ABSTRAK
EFEK PEMBERIAN SARI BUAH MERAH (Pandanus conoideus Lam.) TERHADAP PENURUNAN KADAR IFN- SERUM MENCIT GALUR
Balb/C MODEL KANKER KOLOREKTAL
Messia P. Raharjo, 2010. Pembimbing I : Oeij Anindita Adhika, dr., M. Kes Pembimbing II : Hana Ratnawati, dr. , M. Kes
Inflammatory bowel disease (IBD) merupakan faktor risiko menjadi kanker kolorektal. IBD meliputi ulcerative colitis (UC) dan Crohn’s disease (CD). IBD merupakan peradangan kronik pada saluran cerna yang dapat memicu perubahan sel normal menjadi sel ganas, yang disebut colitis-associated cancer (CAC). CAC dipicu oleh peradangan kronik, dimana aktivasi mediator inflamasi salah satunya IFN-, suatu mediator proinflamasi, yang dapat menimbulkan perubahan genetik sel normal menjadi sel kanker.
Pengobatan alternatif dengan menggunakan buah merah (Pandanus conoideus Lam.) sudah lama dan banyak digunakan oleh masyarakat Indonesia, khususnya daerah Timur Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh buah merah dalam menurunkan kadar IFN-serum mencit.
Penelitian eksperimental uji preklinis ini menggunakan mencit galur Balb/C jantan dengan berat badan rata-rata 25 gram, yang dibagi menjadi 4 kelompok secara acak (n=7), yaitu kelompok I (kontrol negatif), kelompok II (kontrol positif BM), kelompok III (AOM 12 mg/kg BB dan DSS 2,5%), kelompok IV (AOM 12 mg/kg BB + DSS 2,5% + BM 0,1 mL). Perlakuan ini diberikan selama 68 hari. Pada hari ke – 69 serum mencit diambil, lalu kadar IFN- diukur dengan metode ELISA indirect. Hasil penelitian diuji dengan analisis varian (ANAVA), dilanjutkan post hoc metode Tuckey HSD dengan = 0,05.
Hasil penelitian menunjukkan kadar IFN-serum mencit kelompok IV (0,38 pg/L) berbeda sangat bermakna (p = 0,006) dengan kelompok III (7,44 pg/L) dan berbeda bermakna (p = 0,045) dengan kelompok I (2,14 pg/L) dan berbeda bermakna (p = 0,028) dengan kelompok II (1,71 pg/L).
Kesimpulan dari penelitian ini adalah sari buah merah menurunkan kadar IFN-serum mencit model kanker kolorektal.
ABSTRACT
THE EFFECT OF RED FRUIT OIL (Pandanus conoideus Lam.) TOWARDS IN DECREASING IFN- SERUM LEVEL IN
COLORECTAL CANCER MICE MODEL
Messia P. Raharjo, 2010. Tutor I : Oeij Anindita Adhika, dr., M. Kes Tutor II : Hana Ratnawati, dr. , M. Kes
Inflammatory bowel disease (IBD ) is a risk factor of colorectal cancer. IBD which includes ulcerative colitis(UC) and Crohn’s disease (CD). IBD is a chronic inflammation that could lead changes in normal cells become malignant, called colitis-assosiated cancer (CAC).CAC is stimulated when inflammation cytokine is activated, include IFN-, proinflammatory cytokine, lead to genetic alteration that induced changes in normal cells into malignant.
Alternative treament using red fruit (Pandanus conoideus Lam.) is already known in Indonesia, specially in Papua. This study aimed to examine the effects of red fruits in reducing serum IFN-mice.
Preclinical testing of this experimental research used Balb/C male mice with average weight is 25 grams, that randomly allocated to 4 groups (n=7) for 68 days: group I (negative control), group II (positive control with red fruit), group III ( AOM 12mg/kg + DSS 2,5%), and grup IV (AOM 12mg/kg + DSS 2,5% + BM 0,1 mL). Serum of mice at days 69 had taken then measured the level of IFN- with indirect ELISA. Results had been processed by analysis of variance (ANOVA), followed by Tuckey HSD Post Hoc methods with = 0,05.
Result showed serum levels of IFN-at group IV (0,38 pg/L) is highly significant different(p = 0,006) compared to group III (7,44 pg/L) and significantly different compared to group I (2,14 pg/L) and significanty different with group II (1,71 pg/L).
Conclusion of this research is red fruit reduce serum level of IFN- mouse model colorectal cancer.
DAFTAR ISI
JUDUL ...i
LEMBAR PERSETUJUAN...ii
SURAT PERNYATAAN ...iii
ABSTRAK ...iv
ABSTRACK...v
KATA PENGANTAR...vi
DAFTAR ISI...viii
DAFTAR TABEL...xi
DAFTAR GAMBAR...xii
BAB I PENDAHULUAN 1.1Latar Belakang...1
1.2Identifikasi Masalah...3
1.3Maksud dan Tujuan...3
1.3.1 Maksud...3
1.3.2 Tujuan...3
1.4Manfaat Karya Tulis Ilmiah...3
1.5Kerangka Pemikiran dan Hipotesis...4
1.5.1 Kerangka Pemikiran...4
1.5.2 Hipotesis...6
1.6Metodologi...6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1Anatomi Usus Besar...7
2.2Histologi Usus Besar...8
2.3IBD dan Kanker Kolorektal...9
2.5.1 Respon Imun Non-Spesifik...14
2.6.1 Interferon alpha (IFN-) dan Interferon beta (IFN-)...21
2.6.2 Interferon gamma (IFN-)...22
2.6.2.1Struktur Protein IFN- 2.6.2.2Transduksi Sinyal IFN- 2.6.2.3IFN- pada Hewan Coba Model Kanker Kolorektal...24
2.7Antioksidan...26
2.8 Buah Merah...27
2.8.1 Klasifikasi Buah Merah...28
2.8.2 Morfologi Buah Merah...28
2.8.3 Kandungan Kimia Buah Merah...28
2.8.4 Karoten dan Tokoferol...30
2.9Enzym Linked Immunosorbent Assay (ELISA)...31
BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan/Subjek Penelitian...35
3.1.1 Alat dan Bahan...35
3.1.2 Subjek Penelitian...36
3.1.3 Tempat dan Waktu Penelitian...36
3.2.4 Prosedur Kerja...39
3.2.4.1Pengumpulan Bahan...39
3.2.4.2Persiapan Bahan Uji...39
3.2.4.3Persiapan Hewan Coba...40
3.2.4.4Sterilisasi Alat...40
3.2.4.5Prosedur Penelitian...41
3.2.5 Metode Analisis...44
3.2.5.1Hipotesis Statistik...44
3.2.5.2 Kriteria Uji...44
3.2.6 Aspek Etik Penelitian...44
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Penelitian...45
4.1.1. Kadar IFN- Serum...45
4.1.2. Pengujian Statistik Pengaruh Sari Buah Merah Terhadap Kadar IFN- Serum Mencit Hari ke – 69...45
4.2. Pembahasan...47
4.3. Uji Hipotesis...49
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan...50
5.2 Saran...50
DAFTAR PUSTAKA...51
LAMPIRAN...56
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Kandungan senyawa Kimia Buah Merah ...29
Tabel 2.2 Kandungan Senyawa Aktif Buah Merah ...30
Tabel 4.1 Rerata Kadar IFN-g Serum Mencit Hari ke – 69...45
Tabel 4.2 Hasil uji ANAVA...46
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Anatomi Usus Besar...7
Gambar 2.2 Histologi Usus Besar...8
Gambar 2.3 Colitis associated colonic dysplasia and cancer...11
Gambar 2.4 Faktor-faktor molekul yang berperan dalam colitis asossiated colon cancer...12
Gambar 2.5 Klasifikasi sistem imun...14
Gambar 2.6 Sel pluripoten sistem imun...20
Gambar 2.7 Aktivitas inteferon sebagai agen antivirus...22
Gambar 2.8 Struktur protein IFN- Gambar 2.9 Ikatan IFN- dengan reseptor (IFNGR) pada protein17...23
Gambar 2.10 Transduksi sinyal IFN- Gambar 2.11 Buah merah asal Indonesia bagian Timur (Papua)...27
Gambar 2.12 Sari buah merah...31
Gambar 2.13 Direct ELISA...33
Gambar 2.14 Indirect ELISA...34
Gambar 3.1 Bagan pemberian aquadest dan buah merah pada kelompok kontrol negatif (KN) dan kontrol positif (KP)...42
Gambar 3.2 Bagan pemberian AOM, DSS, buah merah dan aquadest pada kelompok kontrol positif AOM dan DSS (AOM+DSS) dan kelompok perlakuan...42
LAMPIRAN
Lampiran 1
Perhitungan statistik SPSS 17.0
Lampiran 2 Jadi setiap mencit disuntik 0,4 mL yang mengandung 0,24 mg AOM.
Stok [AOM] = 1 gram / mL
Untuk pembuatan 0,24 mg AOM / 400 μL sebanyak 10 mL maka dibutuhkan AOM dari stok sebanyak :
L
AOM yang ditambahkan untuk mencit 20 gram = 6 μL AOM yang ditambahkan untuk mencit 24 gram = 7,2 μL
Dosis dextran sulfate sodium (DSS)
Garam DSS yang dipakai adalah 2,5 g dilarutkan dengan aquadest 100 mL sehingga didapatkan larutan DSS 2,5%.
Lampiran 3
Alat dan Bahan yang Digunakan
Kandang mencit
Sonde lambung dan spuit 1cc
Sonde buah merah Alat sentrifuga
Riwayat Hidup
Nama : Messia Paramita
NRP : 0710014
Agama : Kristen Protestan
Tempat / Tanggal Lahir :Bogor / 25 Desember 1988
Alamat : Jl. Prof. Drg. Suria sumantri no. 68A Riwayat Pendidikan :
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kanker kolorektal merupakan kanker tersering kedua di negara–negara barat, dan menyebabkan 55.000 kematian penduduk Amerika Serikat pada tahun 2005 (Gommeaux et al., 2007). Inflammatory bowel disease (IBD), baik ulcerative colitis (UC) maupun Crohn’s disease (CD) merupakan faktor risiko tinggi yang memicu kanker kolorektal dan sekitar 5% kasus UC akan berkembang menjadi kanker kolorektal (Itzkowitz and Yio, 2004; Meira et al., 2008).
Hubungan antara UC dengan kanker kolorektal telah diteliti pada hewan model untuk mendapatkan pengetahuan yang lebih baik tentang colitis-associated cancer. Pada penelitian Burstein dan Fearon menggunakan hewan model yang
diinjeksi azoxymethane (AOM), suatu prokarsinogen kolon, dilanjutkan dengan pemberian dextran sulfate sodium (DSS) didapatkan hampir 100% mencit menderita neoplasma kolon (Burstein dan Fearon, 2008; Tanaka, 2009).
Inflamasi aktif merangsang aktivasi sistem imun spesifik dan nonspesifik (Hussain and Harris, 2007). Leukosit dan sel fagositik akan mengekskresikan sitokin dan kemokin proinflamasi, seperti IFN- , faktor pertumbuhan, dan matrix-degrading enzym, yang berpengaruh terhadap homeostasis sel normal. Sel
inflamasi juga melepaskan reactive oxygen species (ROS) dan reactive nitrogen species (RNS) yang memicu terjadinya stres oksidatif (Gommeaux et al., 2007).
Pada sel yang sedang berproliferasi, lesi oksidatif DNA akan menginduksi mutasi onkogen pada gen supresor tumor, seperti p53. Dengan demikian, ROS dan RNS berperan dalam onkogenesis dengan mempengaruhi proliferasi dan apoptosis sel. Pada IBD, yang merupakan proses inflamasi kronik, stres oksidatif dan lesi oksidatif DNA merupakan faktor penting dalam patogenesis terjadinya karsinoma kolorektal (Gommeaux et al., 2007).
mengekskresikan mediator proinflamasi seperti IFN- . Aktivitas IFN- diinduksi oleh CD4+ T helper cell type 1 (Th1) lymphocytes, CD8+ cytotoxic lymphocytes, dan NK cells. Sumber utama produksi IFN- adalah limfosit T, lalu APC profesional, serta aktivitas dari sel yang terinfeksi dan sekitarnya (Jonasch, 2001; Frucht, 2001).
Buah merah telah lama dipercaya sebagai salah satu alternatif pengobatan kanker yang semakin banyak digunakan oleh masyarakat (Irma dan Gilang, 2005). Buah merah dipercaya mengandung beberapa zat yang berfungsi meningkatkan sistem kekebalan tubuh dan menangkal radikal bebas penyebab kanker dalam tubuh (Lee et al,. 2004; I Made Budi, 2005). Buah merah merupakan sumber antioksidan eksogen yang banyak mengandung -karoten, -cryptoxantin, dan
-tokoferol. Secara empiris, khasiat buah merah sudah banyak terbukti tapi penelitian secara in vivo dan in vitro belum banyak dilakukan. Omega 3 yang terkandung dalam buah merah juga berfungsi memperbaiki jaringan sel yang rusak (I Made Budi, 2005; Machmud Yahya dan Bernard Wahyu Wiryanta, 2005; Ingrid Surono et al., 2008).
Banyak penelitian yang dilakukan pada mencit untuk membuktikan khasiat buah merah sebagai antiinflamasi. Penelitian yang dilakukan oleh Ninik Mudjihartini, dkk dengan menggunakan tikus Sprague jantan yang diberi minyak buah merah menunjukkan bahwa dosis buah merah 0,231 mL/200gram BB menurunkan jumlah leukosit secara bermakna. Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa pemberian sari buah merah sebanyak 0,1 mL/hari selama 15 hari menyebabkan peningkatan proliferasi limfosit dan terjadi penurunan kadar IFN- pada mencit yang diinokulasi dengan Listeria monocytogenes (Hana Ratnawati dkk., 2008; Khie Khiong dkk., 2009).
Pada penelitian lain, terbukti bahwa khasiat dari buah merah dapat digunakan untuk menghambat karsinogenesis pada tikus yang diinduksi DMBA (7,12-dimetilbenz(a)antrasen) (Cheng et al., 2003; Constantinou et al., 2003).
Berdasarkan hal–hal tersebut, peneliti ingin mempelajari efek sari buah merah terhadap kadar IFN- pada mencit model kanker kolorektal.
1.2 Identifikasi Masalah
Apakah sari buah merah menurunkan kadar IFN- serum mencit model kanker kolorektal.
1.3 Maksud dan Tujuan
1.3.1 Maksud
Maksud dari penelitian ini adalah untuk mengetahui khasiat sari buah merah sebagai terapi alternatif untuk kanker kolorektal.
1.3.2 Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek pemberian sari buah merah terhadap penurunan kadar IFN- serum mencit model kanker kolorektal.
1.4 Manfaat Karya Tulis Ilmiah
Manfaat akademis penelitian ini adalah untuk memberikan tambahan informasi dan wawasan mengenai tanaman asli Indonesia, khususnya buah merah dalam menghambat colitis-related cancer (CRC).
1.5 Kerangka Pemikiran dan Hipotesis
1.5.1 Kerangka Pemikiran
Karsinogenenesis dapat dibagi menjadi tiga tahap, yaitu inisiasi, promosi, dan progresi. Pada fase inisiasi, terjadi kerusakan DNA berupa mutasi akibat bahan kimia, karsinogen fisik, atau stres oksidatif yang menyebabkan aktivasi onkogen atau inaktivasi gen supresor tumor, seperti gen yang mengode KRAS atau p53. Pada fase promosi, terjadi ekspansi klonal sel inisial, dimana terjadi peningkatan proliferasi dan penurunan kematian sel. Selanjutnya, invasi dan metastasis serta peningkatan masa tumor merupakan karakteristik fase progresi. Imunitas dan inflamasi dapat mempengaruhi ketiga proses ini melalui aktivasi sel-sel radang dan produksi sitokin-sitokin, faktor pertumbuhan, dan matrix metalloproteinases (MMPs), yang akhirnya meningkatkan proliferasi, invasi, dan metastasis sel tumor (Karin dan Greten, 2005).
Ulcerative colitis dan CD, memiliki patogenesis yang dipengaruhi oleh faktor
genetik, lingkungan dan imun. Pada kanker kolorektal terjadi perubahan pada onkogen maupun pada gen supresor tumor. Kedua gen ini berefek pada pertumbuhan tumor dengan kemampuannya untuk mengatur proliferasi dan apoptosis sel (Kumar et al., 2007).
Pemberian dextran sulfate sodium (DSS) dapat menginduksi terjadinya UC pada mencit melalui toksisitas langsung terhadap epitel kolon, peningkatan permeabilitas membran sel, dan aktivasi makrofag (Kim et al., 2006; Tanaka, 2009). DSS juga menyebabkan kerusakan barier usus, sehingga makrofag di lamina propria dapat berinteraksi dengan bakteri usus. Pemakaian DSS jangka panjang dapat menimbulkan karsinoma kolon (Popivanova et al., 2008). Azoxymethane (AOM) merupakan suatu prokarsinogen dengan struktur yang
menyerupai cycasin, komponen natural kuat yang dapat menginduksi tumor di kolon dan rektum pada manusia dan hewan (Gommeaux et al., 2007).
kolon bagian distal hewan pengerat, sehingga AOM sering digunakan sebagai protokol kanker kolorektal untuk mencari dan skrining pengobatan yang potensial. DSS merupakan agen kimia toksik yang secara luas digunakan untuk model eksperimental IBD (Gommeaux et al., 2007).
Interferon merupakan mediator yang teraktivasi pada saat terjadi infeksi. Terdapat 2 kelompok inferferon yaitu IFN I (IFN-α dan ) dan IFN II (IFN- ). IFN I memilki fungsi utama sebagai imunomodulator dan agen antiviral, sedangkan IFN II berperan dalam mengatur respon imun tubuh, dengan meningkatkan ekspresi molekul MHC-II pada antigen presenting cell (APC) yang akan meningkatkan presentasi antigen pada sel T helper dan mengaktifkan kemampuan makrofag untuk fagositosis dan membunuh sel lain yang terinfeksi (Hunt, 2006).
Pada IBD yang merupakan proses inflamasi kronik, terjadi akumulasi stres oksidatif dan kerusakan sel oksidatif yang meningkatkan kadar ROS dan RNS sehingga menginduksi terjadinya onkogenesis dengan mengubah proliferasi sel dan kematian sel (Gommeaux et al., 2007). ROS dan RNS yang berlebihan dapat memicu perubahan proses biologi dalam sel, sehingga mengganggu fungsi homeostasis normal, dan menimbulkan ketidakstabilan genom yang mengakibatkan karsinogenesis (Hussain and Harris, 2007).
Buah merah merupakan salah satu tanaman obat yang banyak dijumpai di Papua dan sedang dikembangkan sebagai obat alternatif untuk berbagai macam pengobatan, termasuk kanker. Kandungan buah merah antara lain beta-karoten, alfa-tokoferol, vitamin C, vitamin B1, dan asam lemak esensial seperti asam oleat, asam linoleat, dan asam dekanoat. Karotenoid dan tokoferol merupakan senyawa alami yang berefek sangat baik sebagai antioksidan dan berfungsi mencegah pembiakan sel–sel kanker (Bernard T, 2005). Kadar anti oksidan yang tinggi
dalam buah merah terutama -karoten dan α-tokoferol, diharapkan dapat
menghambat reaksi inflamasi sehingga dapat menurunkan kadar IFN- pada mencit model kanker kolorektal yang diberi sari buah merah.
Vitamin A dalam bentuk asam retinoat mengaktifkan sel T yang dapat menginduksi ekspresi integrin α4 7 dan reseptor kemokin CCR9 yang akan
berinteraksi dengan molekul pada usus halus dan merekrut sel T ke daerah tersebut (Lindbom and Agace, 2004).
Berdasarkan penelitian sebelumnya, diketahui bahwa pemberian sari buah merah dengan dosis 0,2 mL pada mencit model kolitis dapat meningkatkan jumlah limfosit pada mencit terutama proliferasi sel leukosit non T, tapi pada dosis yang tidak sesuai buah merah dapat menurunkan jumlah limfosit. Maka dari itu, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui apakah buah merah yang memiliki kadar antioksidan tinggi dapat menghambat proses inflamasi–karsinogenik pada mencit yang diinduksi kanker kolorektal dengan AOM dan DSS dengan parameter IFN- .
1.5.2 Hipotesis
Sari buah merah menurunkan kadar IFN- serum pada mencit model kanker kolorektal.
1.6 Metodologi
Metode penelitian yang digunakan adalah prospektif eksperimental laboratorium sungguhan, bersifat komparatif dengan rancangan acak lengkap (RAL). Parameter yang diukur adalah kadar IFN- serum mencit dengan menggunakan metode ELISA .
Data dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji Analisis Varian
(ANAVA) satu arah dengan α = 0,05 dan dilanjutkan uji beda rata – rata Tukey
BAB III
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1 Alat dan Bahan/Subjek Penelitian
3.1.1 Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan :
- Sarung tangan
- Sonde lambung (gavage) - Alat penindik telinga mencit
- Neraca analitis (CHQ electronic balance DJ 1002BH 1000 gr/0.01 gr) - Jarum suntik 25G
- Syringe 1 cc (Terumo)
- Tabung mikrosentrifuga 1,5 mL - Sentrifuga (Genofuge)
- Mikropipet 1 – 10 L (EPPENDORF) - Mikropipet 10 – 100 L (EPPENDORF) - Mikropipet 200 – 1000 L (GILSON) - White tip
- Yellow tip
- Blue tip
- Tabung Falcon 15 mL - Tabung Falcon 50 mL - Rak tabung Falcon 15 ml - 96 wells plate
- Botol Duran berulir 600 mL - Autoklaf (KSG Olching, KS-9)
- Inkubator goyang/Shaking Incubator (HEIDOLPH UNIMAX 1010 &
Bahan-bahan yang digunakan :
- Azoxymethane (AOM) (Sigma – A2853 – 100 mg) - Dextan sulfate sodium (DSS) (AMRESCO – 0198 – 50 g) - Alkohol 70 %
- Aquadest
- Aquabidest steril IPHA laboratorium
- Sari buah merah
- IFN- ’s ELISA Kit (R&D Lot 260372) yang terdiri dari :
Mouse IFN-γ Standard
Calibrator Diluent RD1 – 12
Assay Diluent RD1 – 21
Wash Buffer Concentrate
Mouse IFN-γ Conjugate
Color Reagent A
Color Reagent B
Stop Solution
3.1.2 Subjek penelitian
Subjek penelitian yang digunakan adalah 28 mencit galur Balb/C jantan, berumur 8 minggu dengan berat badan rata-rata 25 gram yang diperoleh dari Bagian Pemeliharaan dan Penelitian Hewan Coba, Pusat Penelitian Ilmu Kedokteran (PPIK) Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha, Bandung.
3.1.3 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Pusat Penelitian Ilmu Kedokteran (PPIK), Fakultas Kedokteran, Universitas Kristen Maranatha, Bandung.
3.2Metode Penelitian
3.2.1 Disain Penelitian
Penelitian ini bersifat prospektif eksperimental laboratorium sungguhan dengan rancangan acak lengkap (RAL), bersifat komparatif. Mencit dibagi dalam 4 kelompok secara acak, masing-masing kelompok terdiri dari 7 ekor mencit.
3.2.2 Variabel Penelitian
3.2.2.1Definisi Konsepsional Variabel
Variabel terkendali :
- galur mencit
- jenis kelamin mencit - umur mencit
- barat badan mencit - cara pemeliharaan - waktu perlakuan
Variabel perlakuan :
- AOM 12 mg/kg BB - DSS 2,5%
- sari buah merah 0,1mL/hari - aquabidest 0,1mL/hari
3.2.2.2Definisi Operasional Variabel
Mencit model kanker kolorektal: mencit yang diinjeksi azoxymethane (AOM) 12 mg/kgBB secara intraperitoneal dosis tunggal pada hari ke-1 dan diberi dextran sulfate sodium (DSS) 2,5% (w/v) pada hari ke-6 sampai hari ke-10, hari ke-27
sampai hari ke-31, dan hari ke-48 sampai hari ke-52. Galur mencit: Balb/C.
Jenis kelamin mencit: jantan. Umur mencit: 8 minggu.
Cara pemeliharaan: diberi makan pelet dan minum aquadest ad libitum.
Waktu perlakuan: sari buah merah atau aquabidest 0,1 mL/hari diberikan setiap hari pada pukul 13.00 WIB.
AOM 12 mg/kgBB (0,4 mL) dosis tunggal disuntikkan secara intraperitoneal pada hari ke-1.
DSS 2,5% (w/v) diberikan melalui air minum (ad libitum) pada hari ke-6 sampai hari ke-10, hari ke-27 sampai hari ke-31, dan hari ke-48 sampai hari ke-52.
Sari buah merah atau aquabidest 0,1 ml/hari diberikan per oral menggunakan sonde lambung pada hari ke-11 sampai hari ke-26, hari ke-32 sampai hari ke-47, dan hari ke-53 sampai hari ke-68.
Pengambilan serum: pada hari ke-69 semua mencit diambil darahnya melalui vena retroorbital, kemudian disentrifuga dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya supernatan (serum) diambil dan disimpan pada suhu −20 C.
Kadar IFN- dalam serum mencit diukur dengan metode ELISA.
3.2.3 Perhitungan Besar Sampel
(t - 1) (r - 1) ≥ 15 (4 - 1) (r - 1) ≥ 15
3 (r - 1) ≥ 15 (r –1) ≥ 5 r ≥ 6
Jadi bila n=6 telah memenuhi syarat di atas. t = treatment/perlakuan
r = replacement/perulangan
mempertimbangkan drop out (DO) 20%, dilakukan penambahan 1 ekor mencit pada masing-masing kelompok sehingga jumlah mencit yang digunakan sebanyak 28 ekor (n=7).
3.2.4 Prosedur Kerja
3.2.4.1Pengumpulan Bahan
- Buah merah (Pandanus conoideus Lam.) kultivar merah panjang, segar,
dan berwarna merah terang, berasal dari Wamena, Papua, Irian Jaya.
- Azoxymethane (AOM) Sigma – A2853 – 100 mg - Dextran sulfate sodium (DSS) AMRESCO – 0198 – 50 g
3.2.4.2Persiapan Bahan Uji
Bahan uji yang digunakan adalah buah merah. Pembuatan sari buah merah ini dilakukan di Laboratorium Farmakognostik Sekolah Farmasi, ITB, Bandung, dengan prosedur sebagai berikut :
1. Buah merah dipotong-potong dan dicuci sampai bersih
2. Selanjutnya buah dikukus dan dipisahkan dari mesokarpnya, kemudian diperas hingga diperoleh pasta berwarna merah.
4. Bagian minyak dipisahkan dari bagian airnya, kemudian dibiarkan selama 24 jam sampai terdapat sisa pasta yang mengendap.
5. Selanjutnya bagian minyak dipisahkan dari pasta yang mengendap, lalu dipanaskan kembali pada suhu di bawah 400C.
6. Sari buah merah disimpan di lemari pendingin pada suhu 40C. Sebelum dimulai perlakuan, sari buah merah terlebih dahulu dibiarkan dalam suhu ruangan selama beberapa saat.
3.2.4.3Persiapan Hewan Coba
Mencit yang sudah ditindik dan diadaptasikan dibagi menjadi 4 kelompok secara acak menggunakan undian. Masing-masing kelompok terdiri dari 7 ekor mencit yaitu kelompok kontrol negatif (aquabidest 0,4 ml intraperitoneal, aquadest ad libitum, aquabidest 0,1 ml per oral), kelompok kontrol positif buah
merah (aquabidest 0,4 ml intraperitoneal, aquadest ad libitum, sari buah merah 0,1 ml per oral), kelompok kontrol positif AOM dan DSS (AOM 12 mg/kgBB intraperitoneal, DSS 2,5% (w/v) ad libitum, dan aquabidest 0,1 ml per oral), dan kelompok perlakuan (AOM 12 mg/kgBB intraperitoneal, DSS 2,5% (w/v) ad libitum, dan sari buah merah 0,1 ml per oral).
3.2.4.4Sterilisasi Alat
3.2.4.5Prosedur Penelitian
Kelompok mencit mendapatkan perlakuan sebagai berikut :
1. Kelompok kontrol negatif: masing-masing mencit disuntik 0,4 ml aquabidest dosis tunggal secara intraperitoneal. Pada hari ke-6 diberikan aquadest ad libitum selama 5 hari, dilanjutkan dengan pemberian aquabidest per oral 0,1 ml/hari menggunakan sonde lambung selama 16 hari. Siklus pemberian aquadest ad libitum dan aquabidest per oral diulang 2 kali.
2. Kelompok kontrol positif buah merah: masing-masing mencit disuntik 0,4 ml aquabidest dosis tunggal secara intraperitoneal. Pada hari ke-6 diberikan aquadest
ad libitum selama 5 hari, dilanjutkan dengan pemberian sari buah merah per oral
0,1 ml/hari menggunakan sonde lambung selama 16 hari. Siklus pemberian aquadest ad libitum dan sari buah merah per oral diulang 2 kali.
3. Untuk kelompok kontrol positif AOM dan DSS, masing-masing mencit disuntikkan AOM 12 mg/kgBB (0,4 ml) dosis tunggal secara intraperitoneal, pada hari ke-6 diberikan DSS 2,5% (w/v) ad libitum selama 5 hari, dilanjutkan dengan pemberian aquabidest per oral 0,1 ml/hari menggunakan sonde lambung selama 16 hari. Siklus pemberian DSS dan aquabidest diulang sebanyak 2 kali.
4. Untuk kelompok perlakuan, masing-masing mencit disuntikkan AOM 12 mg/kgBB (0,4 ml) dosis tunggal secara intraperitoneal, pada hari ke-6 diberikan DSS 2,5% (w/v) ad libitum selama 5 hari, dilanjutkan dengan pemberian sari buah merah per oral 0,1 ml/hari menggunakan sonde lambung selama 16 hari. Siklus pemberian DSS dan sari buah merah diulang sebanyak 2 kali.
Gambar 3.1 Bagan pemberian aquadest dan buah merah pada kelompok kontrol negatif (KN) dan kontrol positif (KP).
Gambar 3.2 Bagan pemberian AOM, DSS, buah merah dan aquadest pada kelompok kontrol positif AOM dan DSS (AOM+DSS) dan kelompok perlakuan.
Prosedur ELISA IFN-γ
1. Reagents, sampel dan larutan standar disiapkan. 2. Sampel berupa serum mencit.
3. Larutan standar dibuat dengan susunan sebagai berikut : Tabung 1 (3000 pg/ml) : 200 l mouse IFN-γ standard
100 l larutan Tabung 2
Tabung 4 (75 pg/ml) : 200 l calibrator diluent RD6 – 12 ditambah 100 l larutan Tabung 3
Tabung 5 (37,5 pg/ml) : 200 l calibrator diluent RD6 – 12 ditambah 100 l larutan Tabung 4
Tabung 6 (9,4 pg/ml) : 200 l calibrator diluent RD6 – 12 ditambah 100 l larutan Tabung 5
Tabung 7 : 200 l calibrator diluent RD6 – 12 ditambah 100 l larutan Tabung 5
Tabung 8 (0 pg/ml) : 200 l calibrator diluent RD6 – 12 4. 50 l Assay diluent RDI – 21 dimasukkan kedalam tiap sumur.
5. Kemudian ditambahkan 50 l larutan standar dan sampel ke dalam setiap sumur, inkubasi selama 2 jam dalam suhu ruang.
6. Larutan dibuang kemudian dicuci sebanyak 5 kali dengan menggunakan wash buffer yang telah diencerkan dalam 600 ml aquadest steril.
7. 100 l mouse IFN-γ conjugate dimasukkan ke dalam tiap sumur, inkubasi selama 2 jam dalam suhu ruang.
8. Larutan dibuang kemudian dicuci sebanyak 5 kali dengan menggunakan wash buffer yang telah diencerkan dalam 600 ml aquadest steril.
9. 100 l substrate solution (campuran colour reagent A dan colour reagent B dengan perbandingan 1:1) dimasukkan ke dalam tiap sumur, inkubasi selama 30 jam dalam suhu ruang.
10.Kemudian tambahkan 100 l stop solution ke dalam setiap sumur.
3.2.5 Metode Analisis
Parameter yang diukur adalah kadar IFN- dalam tiap sumur yang diamati dan dianalisis kadarnya dengan cara dibandingkan dengan kurva standar yang telah diketahui konsentrasinya. Analisis dilakukan dengan menggunakan Analisis Varian (ANAVA) satu arah dengan α = 0,05, dilanjutkan dengan Post Hoc Tukey-HSD dengan tingkat kepercayaan 95%, tingkat kemaknaan berdasarkan nilai p ≤
0,05
3.2.5.1Hipotesis Statistik
H0 =
Tidak ada perbedaan rerata kadar IFN- serum antar kelompok perlakuan. HA = ≠ ≠ ≠
Sedikitnya ada perbedaan rerata kadar IFN- serum pada sepasang kelompok perlakuan.
3.2.5.2Kriteria Uji
Diterima atau tidaknya H0 /HA ditentukan berdasarkan kriteria uji sebagai berikut:
Jika Fhitung Ftabel dan p > 0,05 maka H0 gagal ditolak.
Jika Fhitung > Ftabel dan p 0,05 maka H0 ditolak, terima hal lainnya.
3.2.6 Aspek Etik Penelitian
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Sari buah merah (Pandanus conoideus Lam.) dosis 0,1 mL per hari menurunkan kadar IFN- serum mencit model kanker kolorektal.
5.2 Saran
Penelitian ini merupakan penelitian tahap awal yang perlu dilanjutkan dengan berbagai penelitian lain. Saran untuk penelitian lanjutannya adalah :
Dosis efektif buah merah sebagai antioksidan yang mampu menekan inflamasi yang berhubungan dengan kanker kolorektal.
DAFTAR PUSTAKA
Abbas, A. K., Lichtman, A. H. , Pober, J. S. 2001. Cellular and molecular immunology. Philadelphia: WE Saunders Company.
Azzi, A., Stocker, A. 2000. Vitamin E : non-antioxidant roles. Prog. Lipid Res,39: 231-55.
Balkwill, F., Mantovanni. 2001. Inflammation and cancer : back to Virchow? Lancet, 357 : 539-45.
Bernard T. Wahyu Wiryanta. 2005. Keajaiban Buah Merah Kesaksian Dari Mereka yang Tersembuhkan. Jakarta : AgroMradia Pustaka.
Burstein E., Fearon E.R. 2008. Colitis and cancer: a tale of inflammatory cells and their cytokines. J Clin Invest, 118(2): 464-7.
Cheng J.L., Fatakuchi M., Ogawa K., Iwata T.,Kasai M., Tokudome S., et al. 2003. Dose response study of conjugated fatty acid derived from safflower oil on mammary and colon carcinogenesis pretreated with 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA) and 1,2-dimethylhydrazine (DMH) in female Sprague-Dawley rats. Cancer letter 196 :161-8
Constantinou A.I.,Mehta R., Husband A. 2003. Phenoxodiol, a novel isoflavone derivative, inhibits 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)-induced mammary carcinogenesis in female Sprague-Dawley rats. European Jornal of Cancer 39 :1012-8Depkes. 2006. Deteksi Dini Kanker Usus Besar, (Online), (http://www.litbang.depkes.go.id/aktual/kliping/KankerUsus011106.htm, diakses 13 desember 2006).
Croether, J. R. 1995. ELISA Theory and Practice.vol.42. New Jersey : Humana Press.
Davidson College. 2006. Human Interferon gamma ( IFN-g). www.bio.davidson.edu. 5 September 2008.
Depkes. 2006. Gaya hidup penyebab kolorektol, (Online), (http://www.depkes.go.id/index.php?option=news&task=viewarticle&sid=205 8&Itemid=2, diakses 13 desember 2006).
Drake R.L., Vogl W., Mitchell A.W.M. 2007. Gray’s anatomy for student. Philadelphia: Elsevier Inc. p. 279-283.
Frederico A., Morgillo F., Tuccillo C., Ciardiello F., Loguercio C. 2007. Chronic inflammation and oxidative stress in human carcinogenesis. Int. J. Cancer: 121: 2381-6.
Flaishon, L., Hershkoviz, R., Lantner, F., Lider, O., Alon, R., Levo, Y., et al. 2000. Autocrine secretion of interferon gamma negatively regulates homing of immatureB cells. J. Exp. Med, 192 : 1381-8.
Frucht, D. M., Fukao, T. Bogdan, C., Schindler, H., O’Shea, J. J., Koyasu, S. 2001. IFN-gamma production by antigen-presenting cells : mechanism emerge. Trends Imunnol, 22 : 556-60.
Gartner, L. P., Hiatt, J. I. 2001. Color textbook of Histology.2nd ed. Philadelphia : Elsevier.
Golab, J., Zagozdzon S. T., Kaminski, R., Kozar, K., Jakobisisk, M. 2000. Direct stimulation of macrpohages by IL-12 and IL-8-a bridge too far? Immuno. Lett., 72 : 153-7.
Gommeaux J., Cano C., Garcia S., Gironella M., Pietri S., Culcasi M., et al. 2007. Colitis and colitis-associated cancer are exacerbated in mice deficient for tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Mol Cell Biol, 27(6): 2215-28.
Greten F.R., Eckmann L., Greten T.F., et al. 2004. IKK links inflammation and tumorigenesis in a mouse model of colitis-associated cancer. Cell, 118:285-296.
Hana Ratnawati, Khie Khiong, Sylvia Soeng, Sri Utami Sugeng, Evan Kristiono, Shella Hudaya. 2008. Pengaruh Ekstrak Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.) terhadap Berat Limpa, Jumlah dan Proliferasi Limfosit pada Mencit Jantan Galur Swiss-Webster yang Diinokulasi Listeria monocytogenes. Disampaikan dalam KONAS XII dan PIN PAAI (Perhimpunan Ahli Anatomi Indonesia) Jakarta, 20-21 Juni 2008.
Hunt, M. 2006. http://pathmicro.med.sc.edu/mhunt/interferon/htm. 1 September 2008.
Harris, D.P., Haynes, L., Sayles, P. C., Duso, D. K., Eaton, S. M., Lepak, N. M., et al. Reciprocal regulation of polarized cytokine production by effector B and T cells. Nature Immunology, 1 : 475-82.
Hussain, S. P., Harris, C. C. 2007. Inflammation and cancer : an ancient link with novel potentials. International Journal Cancer, 121 : 2373-80.
Inggrid Surono, Nishigaki, T., Anang Endaryanto, Priyo Waspodo. 2008. Indonesian Biodiversities, from Microbes to Herbal Plants as Potential Functional Foods.Shinshu Daigaku Nogakubu Kiyo, 44(1-2): 23-27.
Irma & Gilang. 2005. Tanaman Obat untuk Penderita Kanker. www.pdpersi.co.id.
Itzkowitz, S. H., Yio, X. 2004. Inflammation and cancer : Colorectal cancer in inflammatory bowel disease : the role of inflammation. Am. J. Gastrointest. Liver Physiol, 287 : 7-17.
Jonasch, E., Haluska, F. G. 2001. Interferon in oncological practice : review of interferon biology, clinical applications, toxicities. Oncologist, 6 : 34-55. Karin M., Greten F.R. 2005. NF- B linking inflammation and immunity to cancer
development and progression. Nature Rev Immunol, 5: 749-759.
Karnen, G. B. 2004. Imunologi Dasar.ed.6. Jakarta : Balai Penerbit FK UI.
Kraner, I., Birtic, S. 2005. A Modulating Role for Antioxidants in Desiccation Tolerance. Integr. Comp. Biol, 45 : 734-40.
Kemas Ali Hanafiah. 2000. Rancangan percobaan: teori dan aplikasi. Jakarta: Raja Grafindo Persada. Hal: 6-7.
Khie Khiong, Hana Ratnawati, Sylvia Soeng, Shella Hudaya, Griselda. 2009. Pengaruh Buah Merah terhadap Proliferasi Limfosit dan Kadar IFN- pada Mencit yang Diinokulasi dengan Listeria monocytogenes. Simposium Penelitian Bahan Obat Alami XIV & Muktamar XI PERHIPBA. 11-12 Agustus 2009. Jakarta.
Khie Khiong, Hana Ratnawati, Sylvia Soeng, Sri Utami Sugeng, Elsa Angelie, dan Michelle Nasseri. 2008. Efek immunomodulator Buah Merah (Pandanus Conoideus Lam.) terhadap berat limpa, jumlah dan proliferasi limfosit pada mencit (Mus musculus) dalur DDY yang diinduksi colitis dengan DSS. Disampaikan dalam KONAS XII dan PIN PAAI (Perhimpunan Ahli Anatomi Indonesia) Jakarta, 20-21 Juni 2008.
Kim T.W., Seo J.N., Suh Y.H., Park H.J., Kim J.H., Kim J.Y., et al. 2006. Involvement of lymphocytes in dextran sulfate sodium-induced experimental colitis. World J Gastroenterol, 12(2): 302-5.
Luo J.L., Kamata H., Karin, M. 2005. IKK/ NF- B signaling: balancing life and death- a new approach to cancer therapy. J Clin Invest, 115(10): 2625-32. Macmud Yahya H., Bernard T. Wahyu Wiryanta, 2005. Khasiat dan manfaat
buah merah, si emas merah dari Papua. Jakarta: Agro Media Pustaka. hal 24-34.
Markowitz, S. D., Bertagnolli, M. M. 2010. Molecular Basis of Cancer. The New England Journal of Medicine.p2449-53.
McCullough, M.L., Giovannucci, E.L. 2004. Diet and Cancer Prevention.Oncogene 23: 6349-64
Meira L.B., Bugni J.M., Green S.L., Lee C., Pang B., Borenshtein D., et al. 2008. DNA damage induced by chronic inflammation contributes to colon carcinogenesis in mice. J Clin Invest, 118(7): 2516-25.
Mims, C., Dockrell, H. M., Roitt, I. Wakelin, Derek, Zuckerman, et al. 2004. Medical Microbiology.5th ed. Philadelphia : Elsevier.
Munder, M., Mallo, M., Eichmann, K., Modolell, M. 2001. Direct stimulation of macrophages by IL-12 and IL-8-abridge built on solid ground. Immunol. Lett., 70:253-7.
Mun’im, A., Andrajati, R., Susilowati, H. 2006. Uji Hambatan Tumorigenesis Sari Buah Merah (Pandanus conoideus Lam.) Terhadap tikus Putih Betina yang Diinduksi 7,12 Dimetilbenz(a)antrasen (DMBA). Majalah Ilmu KefarmasianI, 33(3):153-61
Murray, et al. 2005. Medical Microbiology. 5th ed. Philadelphia : Elsevier ;228-35.
Popivanova, B. K., Kitamura, K., Wu, Y., Kondo, T., Kayaga, T. Kaneko, s., et al. 2008. Blocking TNF-alpha in mice reduces colorectal carcinogenesis associatrd with chronic colitis. J. Clin. Invest,118 (2) : 560-70.
Quinn, C. P., Semenova, V. A., Elie, C. M., Greene, C., Stamey, K., Li, H., et al. 2002 Enzym Linked Immunosorbent Assay. Medscape, 8 (10).
Raju, j., Swamy, M. V., Cooma, I., Patlilla, J. M. R., Pittman, B., Reddy, B. S., et al. 2005 Low Doses of -carotene and Lutein Inhibit AOM-Induced Rat Colonic ACF Formation But High Dose augment ACF Incidence. International Journal Cancer 113 :798-802.
Risques, R. A., Rabinovitch, P. S., Brentnall, T. A. 2006. Cancer Surveillance in Inflammatory Bowel Disease : Molecular Factors Associated With Colorectal Cancer Progression in Inflammatory Bowel Disease. Medscape, 22 (4) : 382-90.
Rosenberg, D. W., Giardina, C., Tanaka, T. 2009. Mouse Models for The Study of Colon Carcinogenesis.Carcinogenesis, 2(30) : 183-90.
Schroder, K., Hertzog, P. J., Ravasi, T., Hume, D. A. 2003. Interferon-g : an Overview of Signals, Mechanism and Functions. Journal of Leukocyte Biology, 75 : 163-189.
Sen, G. C. 2001. Viruses and interferons. Annu. Rev. Microbiol, 55 : 225-8.
Seril D.N. Liao J., Yang G.Y., Yang C.S. 2003. Oxidative stress and ulcerative colitis-associated carcinogenesis: studies in humas and animal models. Carcinogenesis, 23(3): 353-62.
Snell R.S. 2008. Clinical anatomy. 8th Edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. p. 204.
Soeripto et al. Gastro-intestinal Cancer in Indonesia. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention, (Online), 2003; Vol. 4, No. 4, (http://www.apocp.org/ cancer_download/Vol4_No4/Soeripto.pdf, diakses 27 maret 2007).
Syah E. 2002. Karsinoma Rekti. referat sub bagian bedah digestif: Jakarta.
Tanaka, T. 2009. Colorectal carcinogenesis: Review of human and experimental animal studies. Journal of Carcinogenesis, 8(5): 1-19.
Tannock, I. F., Hill, R. P., Bristow, R. G., Harrington, L. 2005. The Basic Science of Oncology. 4th ed. Philadelphia : Mc.Graw Hill.
http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi?key=IFN-gamma -14 Juni 2010 http://reference.findtarget.com/search/Interferon-gamma/
