutaan. Selain itu, rekan manusiawi (mAb hu2c) sama-sama efektif dalam melindungi tikus dari HSV-induced HSK jika dibandingkan dengan antibodi tikus tua. Hasil ini menjamin pembangunan masa depan antibodi ini sebagai pendekatan baru untuk pengobatan kornea HSV-infeksi pada manusia.
Okular Herpes Simplex Virus tipe 1 (HSV-1) diinduksi keratitis adalah salah satu penyebab utama kebutaan menular di dunia industri. Insiden global HSV disebabkan penyakit mata kira-kira 1,5 juta, termasuk perkiraan jumlah 40.000 kasus baru gangguan penglihatan bermata parah atau kebutaan setiap tahun [1]. HSV-1 infeksi kornea sering mengakibatkan penyakit mulai dari radang epitel ringan sampai ulserasi kronis kornea yang dimediasi system imun, seperti keratitis stroma nekrotik berat, juga disebut herpes stroma Keratitis (HSK) [2, 3]. Setelah infeksi primer kornea virus bereplikasi di epitel kornea dan bermigrasi ke ganglion trigeminal dengan memindahkan langsung antara sel-sel epitel yang berdekatan, dari sel epitel ke neuron, dengan transportasi aksonal intraseluler dan melalui transfer di sinapsis saraf untuk menyebar dari perintah pertama ke perintah kedua neuron rangka[4]. Kedua, penyebaran sel-sel dan transportasi aksonal intraseluler adalah mekanisme kunci dari HSV untuk memfasilitasi penyebaran virus secara cepat dan melarikan diri dari host sistem pertahanan imun seluler dan humoral [5]. HSV terjadinya laten, infeksi asimtomatik dalam neuron dari sistem saraf perifer. Reactivasi berkala virus laten dan transmisi dari ganglia trigeminal ke menyebar ke pinggiran melalui sel ke sel dapat menyebabkan infeksi berulang dari kornea berhubungan dengan lesi inflamasi dimediasi sel T yang parah yang akhirnya dapat mengakibatkan HSK [6 ] dan kebutaan [7]. Saat ini, pengobatan sistemik atau topikal dengan acyclovir (ACV) berhasil digunakan untuk menekan replikasi virus pada pasien dengan berulang herpes reaktivasi. Selain itu, kortikosteroid digunakan untuk menekan respon kekebalan pada kornea untuk menghindari jaringan parut kornea. Studi terbaru menunjukkan bahwa kejadian resistensi asiklovirHSV-1 strain telah secara dramatis meningkat menjadi sekitar 6,4% pada pasien imunokompeten dengan HSK [1, 8]. Karena beberapa efek samping yang serius penggunaan gansiklovir (GCV) atau foscarnet (FOS) terbatas [9]. Selanjutnya, resistensi silang terhadap GCV, FOS atau sidofovir (CDV) semakin terlihat [10]. Oleh karena itu penting untuk mengembangkan seri, ditoleransi pilihan pengobatan untuk pasien dengan asiklovir berulang atau resisten silang HSV-1 infeksi kornea.
Dalam penelitian sebelumnya, kami telah melaporkan bahwa monoklonal antibodi mAb 2c dikembangkan sebagai senyawa yang sangat ampuh untuk netralisasi obat resistensi Herpes Simplex Virus [11, 12]. Antibodi ini mengakui epitop umum pada glikoprotein B dari HSV-1 dan HSV-2 dan terlihat lebih dari biasanya khasiat antivirus tinggi in vitro dan pada tikus sangat imunodefisiensi NOD / SCID. Urutan epitope dikenali oleh mAb 2c sangat dibiakan di isolasi HSV-1 dan HSV-2 dan terbukti menjadi penting untuk virulensi dan kebugaran virus [13].
Berbeda dengan sebagian besar antibodi manusia yang dihasilkan selama infeksi HSV atau disebabkan oleh vaksinasi dengan vaksin protein rekombinan, antibodi ini tidak hanya menetralisir virus yang beredar, tetapi juga menghambat HSV penyebaran transmisi oleh sel ke sel [11]. Mekanisme ini dikenal menjadi penting selama pembentukan laten dan juga selama reaktivasi [5, 14]. Karena sifat unik dari mAb 2c, kami merancang derivate mAb hu2c mansia untuk pengobatan infeksi HSV resisten terhadap obat antivirus standar [11, 12]. Baik antibody manusia dan antibodi mencit memperlihatkan sifat yangsama mengikat dan mampu menetralisir berbagai klinis isolat resisten terhadap ACV, FOS atau CDV. In vivo, mAb hu2c juga mencegah NOD / tikus SCID terhadap mematikan infeksi HSV-1 dengan multidrug resisten isolat klinis [15]. Berdasarkan data-data yang menjanjikan, kami menyimpulkan bahwa antibodi ini harus menjadi pilihan perawatan yang tepat untuk infeksi kornea berat HSV-1 menginduksi HSK.
Akibatnya, tujuan dari penelitian ini adalah untuk menguji kapasitas netralisasi dari antibodi monoklonal HSV-gB-spesifik terhadap mata-patogen HSV-1 galur KOS dan isolat klinis ACV resisten in vitro dan kemanjurannya dalam pencegahan HSK di imunokompeten pada mencit BALB model / c.
Bahan danMetode
Pernyataan Etika
Hewan percobaanyang dipakai sesuai dengan peraturan ketat Masyarakat Jermanuntuk Laboratorium Ilmu Hewan(GV-SOLAS) danUU Kesehatan Eropa dari Federasi Laboratorium Hewan Asosiasi Ilmu(FELASA). Protokolini disetujuioleh Badan Westphalia Negara Rhine Alam, Lingkungan Hidup danPerlindungan Konsumen (LANUV) (Izin nomor: G1194-1111). Persiapan neuronsensorik mencit dilakukan sesuai dengan Undang-UndangJerman Animal Welfare. Semuaupaya dilakukanuntuk meminimalkan penderitaan. Untukimunofluoresensi percobaan mikroskop(lihat di bawah), kami menggunakanserummanusiayang sehat, HSV-1 seronegatifvolunteers.Writteninformed consent dari donor darah diperoleh. Izin diberikan oleh Lembaga Review Boarddari Hannover Medical School(persetujuan nomor893).
Mencit BALB/c betina, 8 minggu usia, yang dibeli dari Charles River Laboratories (Charles River Laboratories, Sulzfeld, Jerman) dan dipelihara dalam kondisi bebas patogen. Semua in vivo percobaan dilakukan sesuai dengan persyaratan hukumJerman dengan persetujuan fasilitas
hewan University Hospital Essen.
Untukmengisolasineuronprimer,tikusC57BL/6JHanZtmdibiakkandan dipeliharadiFasilitasHewan LaboratoriumHannoverMedical School.
Sel
Sel Vero (American Type Culture Collection, ATCC, CCL81, Rockville, MD) yang dikultur di Dulbecco'sModified EagleMedium (DMEM, Life Technologies Gibco, Darmstadt, Jerman) yang mengandung 10% (v / v) serum janin anak sapi (FCS; Life Technologies Gibco), 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin. BHK-21 sel (ATCC CCL-10) dikultur in minimum EssentialMedium (MEM, Cytogen, Sinn, Jerman) ditambah dengan 10% FCS (v / v), 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin. Sel epitel C127I (ATCC CRL-1616) dikultur dalam DMEM (Life Technologies Gibco) yang mengandung 10% (v / v) FCS (PAA, Saarbrücken, Jerman), 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin. Budaya utama akar dorsal ganglion (DRG) neuron disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [16, 17]. Neuron tersebut terinfeksi dalam perjalanan manusia dan murine HSV-1 infeksi [18-21]. Secara singkat, dewasa C57BL / 6J tikus dikorbankan, DRG dari serviks, tingkat toraks dan lumbal hewan yang dibedah dan dikumpulkan dalam 1x Hank Seimbang Salt Solution (HBSS, mengandung 5 mMHEPES, 10 MMD-Glukosa, pH 7,4). Ganglia pertama kali dicerna selama 20 menit pada 37 ° C dengan 20 mg / ml papain (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Jerman) di papain solusi aktivasi (0,4 mg / ml L-sistein, 0,5 mMEDTA, 1,5 mMCaCl2 × 2H2O, pH 7,4) diikuti oleh pencernaan dengan 10 mg / ml kolagenase IV (Invitrogen) dan 12 mg / ml dispase II (Sigma-Aldrich) di 1xHBSS. Ganglia yang pellet dan diresuspensi dalam 1 ml 1xHBSS dan triturated menggunakan pipet Pasteur dengan ujung menyempit. Neuron-suspensi itu berputar selama 8 menit pada 381 × g melalui bantal yang terdiri dari 20% (v / v) Percoll di media CO2-independen (Life Technologies Gibco) yang mengandung 10 MMD-glukosa, 5 mMHEPES, 10% FCS, 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin. Setelah menghapus supernatan, pelet sel resuspended dalam 2 ml CO2-independen menengah dan akhirnya disentrifugasi selama 2 menit pada 1000 × g.The pelet diresuspensi dalam medium F-12 campuran nutrisi Ham mengandung
10% FCS, 50 ng / ml 2,5 S NGF (Promega Corporation, Fitchburg, WI, AS), 100 U / ml penisilin dan 0,1 mg / ml streptomisin dan unggulan ke slip penutup dilapisi dengan 0,01% (b / v) dalam H2Opoli-L-lisin (150,000-300,000 g×mol-1Sigma-Aldrich) dan laminin mencit alami(0,8
gpercoverslip,Invitrogen) dalam 24piring. Neuron yang ditanam pada 37°Cdan5% CO2dalam inkubator dilembabkandan sedangberubah dua kaliperminggu. Obatantimitosis 1-β-D-arabinofuranosylcytosine (Sigma-Aldrich) ditambahkan kekonsentrasi akhir 2Mto menekan proliferasi membagi, sel-selnon-saraf dan dicuci sebelum infeksi. Setelahsatu minggu budidaya, neuronyang digunakan untuk melakukan eksperimen.
VIRUS
Strain patogen mata HSV-1 strain KOS dan isolat ACV resisten yang disebarkan pada sel Vero dan disimpan pada -80 ° C. Untuk pemeriksaan virus titer supernatan sel atau organ yang homogenizates dititrasi pada sel Vero seperti yang dijelaskan sebelumnya [22]. Tiga isolat klinis dengan resistensi terhadap ACV [10] yang baik yang disediakan oleh GeorgesM.GM Verjans (Departemen Virologi, Erasmus Medical Centre, Rotterdam, Belanda). Reporter virus HSV-1 (17 +) LoxpMCMVmCherry, HSV-1 pendek (17 +) Che, telah diturunkan dari HSV-1 (17 +) Lox-pMCMVGFP [23]. Gen GFP dari HSV-1 (17 +) Lox-GFP telah mengganti dengan gen untuk
monomer Cherry (R. Budida, A. Pohlmann, B. Sodeik, dan G. Behrens, yang akan diterbitkan di tempat lain); kedua strain mengekspresikan protein fluorescent GFP atau mCherry sebagai penanda pengganti dapat digunakan untuk memantau HSV-1 ekspresi gen virus awal. HSV-1 (17 +) Lox-Che itu disebarkan menggunakan BHK-21 sel dan dimurnikan seperti yang dijelaskan sebelumnya [24, 25]. Titer ditentukan oleh tes plak, genom untuk membentuk plak unit (PFU) rasio ditentukan dengan real time PCR [24, 25].
Antibodi
Antibodi monoklonal mAb 2c dan mAb hu2c dimurnikan dari hibridoma bebas serum atau supernatan SP2 / 0 sel dengan protein kromatografi A seperti yang dijelaskan sebelumnya [11, 15]. Purity telah dikonfirmasi oleh FPLC? 95%. Konsentrasi diukur dengan NanoDrop 2000 spektrometer
Netralisasi Assay
Kapasitas netralisasi dari mAb2c ditentukan pada sel Vero oleh end point pengenceran seperti yang dijelaskan sebelumnya[11]. Secara singkat, pengenceran serial antibodi diinkubasi dengan
100 TCID 50 dari HSV-1 KOS atau isolat klinis resistenACVselama 1 jam pada37°Cdalam mediumkultur sel. Virus antibodi inokulum diaplikasikan mono layers sel Vero tumbuh baik di96piring, dan efek sitopatik(CPE) yangtercipta setelah48jam inkubasipada 37°C. Konsentrasi antibodiyang diperlukan untuk penghambatan lengkap virus yang disebabkan CPE ditentukan sebagai titer netralisasi. [11, 15].
Inhibisi penyebaran sel ke sel
Efektivitas mAb 2c untuk menghambat transmisi sel ke sel dari strain patogen mata HSV-1 KOS dianalisis dengan imunofluoresensi seperti yang dijelaskan sebelumnya [11]. Secara singkat, monolayers konfluen sel Vero, tumbuh di 24-baik piring kultur jaringan, terinfeksi 100 TCID50 dari HSV-1 KOS. Setelah 4 jam adsorpsi pada 37 ° C inokulum virus telah dihapus. Sel diinkubasi selama 48 jam dalam DMEM yang mengandung 2% FCS di hadapan 500 nM (75 g / ml) mAb 2c, dikumpulkan sera manusia (1:40 diencerkan dalam medium) yang berasal dari donor dengan titer tinggi imunoglobulin anti HSV (penetral titer 1: 256 total netralisasi 100 TCID50 dari HSV-1 KOS), atau media saja. Konsentrasi antibodi dalam supernatant sel mewakili konsentrasi berlebih diperlukan untuk netralisasi lengkap virus yang dikeluarkan. Pembentukan plak terdeteksi oleh imunofluoresensi. HSV-1 sel yang terinfeksi diwarnai dengan anti-HSV-1/2-gD-antibodi tikus (Acris Antibodi, San Diego, CA, USA) dan Alexa Fluor 488 kambing anti IgG antibodi sekunder spesifik (Invitrogen). Baik antibodi Manusia atau antibodi mencit diwarnai dengan Cy3 kambing terkonjugasi anti IgG tikus atau antibodi sekunder IgG kambing anti manusia (Invitrogen), masing-masing. Gambar imunofluoresensi diperoleh dengan fluoresensi mikroskop Zeiss Pengamat Z1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman) pada pembesaran 100 kali lipat.
Analisis penyebaran sel epitel ke neuron dan neuron ke epitel
Sel C127Inaif ditransfeksikan dengan GFP mengekspresikan plasmid pEGFP-N1 (Invitrogen) untuk identifikasi. Transfeksi dilakukan dengan reagen GeneJuice sesuai dengan protokol produsen (Merck Millipore, Darmstadt, Jerman). Sel terbalik transfected dan diinkubasi selama 24 jam sebelum digunakan. Untuk menguji pengaruh antibodi yang berbeda pada HSV-1 transmisi sel neuron-to-epitel, neuron DRG terinfeksi 2.5x107 PFU / ml HSV-1 (17 +) Lox-Che. Pada 24 jam pasca infeksi, sel C127I transfected yang terpisah dengan accutase (GE Healthcare Eropa, Freiburg, Jerman) dan dicampur dengan antibodi hu2c, 2c atau dengan IgG manusia
dikumpulkan (Anti-HSV-positif; Sigma-Aldrich) di 75 g / ml atau pura-pura diobati. Campuran sel-antibodi seperti kemudian diunggulkan di atas neuron DRG yang terinfeksi. Untuk menguji dampak dari mAbs 2c dan hu2c pada epitel sel-to-neuron menyebar, sel C127I terinfeksi dengan 7,5 × 106PFU / ml selama 15 jam. Sel-sel kemudian terpisah dengan accutase, dicampur dengan antibodi yang ditunjukkan seperti dijelaskan di atas, dan unggulan di atas neuron DRG naif. Sel-sel cocultured yang tetap pada titik waktu yang ditunjukkan dengan PHEMO-fix (68 mM PIPA, 25 mM HEPES, 15 mM EGTA, 3 mMMgCl2, 10% (v / v) DMSO, 3,7% (b / v) paraformaldehyde (PFA) , 0,05% (v / v) glutaraldehid, 0,5% (v / v) Triton X-100, pH 6,9) pada suhu kamar selama 10 menit, dan kemudian dicuci selama dua kali 5 menit dengan PHEMO-buffer (68 mM PIPA, 25 mM HEPES, 15 mMEGTA, 3 mM MgCl2, 10% (v / v) DMSO, pH 6,9) selama 5 menit pada 37 ° C [26, 27]. Fiksatif sisa dipadamkan dengan 50 mMNH4Cl di PBS. Situs mengikat tidak spesifik dan Fc-reseptor dari GE kompleks / GI dari HSV-1 [28] dilucuti oleh inkubasi dengan memblokir reagen yang mengandung 5% (w / v) BSA dan 10% (v / v) manusia HSV-1 seronegatif serum di PBS selama 30 menit. Antibodi diencerkan dalam menghalangi reagen dan diinkubasi dengan sel dalam ruang dilembabkan selama 30 sampai 60 menit. Antibodi monoklonal yang ditujukan terhadap -tubulin-III (mab5564 mouse, Merck Millipore, Darmstadt, Jerman) digunakan untuk mengidentifikasi neuron. Antibodi sekunder untuk mikroskopi imunofluoresensi terhadap tikus yang konjugasi Alexa Fluor (Life Technologies Gibco). Akhirnya, sampel tertanam dalam pemasangan menengah (6 g gliserol, 2.6 gMowiol 40-88, 6 ml H2O, 12 ml 0.2MTris, pH 8,5) yang mengandung 0,1 g / ml DABCO (1,4-Diazabicyclo [2, 2, 2] oktan). Sampel dianalisis dengan mikroskop Zeiss Axiovert 200M dilengkapi dengan unit laser scanning LSM 510Meta confocal dengan argon (Argon2, 488 nm) dan helium-neon (HeNe1, 543 nm, HeNe1, 633 nm) laser menggunakan 63x minyak rencana-apochromatic Tujuan -immersion dengan aperture numerik dari 1,4. Gambar diperoleh dengan Browser Zeiss LSMImage (versi 4.2.0.121), dianalisis dengan ImageJ (Versi 1,45 h, Wayne Rasband, National Institute of Health, USA, http://rsb.info.nih.gov/ij/) dan diproses dengan Adobe Photoshop CS4 (Versi 11.0, Adobe Systems Inc, San Jose, CA, USA). Sebuah area melingkar dari 85 m2 ditempatkan ke pusat neuron, seperti yang diidentifikasi oleh -tubulin-III-label atau sel C127I transfected, seperti yang diidentifikasi oleh ekspresi GFP.
Infeksi kornea pada tikus dan studi desain
Tikus dibius dengan injeksi intraperitoneal ketamin hidroklorida (2 mg) dan mepivacaine hidroklorida (400 ng). Epitel mata kanan menggaruk delapan kali dalam pola silang dan diinokulasi dengan 1 × 105PFU dariHSV-1 KOS di media 5µl [29]. Tikus yang terinfeksi baik sistemik atau topikal diperlakukan denganantibodimAb 2c mencit. Pengobatan topikal dilakukan oleh inokulasi berkala (5 kali per hari) dari mata yang terinfeksi dengan 5 l (28,5 g) solusi antibodi (tetes mata) mulai 24 jam post infeksi (pi) sampai 7 p.i hari ini. Pengobatan sistemik dilakukan oleh intravena 300 g mAb 2c atau mAb hu2c 24 jam sebelum infeksi untuk profilaksis pra pajanan, atau 24, 40, dan 56 jam setelah infeksi pasca pajanan untuk imunoterapi. Perjalanan penyakit yang ditandai dengan penentuan tingkat keparahan penyakit (skor klinis blepharitis, cacat epitel dan HSK) dengan mikroskop operasi (Zeiss, Oberkochen, Jerman), masing-masing pada skala 0 sampai 4, yang konsisten dengan peradangan dari kelopak mata, efek cytopathic dari sel-sel epitel kornea atau opak kornea dengan neovaskularisasi, edema dan nekrosis [22]. Viral load mata terinfeksi diukur pada hari ke 5 pasca infeksi dengan uji standar plak (N = 6 dalam setiap kelompok) [30]. Sel-sel inflamasi di kornea dihitung seperti yang dijelaskan sebelumnya [31]. Jumlah sel total dalam limpa dan kelenjar getah bening dihitung setelah homogenisasi organ dengan saringan sel 70 m (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).
Kuantifikasi Sitokin dengan ELISA
Pengeringan kelenjar getah bening(DLN) dan limpa dari mencit yang terinfeksi HSV-1 KOS yang menerimasalah satu pengobatan antibodi atau PBS dikumpulkan pada hari ke-14 setelah infeksi. Setelahorgan-organyangterhomogenisasidan5×106seldikulturtiga ulangandi hadapan2×107PFUUV-tidak aktif HSV-1 KOSatau mediasaja. Setelah24jam, jumlah IL-2 daninterferon(IFN) –di supernatan sel yang dihitung dengan ELISA (OptEIA, PharMingen, Hamburg, Jerman) seperti yang dijelaskan sebelumnya[32].
Floriferasi assay
Antigen dan mitogen diinduksi proliferasi dari splenosit atau sel pengeringan kelenjar getah bening dinilai melalui aliran cytometry assay berdasarkan seperti yang dijelaskan sebelumnya [33]. Secara singkat, limfosit terwarnai dengan eFluor 670 (eBioscience, Frankfurt am Main, Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik. 1 × 105sel / baik dikultur dalam 96 cawan yang bawahnya bulat dengan media, UV-HSV-1 (2 × 107 PFU / ml sebelum UV-inaktivasi) atau
Concanavalin A (Biochrom, Berlin, Jerman). Karena pembelahan sel, sel-sel kehilangan setengah dari fluoresensi dengan masing-masingpembelahan sel. Setelah 4 hari, sel-sel permukaan bernoda sesuai instruksi pabrik (eBioscience) menggunakan antibodi monoklonal berikut: tikus-tikus anti-CD4-PE, rat-anti-mouse CD8-FITC, tikus-tikus IgG2a kontrol k isotipe FITC, dan tikus-tikus IgG2b K Kontrol isotipe PE. Untuk membedakan antara sel-sel yang layak dan tidak layak, sel diwarnai dengan 7-AAD menurut instruksi pabrik (BD, Heidelberg, Jerman). Proliferasi dinilai melalui aliran cytometry (FACSCalibur, BD). Setidaknya 2.000 layak 7-AAD negatif (BD) CD4 + (eBioscience, Jerman) dan 1000 CD8 + (eBioscience) dimasukkan untuk analisis. Data aliran-cytometric dianalisis melalui Cytomation Summit Offline V3.1. software (Dako, Hamburg, Jerman).
Trigeminal ganglia Reaktivasi assay
Untukdeteksiviruslaten, gangliatrigeminal(TG) yang ditanamkan pada hari ke-14setelah infeksi dan ditanam dengan mono layers sel Vero selama tiga minggu seperti yang dijelaskan sebelumnya[34]. Untuk mendeteksi efek cytopathic kultur diperiksa pada interval harian.
Kuantifikasi DNA
HSV-1 genom yang diukur dengan real-time PCR seperti yang dijelaskan sebelumnya [11]. Secara singkat, DNA dimurnikan dari ganglia trigeminal dari HSV-1 KOS tikus yang terinfeksi menggunakan magna Pure LC sistem ekstraksi asam nukleat otomatis (Roche, Penzberg,Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik. Jumlah DNA virus kemudian dihitung dengan real-time PCR (LightCycler; Roche) menggunakan Artus HSV-1/2 LC PCR Kit (Qiagen, Hilden, Jerman). Batas deteksi analisis untuk HSV-1-DNA diisolasi dari ganglia trigeminal bertekad untuk menjadi 200 eksemplar / ganglion menurut protokol pabrik.
Pewarnaan Histologi
Untuk analisismikroskop cahaya, mata difiksasi(64% isopropanol, 3,7% formaldehida, 2,5% asam asetat), dikeringkan dengan isopropanol, dan ditanam dalam parafin seperti yang dijelaskan sebelumnya[35]. Bagian lima mikro meter kemudian diwarnai dengan hematoxylin-eosin dandianalisis dengan mikroskop cahaya
Deteksi antibody HSV-specifik pada sera and cairan air mata
Sera (60 l) dan cairan air mata (10 l cairan yang berasal dari mata dibilas dengan PBS) dari HSV-1 KOS mencit yang terinfeksi yang dipanen pada hari ke-HSV-14 pasca infeksi dan diperiksa untuk
pengikatan terhadap HSV-1 sel yang terinfeksi Vero oleh aliran cytometry seperti yang dijelaskan sebelumnya [11]. Data dianalisis dengan menggunakan Flowjo versi 7.2.5 (Pohon Bintang Inc, Ashland, OR, USA)
Deteksi sistemik diberikan antibodi manusia di HSV-1 KOS kornea
yang terinfeksi
Untuk menyelidiki apakah antibodi sistemik diterapkan dapat mencapai kornea terinfeksi, kami memeriksa bagian jaringan kornea dari HSV-1 KOS tikus yang terinfeksi setelah injeksi intravena mAb hu2c oleh imunofluoresensi. Oleh karena itu, tikus korneanya terinfeksi seperti dijelaskan di atas dan dosis tunggal 300 g mAb hu2cantibodimanusia itu disuntikkanintravena 48 jam pasca infeksi. Tikus kontrol menerima PBS. Enam jam kemudian mata telah dihilangkan dan dibekukan dalam nitrogen cair. Mata beku yang tertanam dalam media jaringan-Tek O.C.T. (Sakura, Alphen aan den Rijn, Nederlands) dan dipotong (7 m) dengan Frigocut 2800 mikrotom (Reichert-Jung, Nussloch, Jerman). Bagian beku dikeringkan selama 30 menit, tetap dengan didinginkan aseton selama 10 menit dan diinkubasi dengan mencegah penyangga (10% FCS di PBS) selama 15 menit. Selanjutnya, bagian kornea yang terwarnai secara bersamaan untuk HSV-1 infeksi dan terikat mAb hu2c dengan poliklonal anti-HSV HSV-1 FITC antibodi kambing terkonjugasi (Bethyl laboratorium, Montgomery, USA) dan antibodi sekunder IgG kambing Cy3-terkonjugasi anti-manusia(Invitrogen, Darmstadt, Jerman). Inti diwarnai dengan Hoechst (Hoechst 33342, 1 g / ml; Sigma, St. Louis, MO) selama 5 menit sesuai dengan protokol pabrik. Gambar imunofluoresensi diperoleh dengan fluoresensi mikroskop Zeiss Observer Z1 dengan perbesaran 200 kali lipat
Analisa Statistik
Data dianalisis dengan menggunakan Graph Pad Prism5(GraphPad PrismSoftware, LaJolla, CA, USA). Analisis statistik dilakukandengannonparametrikANOVA(Kruskal-Wallis) da npost hoc Dunn beberapa tes perbandingan atau parametrik ANOVA(analisis satu arah)danpost hocTukey's beberapa perbandingan tes. Perbedaan antara jumlah yang terinfeksi secara laten ganglion trigeminal dan jumlah ganglion trigeminal menunjukkan reaktivasi diperiksa dengan uji eksak Fisher. Perbandingan dianggap signifikan pada P<0,05
Netralisasi efektif HSV-1 KOS dan isolat klinis ACV resisten
Penyebaran Sel ke sel sangat penting untuk propagasi virus dalam kulit dan selaput lendir serta untuk transmisi dari sel epitel ke neuron sebelum retrograde transportasi ke trigeminal dan ganglia akar dorsal, dan juga untuk transmisi dari neuron ke epitel sel setelah Oleh karena itu reaktivasi dan transportasi anterograde. Kamimenandai khasiat antivirus dari HSV-gB spesifik 2c mAb antibodi monoklonal terhadap HSV-1 KOS dan tiga asiklovir isolat klinis tahan diperoleh dari pasien dengan HSK [10] .MAb 2c sepenuhnya dinetralkan viral load yang sama 100 TCID50 dari virus diuji pada konsentrasi 7,8 nM atau 15,6 nM (data tidak ditampilkan). Hal ini terkait dengan efisiensi netralisasi yang mAb 2c dipamerkan untuk obat lainnya sensitif HSV-1 strain dan isolat resisten obat yang diperoleh dari transplantasi sumsum tulang [11]. Seperti strain HSV lainnya, patogen matastrain HSV-1 menyebarkan oleh sel ke sel penyebaran menghindari pertahanan kekebalan tubuh inang [5] .Kami karena menganalisis pengaruh mAb 2c pada penyebaran sel ke sel dari HSV-1 KOS. Berbeda dengan imunoglobulin manusia (Gambar. 1, baris atas), mAb 2c terbatas infeksi virus ke sel-sel yang terinfeksi awalnya (Gbr. 1, baris bawah). Hasil kami menunjukkan bahwa 500 nM (75 g / ml) dari 2c mAb cukup untuk penghambatan lengkap dari sel ke sel menyebar. Hasil ini konsisten dengan penelitian sebelumnya kami dengan HSV-1 F [11].
Untuk menentukan apakah mAbs 2c dan hu2c mampu menghambat rute langsung dari transmisi antara epitel dan neuron, baik neuron yang tidak terinfeksi adalah co-kultur dengan sel yang terinfeksi epitel (penyebaran sel epitel -neuron) atau neuron yang terinfeksi adalah co-kultur dengan sel-sel epitel yang tidak terinfeksi (penyebaran neuron-ke-sel epitel ) dengan adanya atau tidak adanya antibodi yang ditunjukkan atau pooled IgG manusia sebagai kontrol. Untuk menguji penghambatan sel-neuron menyebar, dipisahkan murine DRG yang dilapis dengan HSV-1 (HSV-17 +) Lox-Che terinfeksi sel CHSV-127I yang telah diobati dengan baik dikumpulkan manusia IgG (Gbr. 2C), mAb 2c (Gbr. 2D ), manusiawi mAb 2c (Gbr. 2E) atau yang pura-pura diperlakukan (Gambar. 2B) sebagai kontrol. Kuantifikasi sel ke sel penyebaran ditampilkan sebagai total tingkat fluoresensi yang disebabkan oleh HSV-infeksi (Gbr. 2F). Untuk penyelidikan penghambatan sel neuron-to-disebarkan oleh mAbs 2c dan hu2c setup berlawanan digunakan (Gbr. 2G-L). Dengan demikian, neuron DRG terinfeksi HSV-1 (17 +) Lox-Che dan dilapis dengan GFP transfected sel C127I yang diobati dengan antibodi yang ditunjukkan.
Sementara-HSV 1 ditularkan dari sel yang terinfeksi C127I (panah pada Gambar. 2) ke neuron (panah pada Gambar. 2) dengan tidak adanya antibodi (Gbr. 2B) atau dengan adanya IgG manusia dikumpulkan (Gbr. 2C) , penambahan mAb 2c (Gambar. 2Dii) atau manusiawi mAb hu2c (Gambar. 2Eii) sepenuhnya menghambat penyebaran sel-neuron seperti yang ditunjukkan oleh kurangnya neuron primer mengekspresikan mCherry. Demikian pula, sel ke sel menyebar dari neuron yang terinfeksi ke sel C127I ditandai dengan ekspresi GFP benar-benar dihambat oleh mAb 2c (Gambar. 2Jiv) atau hu2c (Gambar. 2Kiv). IgG manusia sebagai kontrol tidak berdampak pada penularan virus dalam percobaan ini (Gambar. 2Iiv). Secara bersama-sama hasil kami menunjukkan bahwa mAb 2c menengahi netralisasi virus yang efektif dan penghambatan transmisi sel ke sel mata-patogen HSV-1 strain.Selanjutnya, mAb 2c serta manusiawi mAb antibodi hu2c yang mampu menghambat transmisi HSV antara sel-sel dan neuron primer.
Pencegahan penyakit kornea pada tikus oleh aplikasi antibodi
sistemik
Berdasarkan sifat unik dari antibodi ini, kami meneliti khasiat antivirus pengobatan mAb 2c topikal atau sistemik pada perjalanan penyakit tikus BALB / c yang korneanyaterinfeksi dengan 1 × 105 PFU HSV-1 KOS. Antibodi ini diterapkan topikal atau sistemik. Empat belas hari setelah infeksi, sembilan dari sepuluh kornea dari kelompok kontrol menunjukkan gejala HSK dengan nekrosis parah dan ulserasi, disertai dengan kelopak mata yang sangat bengkak dan meradang (Gambar. 3 dan 4A). Epitel kornea mata ini menunjukkan lesi epitel, mencerminkan sitolisis virus pada tahap awal, dan kerusakan jaringan dan ulserasi pada tahap akhir penyakit (Gambar. 3 dan 4A), sedangkan refleks mata-blink bisa lagi induksi. Dengan demikian, peningkatan jumlah sel inflamasi, terutama polimorfonuklear (PMN) dan sel mononuklear, ditemukan di kornea sentral (Gbr. 5). Jumlah rata-rata sel inflamasi infiltrasi kornea sentral dalam kelompok kontrol adalah c = 238,5 / grid (Gbr. 5). Sebaliknya, perkembangan penyakit kornea HSV dimediasi sepenuhnya dibatalkan oleh aplikasi antibodi sistemik bila diterapkan sebagai profilaksis atau pengobatan pasca-paparan. Rata-klinis blepharitis, cacat epitel dan HSK secara signifikan (P <0,05) menurun (Gambar. 3). Semua tikus sistemik diobati menunjukkan kelopak mata yang normal dengan hampir tidak ada peradangan. Dengan demikian, infiltrasi
kornea oleh sel inflamasi tidak diamati (c = 0 / grid;.. Gambar 4 dan Gambar 5), dan refleks mata-blink masih utuh, mirip dengan kornea terinfeksi (data tidak ditampilkan). Dari catatan, aplikasi topikal dari mAb 2ctidak efek menguntungkan pada perkembangan penyakit kornea (Gbr. 3). Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam tingkat infiltrasi sel antara kelompok kontrol (c = 238,5 / grid) dan kelompok topikal diperlakukan (c = 137,7 / grid) ditemukan (Gbr. 5). Kesimpulannya, hasil ini menunjukkan sukses mencegah penyakit kornea HSV yang dimediasi pada aplikasi 2c mAb sistemik. Ada juga bukti kuat bahwa antibodi dioleskan tidak berpengaruh pada terapi.
Pengaruh pengobatan mAb2c pada reaksi imun anti HSV
Secara signifikan menurun reaksi inflamasi dan infiltrasi sel dalam kornea tikus sistemik diobati mengarah pada asumsi bahwa mAb 2c juga dapat mempengaruhi respon imun sistemik setelah infeksiHSV-1. Untuk menyelidiki lebih lanjut ini, kami memeriksa nomor jumlah sel dalam pengeringan kelenjar getah bening (DLN) dan limpa, dan HSV-1 titer antibodi spesifik dalam serum dan cairan air mata tikus pada hari ke-14 pasca infeksi.
Sesuai dengan pengamatan klinis, DLNs tikus kontrol atau tikus menerima pengobatan topikal terilhat perkembangan nya secara mencolok. Total jumlah sel di DLNs yang 3,1 × 107 ± 8,7 × 106
(kontrol) atau 3,5 × 107± 9.2 × 106 (pengobatan topikal) masing-masing yang secara signifikan
lebih tinggi bila dibandingkan dengan tikusdiobatisistemik (profilaksis: 1,3 × 107±1,0 x 106;
terapi: 1,0 × 107± 3,7 x 106) (Gambar 6A). Perbedaan ini tidak diamati dalam limpa tikus dari
(Gambar. 6B). Secara signifikan titer antibodi rendah ditemukan di sera dan air mata cairan tikus diobatisistemik jika dibandingkan dengan kontrol atau kelompok perlakuan secara topikal (Gambar. 6C dan D). Tidak ada antibodi HSV-spesifikyang terdeteksi dalam cairan air mata tikus diobatisistemik. Sebaliknya, kadar antibodi serupa ditemukan dalam cairan air mata topikal yang diobati dan tikuskontrol. Secara bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa baik respon imun seluler dan humoral terhadap HSV-1 jelas menurun setelah aplikasi 2c mAb sistemik.
Berkurangnya respon imun spesifik HSV-1 pada tikus yang diobati
secara sistemik
Jumlah sel menurun di pengeringan kelenjar getah bening dari mAb 2c tikus perlakuan menunjukkan bahwa rute sistemik aplikasi mungkin mengurangi respon imun seluler HSV-1 spesifik. Untuk menentukan peran CD4 + dan CD8 + limfosit setelah terapi antibodi analisis berikutnya respon sel T dilakukan. Respon proliferatif dari splenosit atau DLN-limfosit setelah stimulasi dengan antigenHSV-1 menunjukanrespon imun spesifik terutamaHSV-1 didorong oleh sel CD4 + T (Gbr. 7). Sel CD4 + T proliferasi meresponsecara nyata berkurang ketika tikus
diobatisistemik dengan mAb 2c (Gbr. 7). CD4 + Type-1 T limfosit (Th1) terutama mensekresi interleukin 2 (IL-2) dan IFN- ditunjukkan untuk terjadinya immunopatologi dalam perjalanan
penyakit kornea [36-38]. Untuk menyelidiki apakah pengobatan mAb 2c mempengaruhi sekresi IFN- dan IL-2, kita ɤ perlakukan 5 tikus BALB / c dengan 300 g mAb 2c atau PBS oleh intravena injeksi 24 jam sebelum infeksikornea HSV-1 KOS. Setelah 14 hari kami menganalisis produksi sitokin limfosit yang diisolasi dari pengeringan kelenjar getah bening atau limpa setelah stimulasi dengan-tidak aktif UV HSV-1 KOS. Sekresi IFN- dan IL-2 berkurang secara signifikan di DLN-limfosit dan splenosit diisolasi dari tikus diobatisistemik dengan mAb 2c (Gbr. 8). Secara bersama-sama, hasil ini mengkonfirmasi bahwa mAb 2c secara signifikan mengurangi respon HSV-1spesifik CD4 + T pada tikus yang diobatisecara sistemik.
Efektifitas Netralisasi HSV-1 oleh mAb2c ditempat infeksi
Untuk menyelidiki apakah pengobatan topikal atau sistemik dengan mAb 2c dapat menurunkan viral load di tempat infeksi, kita isolasi mata awalnya terinfeksi dari 6 tikus perwakilan dari masing-masing kelompok pada hari ke 5 setelah infeksi dan memeriksa konten virus menggunakan alat tes plak standar. Sistemik diterapkan mAb 2c dimediasi pengurangan substansial dari HSV-1 di mata terinfeksi (Gambar. 9). Penurunan besar viral load diamati pada tikus yang menerima dosis tunggal 300 µg mAb 2c 24 jam sebelum infeksi. Terlihat penurunan yang signifikan dari viral load terdeteksi pada tikus yang menerima tiga dosis terapi (300 g) dari
mAb 2c, mulai 24 jam setelah infeksi (Gbr. 9). Dalam kelompok ini virus benar-benar tersingkir di 5 dari 6 tikus. Sebaliknya, tidak ada pengurangan dari titer virus diamati pada tikus yang diobati dengan mAb 2c mengandung tetes mata. Hasil ini jelas menunjukkan bahwa mAb 2c efektif mengurangi HSV-1 di situs kornea infeksi bila diterapkan secara sistemik. Hasil ini konsisten dengan perjalanan penyakitdan menunjukkan bahwa efektifitas netralisasi virus mungkin penting untuk pencegahan HSK.
Efektifitas Pengurangan penyebaran virus dan reaktivasi dari TG
dim Ab2c pada mencit perlakuan
Tingkat keparahan penyakit kornea sangat berkorelasi dengan frekuensi reaktivasi HSV dari pada pasien terinfeksi HSV laten. Dilihat dalam konteks ini, kita hipotesis bahwa membatasi penyebaran virus HSV ke neuron anatomis terkait di mana virus maka biasanya menetapkan latency mungkin memiliki efek menguntungkan pada terjadinya reaktivasi. Akibatnya, kita menyelidiki apakah mAb 2c mampu menghambat penyebaran virus HSV ke ganglia trigeminal oleh uji virus reaktivasi. Oleh karena itu, ganglia trigeminal diisolasi dari situs ipsilateral dan kontralateral mata terinfeksi pada hari ke-14 setelah infeksi.
Ganglia yang co-kultur dengan sel Vero selama tiga minggu, dan dimonitor untuk reactivations virus. Pemulihan HSV-1 diamati pada semua ipsilateral dan kontralateral TG terisolasi dari tikus kelompok kontrol (10/10). Pada tikus diobatitopikal, virus diaktifkan kembali itu sama ditemukan di 10/10 dari ipsilateral TG dan 8/10 dari kontralateral TG, mengungkapkan tidak ada perbedaan yang signifikan jika dibandingkan dengan kelompok kontrol. Sebaliknya, secara sistemik diterapkan mAb 2c signifikan membatasifrekuensireaktivasi virus dari ganglia trigeminal. Meskipun virus dapat diaktifkan dari 10 dari 10 (profilaksis) atau 9 dari 10 (terapi) ganglia ipsilateral, tidak ada virus pengaktifan ditemukan di situs kontralateral dari infeksi.
Data ini menunjukkan penghambatan efektif virus menyebar dari ipsilateral ke ganglia kontralateral (Gbr. 10A). Untuk memverifikasi temuan kami mengulangi percobaan ini (5 tikus masing-masing kelompok) dalam kondisi yang sama dan dihitung DNAHSV-1 dari ganglia trigeminal. Tidak ada HSV-DNA dapat dideteksi pada ganglia kontralateral tikus 2c diperlakukan secara sistemik mAb. Sebaliknya, HSV-DNA terdeteksi pada 5/5 ipsilateral dan kontralateral 4/5 ganglia pada kelompok kontrol PBS (Gambar.10C).
Menariknya, percobaan reaktivasi mengungkapkan tidak ada perbedaan antara kelompok yang menerima mAb 2c sebelumnya atau post infeksi. Namun, penularan virus ke TG mata yang terinfeksi tidak dapat dicegah pada tikus yang terinfeksi dengan dosis tinggi (1 × 105 PFU) dari
HSV-1 KOS. Untuk menyelidiki apakah penyebaran virus ke ipsilateral TG dapat benar-benar dihambat oleh mAb 2c dalam infeksi HSV dosis rendah, 5 tikus per kelompok terinfeksi dengan dosis menurun virus (105, 104 atau 103 PFU) dari HSV-1 KOS 24 jam setelah intravena
penerapan 300 g mAb 2c. Mengaktifkan virus dari ipsilateral TG dapat dideteksi pada 5/5 atau 2/5 tikus yang tidak diobati terinfeksi 104 atau 103 PFU HSV-1 KOS. Sebaliknya, frekuensi virus mengaktifkan itu nyata berkurang pada tikus secara diobatisistemik dengan mAb 2c. Virus mengaktifkan dapat dideteksi pada 3/5 tikus yang terinfeksi dengan 104 PFU HSV-1 KOS, dan
tidak ada reaktivasi diamati dari ganglia tikus yang terinfeksi dengan 103 PFU HSV-1 KOS (Gbr.
10B). Hasil ini menunjukkan bahwa penularan virus dari pinggiranke ganglia trigeminal mungkin dihambat oleh mAb 2c dalam infeksi virus tergantung dengan dosis.
Pencegahan HS Koleh antibodi manusia mAbhu2c
Berkaitan dengan aplikasi klinis masa depan antibodi monoklonal HSV-gB spesifik pada manusia untuk pencegahan HSK, kami kemudian meneliti efek perlindungan dari varian antibodimanusia ini (mAb hu2c) di corneatikus yang terinfeksiHSV-1. Karena rute topikal aplikasi tidak menunjukkan efek perlindungan pada perkembangan penyakit kornea, hanya aplikasirute sistemik diselidiki untuk mAb hu2c. Tikus terinfeksi dengan HSV-1 KOS dan sistemik diobati dengan mAb hu2c sebelum pasca infeksi HSV-1 seperti yang dijelaskan di atas untuk antibodi tikus tua. Antibodi manusia terbukti sama-sama efektif dalam pencegahan HSK jika dibandingkan dengan antibodi tikus. Gejala yang menyertai dari HSK (blepharitis, cacat epitel dan HSK) secara signifikan (P <0,05) menurun pada tikus secara sistemik diobati dengan mAb hu2c, dibandingkan dengan kontrol (Gambar. 11). Semua tikus yang diobati menunjukkan kelopak mata yang normal dengan hampir tidak ada peradangan. Mata-blink refleks masih utuh dan mirip dengan kornea terinfeksi (data tidak ditampilkan). Secara bersama-sama, baik antibodi
tikus tua serta varian manusiawi yang menunjukkan efek perlindungan yang sama pada pengembangan HSK dan kebutaan pada model tikus yang sangat relevan.
Deteksi sistemik diberikan mAbhu2c dikornea terinfeksi
Tidak adanya antibodi HSV-spesifik dalam cairan air mata tikus diobati secara sistemik menunjukkan bahwa adanya antibodi dalam cairan air mata mungkin tidak berdampak pada perkembangan penyakit. Namun, mengurangi viral load di mata tikus diobati secara sistemik menunjukkan bahwa antibodi disuntikkan mungkin menetralisir virus. Untuk mengklarifikasi apakah sistemik diterapkan mAb hu2c benar-benar dapat mencapai jaringan kornea menunjukkan aktivitas antivirus, kami memeriksa bagian kornea berasal dari HSV-1 KOS terinfeksi tikus intravena disuntikkan dengan mAb hu2c di infeksi pasca 48 jam oleh imunofluoresensi. Mata diisolasi dan dipotong enam jam setelah injeksi untuk memungkinkan antibodi untuk berdistribusi ke jaringan kornea. Antibodi manusia terdeteksi pada kornea terinfeksi HSV ketika colocalized dengan antigen HSV. Sebaliknya, tidak ada antibodi dapat dideteksi pada kornea terinfeksi, termasuk fluoresensi mengikat atau latar belakang tidak spesifik (Gbr. 12).Hasil ini memberikan bukti untuk distribusi sukses mAb hu2c ke kornea terinfeksi.
Diskusi
Meskipun kemajuan medis yang sangat besar selama dekade terakhir, herpes stroma Keratitis masih tetap menjadi penyebab utama kebutaan kornea menular. Sampai saat ini, tidak ada vaksin yang efektif yang tersedia [39, 40]. Penggunaan obat-obatan antiviral tersebar luas, tetapi terbatas karena toksisitas dan resistensi virus [41]. Meningkatnya prevalensi asiklovir dan multidrug resistant strain HSV (6,4%) di antara pasien dengan HSK adalah penyebab utama kegagalan terapi inflamasiInfeksi HSV kornea [8, 42]. Penggunaan antibodi monoklonal untuk pencegahan infeksi HSV kornea yang luas dibahas dalam penelitian sebelumnya [7, 43-47].
menunjukkan efek menguntungkan pada tingkat keparahan penyakit kornea pada tikus di bekas penelitian [44]. Meskipun perlindungan terbatas dari HSK juga bisa diamati pada tikus yang diobati dengan non-antibodi monoklonal spesifik untuk HSV-1 gC, efek terapi terbaik bisa dicapai pada tikus diobati dengan antibodi monoklonal menetralkan Fd79 dan mAb 8D2, khusus untuk glikoprotein gB dan gD, masing-masing [7, 43, 44]. Meskipun demikian, pretreatment antibodi bahkan tidak diselidiki (Fd79) atau gagal (mAb 8D2) untuk mencegah perkembangan kekeruhan kornea [43]. Sampai saat ini, tidak ada antibodi ini selanjutnya dilaporkan untuk penggunaan klinis.
Konsisten dengan temuan bahwa beberapa vaksin HSV eksperimental yang protektif pada model binatang tetapi tidak pada manusia, studi terbaru menunjukkan bahwa kualitas respon imunhumoral terhadap HSV signifikan berbed antara manusia, marmut da nmencit .Ketika vaksin rekombinan gD sangat menginduksi antibodi pada model binatang, respon netralisasi hanya lemah yang terdeteksi dalam vaksin manusia. Sebagian besar antibodi manusia gD-spesifik tidak efisien bersaing dengan epitop gD terlihat sangat oleh antibodi monoklonal berasal dari mencit[48]. Hasil ini menunjukkan bahwa mencit mampu meningkat respon antibodi lebih kuat terhadap HSV dari manusia. Terhadap latar belakang ini, evaluasi antibodi netralisasi tikus ampuh untuk penggunaan klinis masa depan tampaknya merupakan strategi yang menjanjikan untuk memerangi infeksi HSVparah.
Karena kebutuhan klinis bertahan untuk mengatasi resistan terhadap obat HSV-infeksi, kami baru-baru memanusiakan para gB spesifik antibodi monoklonal mAb 2c yang mampu menetralkan ACV dan isolat resisten multi-dari sumsum tulang pasien transplantasi in vitro dan dalam NOD sangat imunosupresi / model tikus SCID [11]. The manusiawi mAb antibodi hu2c dan antibodi tikus orangtua keduanya mengakui epitop yang sama yang sangat kekal antara HSV-1 dan HSV-2 dan penting untuk kebugaran virus. Mutasi dalam kedua subdomain epitop mengakibatkan kerugian dramatis infektivitas [13]. Kedua antibodi menunjukkan sifat penetral
sama terhadap HSV-1 dan HSV-2, secara independen dari pelengkap atau fungsi efektor sel antibodi-bergantung[15].
Dalam penelitian ini kami pertama kali meneliti khasiat antivirus dari 2c mencit mAb dalam pencegahan kornea HSV-infeksi dalam model mencit mapan HSK. Selanjutnya kami fokus pada dampak pengobatan antibodi pada tingkat respon imun terhadap HSV yang berhubungan dengan keparahan disease.With hormat kornea untuk aplikasi klinis masa depan, kami akhirnya melakukan investigasi apakah varian mAb hu2cmanusia mencegah HSK sebanding dengan antibodi tikus tua.
Pencatatan antibodi sistemik menghasilkan perlindungan total tikus dari HSV-1 KOS diinduksi tanda-tanda seperti blepharitis, cacat epitel atau HSK setelah profilaksis atau pascapaparan pengobatan. Namun, administrasi antibodi sistemik tampaknya penting untuk pencegahan efektif
HSK, karena aplikasi topikal berulang mAb 2c tidak efektif. Kelompok-kelompok lain juga telah melaporkan kegagalan pengobatan antibodi topikal dalam pencegahan HSK [43]. Mekanisme di balik temuan ini masih kontroversial. Hal ini umumnya percaya bahwa antibodi melindungi dengan menetralkan virus ekstraseluler, menghambat penularan virus langsung antara sel yang berdekatan atau dengan mediasi lisis sel yang terinfeksi virus [43]. Untuk mengerahkan netralisasi virus, antibodi harus mencapai jaringan kornea terinfeksi. Sistemik antibodi diterapkan ditemukan untuk masuk ke jaringan kornea oleh difusi IgG plasma dari pembuluh darah perifer dan pameran menetralkan aktivitas [49, 50]. Sebaliknya, pemberian topikal antibodi tidak efektif, kemungkinan besar karena antibodi IgG dengan berat molekul 149 kDa memiliki kapasitas terbatas untuk menembus kornea normal dan dengan demikian gagal untuk menetralkan virus [50, 51]. Namun, rute topikal administrasi kurang invasif dan mungkin lebih baik ditoleransi bila dibandingkan dengan aplikasi sistemik. Antibodi Fab fragmen (50 kDa) atau fragmen rantai tunggal (26 kDa) kurang konstan-daerah domain dari seluruh antibodi yang relatif kecil dan mampu menembus kornea [52]. Baru-baru ini, sebuah fragmen antibodi Fab (AC-8) khusus untuk HSV glikoprotein D telah digunakan secara topikal untuk mencegah HSK. Sebenarnya, pengobatan dengan AC-8 sedang mengurangi nilai penyakit mata, tapi tidak efektif sebagai terapi standar dengan trifluorthymidine [41]. Namun demikian, Fab fragmen berasal dari mAb 2c IgG hampir tidak efektif dalam virus netralisasi, karena bivalensi adalah penting untuk fungsi yang tepat [11]. Oleh karena itu, penelitian selanjutnya dengan mAb rekombinan turunan 2c jelas diperlukan untuk mengembangkan konstruksi antibodi yang sesuai untuk aplikasi topikal.
HSK telah terbukti memiliki asal immunopathological inflamasi [53]. Mekanisme yang tepat dimana antibodi monoklonal spesifik untuk HSV glikoprotein memberi efek protektif pada pengembangan HSK masih belum diketahui. Beberapa pengamatan menunjukkan bahwa antibodi mencegah penyakit kornea lebih efektif bila dibandingkan dengan antibodi non neutralizing [7]. Sebaliknya, penetral antibodi spesifik untuk glikoprotein D yang efektif mencegah HSK tidak berdampak signifikan pada beban virus di mata [43]. Antibodi diselidiki dalam penelitian ini secara efektif dinetralkan HSV-1 di mata. Hasil ini menunjukkan bahwa netralisasivirus sebenarnya bukan satu-satunya mekanisme yang terlibat dalam pencegahan penyakit kornea. Namun, penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa antibodi HSV-spesifik dapat melindungi terhadap HSK dengan menghambat produksi kemokin diyakini untuk meminisiasi inflamasirespon imun terhadap HSV [45]. Sesuai dengan temuan ini, keterbatasan sel infiltrasi ke kornea, pengurangan jumlah total sel dalam pengeringan,kelenjar getah bening mengurangi respon sel CD4 + T dan tingkat antibodi berkurang secara signifikan dalam cairan air mata dan sera tikus diobatisecara sistemik menunjukkan bahwa mAb 2c juga dapat melindungi dari HSK oleh penurunan yang signifikan dari respon imun. Kemungkinan besar, bertanggungjawab berkurangnyakekebalan merupakan konsekuensi dari netralisasivirus oleh mAb 2c. Khususnya, T-sel yang bertanggungjawabpada infeksiHSV-1 memainkan peran penting dalam inisiasi kerusakan jaringan dalam kornea. Neutrophiles dan monosit juga menyusup kornea dan terlibat dalam patogenisitas [30, 45]. Ada bukti substansial bahwa T limfosit-tipe 1 (Th1) terutama mensekresi interleukin 2 (IL-2) dan interferon (IFN) - bersifat patogen dalam evolusi penyakit kornea, karena netralisasi IL-2 dan IFN- hasil dari remisi pada HSK [36-38, 54]. Sebaliknya, Th2 sitokin terkait IL-4 dan IL-10 menekan perkembangan HSK [22].
Hal ini umumnya diterima bahwa pengembangan dan perkembangan HSK sangat tergantung pada frekuensi HSV reaktivasi [55, 56]. Antibodi menghambat penyebaran saraf melalui transmisi sel ke sel secara signifikan dapat mengurangi frekuensi reaktivasi dan dengandemikian memiliki dampak berkelanjutan pada munculnya HSK [56]. Meskipun mekanisme secara tepat dari transportasi DNA virus atau melepaskan dari akson masih belum diketahui, beberapa pengamatan juga menunjukkan bahwa antibodi bisa langsung mengganggu aksonal HSV-1 menyebar in vitro ke in vivo [57, 58]. Dalam penelitian ini kami menunjukkan bahwa mAb 2c dan kedua bagian manusia, baik yang mampu mengganggu transmisi sel ke sel antara sel-sel epitel dan neuron. Selain itu, kami menemukan bahwa pengobatanmAb 2c sistemik terbatas
pembentukan laten ke ganglion trigeminal ipsilateral, menunjukkan bahwa penyebaransaraf sepanjang serabut saraf ke ganglion kontralateral terputus. Akhirnya, pengobatan sistemik dengan antibodi mAbhu2c manusiadimediasi perlindungan yang sama dari pengembangan HSK jika dibandingkan dengan antibodi mencit. Hal ini berkorelasi dengan hasil dari studi sebelumnya di mana kedua antibodi menunjukkan aktivitas antiviral yang sama di bawah kondisi imunosupresi [11, 15].
Kesimpulannya, kami telah menunjukkan bahwa antibodi monoklonal mAb2 cefektif menetralkan isolat ACV resisten daripasien dengan sering infeksi berulang korneain vitro, dan mencegah perkembangan HSK pada tikus. Selain itu,varian mAbhu2c manusia mencegah perkembangan HSK dengan khasiat yang sama bila dibandingkan dengan antibodi orangtua. Fitur-fitur ini menjamin perkembangan klinis antibodi ini untuk pengobatan dan pencegahan, infeksi kornea yang resistan terhadap obat yang parah pada pasien.
