MAKALAH DISKUSI
PRAKTIKUM KROMATOGRAFI
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
PENETAPAN KADAR LAMOTRIGIN
LABORATORIUM KROMATOGRAFI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
2011
ABSTRAK
Tiga metode yang handal, cepat dan selektif telah dikembangkan dan divalidasi untuk penentuan lamotrigin di hadapan kenajisannya, 2,3-asam dichlorobenzoic. Metode pertama adalah metode spektrofotometri menggunakan asam p-chloranilic membentuk produk berwarna dengan λ maks 519±2 nm. Semua variabel yang mempengaruhi reaksi memiliki telah diselidiki dan kondisi yang dioptimalkan. Hukum Beer adalah dipatuhi selama rentang konsentrasi 10 -200µg/ml dengan akurasi rata-rata 100,13±0,44%. Rasio molar dari ion-asosiasi yang dibentuk kompleks ditemukan menjadi 1: 1 seperti yang disimpulkan dengan metode Job. Kondisi
stabilitas konstan (Kf), standar energi bebas, molar absorptivitas ( ), dan indeks sensitivitas
dievaluasi. Metode kedua adalah didasarkan pada pemisahan KLT dikutip dari obat (Rf = 0,75±0,01) dari kenajisannya (Rf = 0,23±0,01) diikuti dengan pengukuran densitometri dari utuh obat bintik-bintik pada 275 nm. Pemisahan dilakukan pada pelat silika gel menggunakan etil asetat: metanol:amonia 35% (17: 2: 1 v/v/v) sebagai fase gerak. Rentang Linearitas adalah 0,5-10µg / spot dengan akurasi rata-rata 99,99±1,33%. Metode ketiga adalah akurat dan sensitif stabilitas-menunjukkan HPLC metode yang didasarkan pada pemisahan lamotrigin dari pengotor pada kolom fase terbalik C18, menggunakan fase gerak asetonitril : metanol : 0.01M kalium orthophosphate (pH 6,7±0,1) (30: 20: 50 v / v / v) pada suhu ambien 25±5 ° C dan deteksi UV pada 275nm dalam waktu analisis keseluruhan dari sekitar 6 menit, berdasarkan pada daerah puncak.. Pengulangan injeksi, intraday dan interday pengulangan dihitung. Prosedur ini memberikan respon linier selama rentang konsentrasi 1-12µg/ml dengan akurasi, rata-rata 99,50±1,30%. Metode yang diusulkan telah berhasil diterapkan untuk penentuan dari lamotrigin dalam bubuk massal, dalam bentuk dosis dan di hadapan pengotornya. Hasil yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA untuk menilai bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara masing-masing tiga metode dan melaporkan satu. Validasi dilakukan sesuai dengan pedoman USP.
PENDAHULUAN
A. Tinjauan PustakaSaat ini Kromatografi Cair Kinerja Tinggi atau biasa juga disebut HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. KCKT dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Kegunaan umum KCKT adalah untuk : pemisahan sejumlah senyawa organic, anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidakmurnian (impurities), analisis senyawa-senyawa tidak mudah menguap (non volatil), penentuan molekul-molekul netral, ionic, maupun switter ion, isolasi dan pemurnian senyawa, pemisahan senyawa-senyawa yang strukturnya hampir sama, pemisahan senyawa-senyawa dalam jumlah sekelumit (trace element) dalam jumlah banyak, dan dalam skala proses industri.
KCKT merupakan metode tidak desktruktif dan dapat digunakan baik dalam analisis kualitatif maupun kuantitatif. Kromatografi merupakan teknik yang mana solute (zat terlarut) terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solute-solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Interaksi KCKT pada dasarnya terdiri atas 8 komponen pokok, yaitu : wadah fase gerak, system penghantaran fase gerak, alat untuk memasukkan sampel, kolom, detector, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung, suatu computer atau integrator atau penekan.
KCKT sangat cocok untuk memisahkan minyak atsiri dan kadang-kadang menunjukkan keuntungan yang berarti kesetimbangan metode kolom terbuka (kapiler) dan KG yang sekarang dipakai, pendadahan keudara minimum, hasil urai karena suhu tinggi dicegah, senyawa yang tidak atsiri dapat dipisahkan, dan laju perolehan kembali cuplikan tinggi. Akan tetapi, minyak atsiri sering terdiri atas campuran yang sangat rumit menjadi golongan-golongan senyawa atau memisahkan golongan senyawa menjadi komponennya.
(Hostettmann, 1995) Pada kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam dimeter. KCKT berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC menggunakan kolom dengan diameter kecil, 2-8mm dengan ukuran partikel penunjang penunjang 50mm, sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang tinggi.
(Khopkar, 1990) Terdapat 2 mode operasional HPLC yaitu mode isokratik dan metode gradient. Mode isokratik serupa dengan instrumental dalam KG, hanya dalam HPLC komposisi fase geraknya yang sama selama pengukuran berlangsung. Sebaliknya, dalam mode gradient komposisi fase gerak divisualisaikan selama pengukuran berlangsung.
(Hendayana, 2006) KCKT adalah suatu metode yang menggabungkan koefisien kolom dan kecepatan analisis. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fase gerak cairan dan fase diam cairan ataupun padat. Kelebihan KCKT antara lain dapat dilaksanakan pada suhu kamar, cepat dan mudah pelaksanaannya, peka dari detector KCKT dapat divariasi dan unik, pelarut pengembang dapat dipakai berulang kali demikian juga dengan kolomnya, ideal untuk molekul besar dan ion, mudah memperoleh cuplikan, daya pisahnya baik, dan dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis.
(Harbone, 1987) Berdasarkan sistem peralatannya maka HPLC termasuk kromatografi kolom karena dipakai pada fase diam yang terpacking dalam kolom sedangkan berdasarkan proses pemisahannya HPLC digolongkan sebagai kromatografi adsorbs dan partisi. Prinsip kromatografi partisi linarut antara 2 pelarut yang tidak bercampur yang ada pada fase diam dan fase gerak. Jika linarut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri dari dua pelarut yang tidak tercampur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang, linarut akan tersebar antara dua fase.
(Anonim, 1995)
B. Tujuan
1. Cara pemisahan dan identifikasi suatu senyawa (analisis kualitatif) dengan menggunakan
KCKT/HPLC
2. Penetapan kadar suatu senyawa (analisis kuantitatif) menggunakan KCKT
METODOLOGI
A. Alat dan BahanAlat : Gelas ukur Corong Kertas saring Pipet ukur Mikropipet
Mikrosyringe (syringe Hamilton)
Shimadzu UV / VIS spektrofotometer 1601
Labu ukur Split injector Bahan : asam 2,3-diklorobenzoic etil asetat metanol amonia asetonitril kalium orthophosphate 0,01M Lamotrigin Lamictal tablet Aseton Silika C-18
10 tablet ditimbang seksama dan digerus halus
Diambil 100mg lamotrigin dimasukkan dalam labu takar 100ml Dilarutkan dalam 50 ml aseton atau methanol
Larutan diaduk dengan pengaduk magnetic selama 10 menit Disaring dan diukur volumenya
Dilakukan replikasi tiga kali
C. Prosedur dan Sistem Kromatografi
Prosedur
Fase diam: silica C18
Fase gerak: campuran asetronitril:methanol:kalium ortophosfat 0,01M (pH 6,7±0,1 ) (30:20:50 v/v/v)
Deteksi: digunakan sebuah model 600LC pompa seri dan 600 kontroler unit,detector absorbansi uv 275 nm,745 modul data.
Flow rate : 1,5ml/min
Pengkondisian kolom 30 menit dilakukan pada suhu kamar 25±5˚C Volume injeksi 20µl
Pembuatan fase gerak
Dilakukan pencampuran asetonitril:Metanol:Kalium ortophosfat 0,01M (30:20:50 v/v/v) dengan pH 6,7±0,1
Disaring menggunakan membrane filter 0,45 µm Degassed dalam ultrasonic sebelum digunakan
Kalibrasi
Larutan baku 0,04mg/ml (setara dengan 0,01-0,12 mg lamotrigin) dipindah ke labu ukur, diadkan 10ml dengan fase gerak
Disuntikkan 20µl dari masing-masing konsentrasi
Dihitung daerah puncak rata-rata dan diplot terhadap konsentrasi Didapatkan persamaan regresi linier
Dilakukan Aplikasi tablet sesuai dengan preparasi sampel
HASIL PERCOBAAN
tabel 2. Hasil kesesuaian sistem HPLCTabel 1.Validasi laporan HPLC untuk penentuan lamotrigin Tabel 3. Penentuan kadar lamotrigin dalam campuran sintesis
PEMBAHASAN
Metode HPLC dikembangkan dan diterapkan untuk penentuan lamotrigin dengan campuran asam 2,3-dichlorobenzoic. Untuk mengoptimalkan HPLC dilakukan uji parameter,untuk komposisi fase gerak dan pH. Pemisahan yang memuaskan diperoleh dengan
fase gerak asetonitril: metanol: 0,01 M kalium orthophosphate pH 6,7 ±0,1 (30: 20: 50 v / v / v) menggunakan kolom C18 di suhu ruang. Analisis dilakukan oleh elusi isokratik dengan laju aliran 1,5 ml / menit dan dideteksi pada 275 nm (Gambar 6). Jangkauan linier 1-12µg ml-1 Diperoleh dengan akurasi rata-rata 99,50 ±1,30% seperti yg ditunjukkan pada Tabel 1. Tes kesesuaian sistem metode HPLC dievaluasi pada Tabel 2.
Hasil dalam (Tabel 4) menunjukkan tidak ada gangguan dari eksipien tablet seperti kalsium karbonat, hidroksipropil selulosa, aluminium magnesium silikat, povidone, natrium glikolat pati,sakarin natrium dan magnesium stearat. Selain itu, Asam 2,3-dichlorobenoic ditemukan kurang dari batas 0.2%.
KESIMPULAN
Metode HPLC dikembangkan dan diterapkan untuk penentuan lamotrigin dengan campuran
asam 2,3-dichlorobenzoic.
Ditemukan asam 2,3-diklorobenzoik kurang dari batas 0,2%
Diperoleh akurasi rata-rata lamotrigin 99,50 ±1,30%
DAFTAR PUSTAKA
LAPORAN PRAKTIKUM KROMATOGRAFI 2- ARNIS FARIDA 2010
Pendahuluan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya yaitu mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran, mudah melaksanakannya, kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi, dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis, resolusi yang baik, dapat digunakan bermacam-macam detektor, kolom dapat digunakan kembali, dan mudah melakukan “sample recovery” (Effendy 2004)
Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang
gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.
Natrium benzoat yaitu garam atau ester dari asam benzoat (C6H5COOH) secara komersial
pangan yang banyak menggunakan natrium benzoat sebagai pengawet adalah minuman ringan serta produk minuman yang terbuat dari buah. Berwarna putih, granula tanpa bau atau hampir bau, bubuk kristal atau serpihan. Lebih larut dalam air dibandingkan asam benzoat dan juga dapat larut dalam alkohol. Memiliki fungsi sebagai anti mikroba yang optimum pada pH 2.5-4.0, menghambat pertumbuhan kapang dan khamir (pengawet). Kalium sorbat adalah salah satu bahan pengawet makanan dan minuman, diturunkan sebagai garam potasium dari asam sorbat. Berat molekul kimia ini adalah 150,22 g / molekul. Nama ilmiah adalah kalium (E, E)-hexa-2 ,4-dienoate. Kalium sorbat digunakan untuk membatasi produksi ragi dan jamur dalam berbagai bahan makanan.
Tujuan
Praktikum bertujuan menentukan kadar zat pengawet natrium benzoat dan kalium sorbat dalam minuman isotonik dengan kromatografi cair kinerja tinggi.
Prosedur
Sampel minuman isotonik diencerkan 10 kali, sebanyak 2.5 ml sampel diambil dengan pipet ke dalam labu takar 25 ml dilakukan duplo. Sampel pertama tidak ditambahkan zat pengawet dan sampel kedua ditambahkan 5 ml natrium benzoat dan dipaskan sampai tanda tera dengan akuabides.
Standar natrium benzoat, kalium sorbat dan standar campuran natrium benzoat dan kalium sorbat dibuat dengan konsentrasi 20 ppm, masing-masing dari larutan standar induk 100 ppm diambil dengan pipet sebanyak 5 ml kedalam labu takar 25 ml dan dipaskan sampai tanda tera dengan akuabides.
Standar dan sampel dihilangkan gelembung dan pengotor dengan ultrasonic cleaner lalu disaring dengan membran filter 0.45 mikron. Selanjutnya diatur kondisi alat seperti fase gerak asam asetat dan asetonitril dengan perbandingan 60:40, laju alir yaitu 1 ml/menit, detektor UV 235 nm dan waktu analisis 12 menit. Kemudian sebanyak 25 µl diinjeksikan kedalam kromatografi cair kinerja tinggi.
Hasil pengamatan
Tabel 1 luas area natrium benzoat dan kalium sorbat
Senyawa Luas area Waktu retensi
Std. Na-Benzoat 7814296 10.693
Std. Kalium Sorbat 8779756 12.987
Sampel 1 Na-Benzoat 7017168 10.763
Sampel 2 Na-Benzoat 4421284 10.817
Sampel 2 kalium sorbat 5095097 13.167
Konsentrasi standar 30 ppm
Perbandingan luas area sampel 2 natrium benzoat : Perbandingan luas area sampel 2 kalium sorbat : Pembahasan
Penentuan kadar zat pengawet dalam minuman isotonik dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi. Zat pengawet seperti natrium benzoat dan kalium sorbat yang dapat
terkandung dalam minuman isotonik berguna untuk mempertahankan produk dari kerusakan dan bakteri serta kapang. Selain natrium benzoat dan kalium sorbat terdapat pula beberapa zat pengawet lain yang terkandung dalam makanan atau minuman seperti asam propionat, asam sorbat, belerang dioksida, etil p-hidroksi benzoat, kalium benzoat, kalium bisulfit, kalium nitrat, kalium nitrit, kalium propionat, kalium sulfit, kalsium benzoat, kalsium propionat, metil p-hidroksi benzoat, natrium bisulfit, natirum metabisulfit, natrium nitrat, natrium nitrit, natrium propionat, natrium sulfit, nisin, dan propil p-hidroksi benzoat (Mangku 2006). Percobaan tidak menggunakan deret standar, untuk menghitung konsentrasi zat pengawet dalam minuman isotonik dilakukan dengan perbandingan luas area. Luas area sampel dibandingkan dengan luas area standar dan dikalikan konsentrasi standar serta faktor
pengenceran sebesar 10 kali. Untuk sampel pertama tidak dilakukan penambahan standar dan untuk sampel 2 dilakukan penambahan standar atau adisi standar yaitu kedalam sampel dimasukkan sedikit standar dengan konsentrasi tertentu dengan maksud mengetahui
konsentrasi sampel sebenarnya. Namun dalam percobaan, pemisahan yang dihasilkan tidak baik. Puncak dari natrium benzoat dan kalium sorbat saling berdekatan karena panjang gelombang maksimum kedua zat tersebut saling berdekatan, natrium benzoat memiliki panjang gelombang maksimum pada 225 nm dan kalium sorbat pada 254 nm. Oleh karena itu digunakanlah data sekunder.
Dari data yang diperoleh, kadar zat pengawet natrium benzoat pada sampel 1 sebesar dengan persen bobot per volum yaitu yang artinya dalam 100 ml sampel terdapat 0.01 gram zat pengawet natrium benzoat. Persen ketepatan yang diperoleh sebesar 157.89%. Sampel 2 mengandung zat pengawet natrium benzoat dan kalium sorbat. Dari data yang diperoleh, kadar zat pengawet natrium benzoat pada sampel 2 sebesar dengan persen bobot per volum yaitu yang artinya dalam 100 ml sampel terdapat 0.01 gram zat pengawet natrium benzoat. Persen ketepatan yang diperoleh sebesar 52.63%. Selain natrium benzoat, sampel 2 juga mengandung zat pengawet kalium sorbat. Berdasarkan data yang diperoleh, kadar zat pengawet kalium sorbat pada sampel 2 sebesar dengan persen bobot per volum yaitu yang artinya dalam 100 ml sampel terdapat 0.01 gram zat pengawet kalium sorbat. Persen ketepatan yang diperoleh sebesar 45.45%. Persen ketepatan yang baik berkisar antara 70-130%.
Menurut Guru Besar Teknologi Pangan & Gizi IPB, Prof Made Astawan, menjelaskan natrium benzoat aman dikonsumsi jika kadarnya tidak melebihi 600 ppm. Sementara kalium sorbat aman dalam taraf di bawah 1.000 ppm (Elistiawaty 2006). Penggunaan maksimum K-sorbat dalam makanan berkisar antara 0,05 – 0,3 % untuk yang diaplikasikan langsung dan antara 10 – 20 % untuk yang disemprotkan atau diaplikasikan pada permukaan makanan (Lutfi 2009). Menurut Permenkes Nomor 722/Menkes/IX/88 tentang kadar aman bagi tubuh untuk mengasup kalium sorbat yakni 1.000 mg per liter dan natrium benzoat 600 mg per liter. Bila melebihi ambang batas bahan pengawet yang aman dikonsumsi manusia dapat
beresiko meninggal dunia (Mangku 2006).
Faktor-faktor yang dapat menjadi penyebab kesalahan antara lain, sampel masih terdapat pengotor sehingga pemisahan tidak baik. Pada sampel terdapat juga zat-zat lain yang
mempunyai waktu tambat yang berdekatan dengan waktu tambat natrium benzoat dan kalium sorbat, khusunya gula dan vitamin. Oleh karena itu, perlu dilakukan identifikasi puncak yang dihasilkan oleh sampel untuk memastikan bahwa puncak itu adalah puncak sampel yang dimaksud. Selain itu, sampel yang diinjeksikan tidak boleh ada gelembung karena gelembung dapat menganggu proses pemisahan.
Daftar Pustaka
Effendy. 2004. Jurnal Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi Jurusan Farmasi Fakultas Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sumatera Utara
Elistiawaty .2006. Natrium Benzoat dan Kalium Sorbat Aman Dikonsumsi (terhubung
berkala) www.detiknews.com (2 Apr 10)
Gritter. 1991. Pengantar Kromatografi. Bandung : penerbit ITB.
Lutfi Achmad. 2009. Kalium Sorbat (terhubung berkala) www.chem-is-try.com (1 Apr 10)
Mangku. 2006. Produk Minuman Isotonik Berpengawet (terhubung berkala)
