PEMBUATAN ANTI SERUM K88,987P DAN F41 MONOSPESIFIK
UNTUK DIAGNOSIS PENYAKIT KOLIBASILLOSIS PADA ANAK
BABI
DJAENURI
Balai Penelitian Veteriner, Jl.R.E.Martadinata 30 Bogor,P.O. Box 151. Bogor 16114
RINGKASAN
Konfirmasi diagnosis Esherichia coli enterotoksigenik(ETEC) dari kasus diare pada anak sapi dan anak babi, harus dapat mendeteksi adanya antigen fimbriae atau antigen perlekatan K88, F41 atau 987P. Pembuatan antiserum terhadap antigen perlekatan K88, 987P dan F41 dari galur E. coli dapat dilakukan dengan menggunakan galur acuan atau isolat lapang yang sudah diketahui serotipenya, yaitu E. coli K88,
E. coli M987P, E. coli B41, E. coli. 987P dan E. coli F41 isolat lapang (Ai 57). E. coli ditumbuhkan pada media agar Mac Conkey. Isolat terpilih ditumbuhkan pada media agar nutrient. E. coli K88 diperbanyak pada media agar nutrient dalam botol roux. E. coli 987P pada agar darah dalam botol roux, E. coli K99 dan E. coli F41 pada agar minca dalam botol roux. Masing-masing isolat diinkubasikan pada suhu 370C
selama dua malam. Setelah inkubasi dibilas dengan larutan garam pisiologis dan disentrifuse. Suspensi antigen disuntikan pada kelinci dengan interval empat hari selama lima kali dengan dosis bertingkat. Setelah seminggu terakhir penyuntikan diambil darahnya, serum dipisahkan untuk menghilangkan antibodi yang tidak diinginkan maka antiserum tersebut diabsorbsi dengan suspensi sel E. coli yang homolog yang ditumbuhkan pada suhu 180C. Antiserum yang telah diabsorbsi menunjukan sifat spesifik
terhadap antigen K88, F41 dan 987P saja. Antiserum monospesifik dicampur dengan reagen ko-aglutinasi dengan perbandingan satu antiserum monospesifik dengan sembilan bagian reagen ko-aglutinasi sel
Staphylococcus aureus Cowan 1. Percobaan ini dilakukan untuk mendapatkan antiserum K88, F41 atau 987P monospeifik, digunakan untuk mendeteksi isolat E.coli baik dari galur acuan maupun isolat lapang, sehingga didapatkan isolat E.coli K88, F41 ataupun 987P.
Kata kunci: Anti serum, Kolibasillosis, anak babi.
PENDAHULUAN
Esherichia coli enterotoksigenik (ETEC) yang mempunyai antigen perlekatan atau fimbriae K88, 987P dan F41 merupakan penyebab utama diare propus pada anak babi dan menyebabkan banyak kematian pada periode neonatal.. Kasus diare pada anak babi dapat dijumpai setiap saat sampai umur tiga minggu pertama dengan prevalensi antara 14-30%. Kematian akibat diare propus dan dehidrasi antara 12-27%. pada periode tersebut ,dan masalah tersebut dihadapi peternak babi sepanjang tahun, baik peternak intensif maupun peternak tradisional (Supar dkk, 1988, Supar, 1993, 1994)
Infeksi enterotoksigenik Esherichia coli (ETEC) baik pada anak sapi atau anak babi mekanismenya serupa. ETEC menempel pada permukaan mukosa usus halus dengan antigen perlekatan atau fimbriae K88, K99, F41, K88K99, K99F41 dan 987P, setelah menempel berkembang biak dan memproduksi toksin LT atau ST. Aktivitas LT dan ST menstimulasi sekresi cairan tubuh dan elektrolit secara berlebihan, sekresi terjadi lebih banyak dari pada absorbsi, maka terjadilah diare profus dan dehidrasi sehingga hewan yang terinfeksi cepat mati
(Supar, 1987). Penyakit yang ditimbulkan oleh ETEC ini secara umum disebut Kolibasillosis (Orskop dkk, 1975)
Pada kesempatan ini penulis mengemukakan tentang pembuatan anti serum monospesifik K88, 987P dan F41 pada kelinci yang dipergunakan untuk diagnosis penyakit kolibasillosis pada anak babi.
BAHAN DAN METODE Bahan
Bahan-Bahan yang dipakai untuk pembuatan antigen fimbriae anti serum yaitu
1. Media pertumbuhan bakteri : Agar darah, agar Mac Conkey, agar nutrient media syntetik untuk produksi pili K99F41 agar Minca + isovitalex.
2. Galur acuan dan isolat lapang : E. coli K88 (G7), E. coli 987P (M987P) dan E. coli F41 (Ai 57).
Metode
Pemupukan E. Coli
Cara pemupukan E. coli K88, 987P dan F41 Galur acuan dan isolat lapang; E. coli K88 (G7), 987P (M987P) galur acuan dan E. coli F41 (Ai 57) isolat lapang, tiap galur acuan atau isolat lapang ditumbuhkan pada media agar Mac Conkey yang diinkubasikan pada suhu 370C selama satu malam. Untuk memperbanyak sel bakteri maka dipilih koloni terpisah dan diinokilasikan pada media agar darah. E. coli K88 dan 987P diinkubasikan seperti sebelumnya, sedangkan E. coli F41 diinokulasikan pada media agar Minca + isovitalex (vitox) selanjutnya diinkubasikan pada suhu 370C selama satu malam. (Guinee dkk, 1977)
Pembuatan Antigen Pili
Pembuatan antigen yang akan dipakai dalam pembuatan anti serum, kultur E. coli K88 dan 987P diinokulasikan ke dalam media agar darah dalam botol roux, sedangkan E. coli F41 diinokuasikan ke dalam media agar Minca + isovitalex (vitox) dalam botol roux. kemudian tiap isolat diinkubasikan pada suhu 370C selama satu malam. Sel bakteri dibilas dengan larutan garam pisiologis yang mengandung formalin 0,1%. Suspensi sel disentrifuse dengan kecepatan 3500 RPM pada suhu 40C selama 30 menit. Endapan dicuci dengan larutan garam physiologis sebanyak dua kali. Sel tersebut diatas dilarutkan dalam larutan garam physiologis non pyrogenik. Kepekatan sel dibuat setara dengan Mac Farland nomer 6. Suspensi sel diuji sterilitasnya dengan cara meneteskan atau menstrikan suspensi dalam media agar nutrien atau media agar darah, lalu diinkubasikan pada suhu 370C selama satu malam. Bila tidak ada pertumbuhan maka suspensi sel yang di uji berarti steril. Sel disimpan pada suhu 40C sampai saat diperlukan untuk injeksi kelinci.
Penyuntikan pada Kelinci
Tiap suspensi antigen E. coli K88, 987P dan F41 yang mengandung sel setara dengan kekeruhan tabung standar Mac Farland nomer 6 disuntikan pada kelinci dengan dosis 0.2 ml secara subkutan, empat hari kemudian disuntikkan lagi dengan dosis 0,5 ml dengan cara seperti tersebut di atas. Selanjutnya kelinci disuntik secara intravena dengan dosis 0,25 ml, 0,50 ml, 1,0 ml dan 2,0 ml dengan interval empat hari. Dua minggu setelah penyuntikan terakhir darah kelinci diambil dan dipisahkan serumnya, di simpan pada suhu –200C sampai proses berikutnya.
Absorbsi Anti Serum
Untuk mendapat anti serum monospesifik, anti serum yang diperoleh di atas harus dilakukan absorbsi yang dapat menghilangkan anti bodi yang tidak diinginkan yaitu anti serum dicampur dengan antigen E. coli yamg homolog, galur acuan yang dipakai untuk penyuntikan di atas yang sudah diketahui serotipenya baik galur akuan atau isolat lapang, lalu ditumbuhkan dalam media agar nutrien yang diperbanyak dalam botol roux diinkubasikan pada suhu 180C selama tiga hari (Syoka, 1965). Setelah inkubasi sel bakteri dibilas dengan larutan garam pisiologis yang mengandung formalin 0,1%, disimpan dalam lemari es satu malam. Suspensi sel disentrifuse dengan kecepatan 3500 RPM pada suhu 40C selama 30 menit. Endapan sel dari tiga botol roux dicampur dengan anti serum yang sudah dibuat sebelumnya, kemudian dikocok dengan alat vortex beberapa menit, diinkubasikan pada suhu 370C selama satu jam, di inkubasikan pada suhu 40C selama satu malam. Campuran sel bakteri dan anti serum disentrifuse seperti sebelumnya. Supernatan yang jernih (anti serum) dipisahkan secara aseptik dan disimpan dalam botol-botol steril. Tiap jenis serun diuji dengan isolat K88 yang ditumbuhkan dalam media agar nutrien, isolat 987P ditumbuhkan dalam media agar darah sedangkan isolat F41 ditumbuhkan dalam media agar Minca + isovitalex (vitox), yang ditumbuhkan pada suhu 180C dan suhu 370C. Apabila anti serum masih mengaglutinasi suspensi sel yang ditumbuhkan pada suhu 180C, maka proses absorbsi diulang sampai tidak terjadi aglutinasi dengan sel tersebut, tetapi hanya menunjukan reaksi aglutinasi dengan sel yang ditumbuhkan pada suhu 370C. Hasil absorbsi yang dilakukan di laboratorium Balitvet dapat dilihat pada Tabel 1.
Pembuatan Reagen Ko-Aglutinasi Dengan Menggunakan Sel Staphylococcus aureus CW 1
Spesies bakteri yang digunakan dalam pembuatan reagen ko-aglutinasi adalah Staphylococcus aureus CW 1 yang diperoleh dari IMVS yang disimpan di unit BCC Balai Penelitian Veteriner Bogor, dalam bentuk kering beku. Cara pembuatan reagen tersebut secara singkat berikut ini : Bakteri Staphylococcus aureus CW 1 ditumbuhkan dalam agar nutrien pada suhu 370C selama satu malam. Koloni terpilih disubcultur dalam media cair triptic soy broth (TSB) diinkubasikam pada suhu 370C selama satu malam dan diperbanyak dalam media tripticase soy agar (TSA) yang disiapkan dalam botol roux diinkubasikan pada suhu 370C selama satu malam.
Cara pembuatan suspensi sel Staphulococcus aureus CW 1 untuk reagen ko-aglutinasi dapat mengikuti prosedur yang ditulis oleh Honda, dkk (1983) yang telah modifikasi, disesuaikan dengan kondisi laboratorium (Supar, 1986), Sel dari biakan bakteri dalam botol
roux tersebut dibilas dengan phosphat buffer saline (PBS) 25 ml, diamkan 5-7 menit, sel bakteri dipanen dipercepat dengan menggunakan gelas parel steril. Suspensi sel setiap botol roux dituangkan dan selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 3000 RPM pada suhu 40C selama 15 menit. Endapan suspensi dicuci dengan larutan PBS sebanyak tiga kali dengan cara seperti tersebut di atas.
Tabel 1. Sensitivitas dan spesifitas reagen ko-aglutinasi K88, 987P dan F41 terhadap Galur acuan dan isolat lapang Esherichia coli enterotoksigenik.
Reaksi aglutinasi galur E.coli
Koaglutinasi reagen Galur acuan/isolat lapang Media Suhu 37 0 C Suhu 180 K88 G7 (K88) agar nutrien +++ -
G205 (K88) agar nutrien +++ - IB479 (K88) agar nutrien +++ - B491 (K88) agar nutrien +++ - B881 (K88) agar nutrien +++ - M987P (987P) agar darah - - P1066 (987P) agar darah - - P1078 (987P) agar darah - - R55 (F41) agar Minca - - Ai55 (F41) agar Minca - - G1150 (K99F41) agar Minca - - 987P M987P (987P) agar darah +++ - P74-50 (987P) agar darah +++ - P1078 (987P) agar darah +++ - G7 (K88) agar nutrien - - G205 (K88) agar nutrien - - IB479 (K88) agar nutrien - - B881 (K88) agar mutrien - - RSS (F41) agar Minca - - Ai55 (F41) agar Minca - - G1150 (K99F41) agar Minca - - F41 R55 (F41) agar Minca +++ - Ai55 (f41) agar Minca +++ - G1150 (F41) agar Minca +++ - G7 (K88) agar nutrien - - G205 (K88) agar nutrien - - IB479 (K88) agar nutrien - - B491 (K88) agar nutrien - - B881 (K88) agar nutrien - - M987P (987P) agar darah - - P1066 (987P) agar darah - - P74-50 (987P) agar darah -_____________________________________________________________________________ Keterangan :
+++ : terjadi reaksi aglutinasi kuat (positip) - : tidak terjadi aglutinasi (negatip)
Endapan sel dan pencucian terakhir larutan dalam PBS yang mengandung formalain 0,5%, di diamkan pada suhu kamar selama tiga jam sambil setiap kali dikocok dengan hati-hati, Setelah itu disentrifuse 3000 RPM selama 20 menit sel dicuci tiga kali dalam PBS. Endapan sel dari pencucian terakhir disuspensikan dalam larutan PBS. Sehingga konsentrasi 10% (volume sel/volume PBS), sel disimpan pada suhu 40C.
Suspensi di panaskan dalam penangas air 800C selama satu jam, kemudian di dinginkanpada suhu kamar, selanjutnya di sentrifuse seperti tersebut di atas. Endapan sel dilarutkan ke dalam PBS sehingga konsentrasi terakhir menjadi 10%. Satu tetes larutan sodium azide 10% di tambahkan ke dalam 2 ml suspensi sel Staphylococcus aureus CW I,
Selanjutnya simpan pada suhu 40C sampai proses berikutnya. Suspensi sel Staphylococcus aureus CW 1 direaksikan dengan anti serum monospesifik yang disiapkan sebelumnya, sebanyak 0,9 ml suspensi sel Staphylococcus aureus CW 1 ditambah 0,1 ml anti serum monospesifik masing-masing K88, 987P, atau F41 yang dihasilkan dari proses absorbsi, kocok perlahan-lahan biarkan pada suhu kamar (280C) selama tiga jam, setiap jam dikocok perlahan-lahan. Reagen ko-aglutinasi ini sebelum dipakai diuji terlebih dahulu sensitivitasnya terhadap suspensi pili dari galur E.coli yang telah diketahui serotipenya. Reagen ko-aglutinasi yang sudah siap dipakai atau disimpan pada suhu 40C tahan sampai beberapa bulan, sedangkan anti serum monospesifik dapat disimpan –200C.
Pemakaian Ko-Agulasi Reagen K88, 987p dan F41
Anti serum monospesifik K88, 987P dan F41 yang telah disiapkan pada peragaan aglutinasi dipakai untuk deteksi isolat E.coli baik dari galur acuan maupun isolat lapang dengan cara aglutihasi cepat. Tiap galur dari E.coli yang akan diuji adanya antigen K88 harus ditanam dalam media agar nutrien. Isolat 987P ditanam dalam media TSP cair, lalu di inkubasi pada suhu 370C selama 10 hari. Pelikel pada permukaan media diinokulasikan dalam media agar darah. Isolat F41 ditanam dalam media agar Minca + vitox. Setelah inokulasi tiap isolat diinkubasikan pada suhu 370C selama satu malam.
Tabel 2. Hasil deteksi antigen pili dari E.coli yang di isolasi dari anak babi penderita diare Pada peternakan di daerah Tangerang, Medan dan sekitarnya.
Banyaknya sampel positip E.coli
Peter- nakan (kode)
Bulan Sampel ulas rektal
K88 K99 K99F41 F41 987P KJP Januari 1991 58 2 4 - 3 49 KJT Januari 1991 44 - 3 - 3 38 Pebruari 1991 25 7 2 - 1 15 Maret 1991 61 9 - 2 - 51 April 1991 41 1 1 4 1 34 SL Maret 1992 36 - - - - 36 SK Maret 1992 51 - 16 - - 37 HT Maret 1992 27 - 3 - - 24 JV Maret 1992 17 1 - - - 16 EK Maret 1992 34 9 - - - 23 MJ Maret 1992 40 4 1 - 1 36 SM Maret 1992 31 - 6 - - 25 DG Maret 1992 14 1 3 - - 9 Total 480 24 39 7 9 394 Prosentase 5,0 8,1 1,4 1,8 82,08
Tiap kultur diperiksa secara koaglutinasi. Satu ose suspensi E.coli yang diambil pada media agar nutrien, agar darah dan media agar Minca, selanjutnya sel diemulsikan dengan satu tetes larutan NaCl pisiologis dalam gelas benda. Setelah larut dicampur satu ose reagen ko-aglutinasi, digoyang-goyang selama 10-15 detik, bila terjadi gumpalan halus yang semakin lama semakin banyak dan semakin kasar, ini menunjukan reaksi positip K88, 987P atau F41. Apabila tidak terjadi gumpalan maka isolat yang diuji dinyatakan negatip.
Hasil reaksi antigen pili dari isolat E.coli yang di isolasi dari anak babi penderita diare pada peternakan di daerah Tangerang, Jawa Barat, Medan dan sekitarnya, di Sumatra Utara. dapat dilihat pada Tabel 2.
KESIMPULAN
Semua isolat E.coli yang mempunyai antigen perlekatan K88, 987P atau F41 dapat memberikan reaksi aglutinasi positip terhadap anti serum monospesifik K88, 987P atau F41, baik dari galur acuan maupun isolat lapang. Reagen ko-aglutinasi dapat disimpan dalam lemari es beberapa bulan dan siap dipakai sewaktu waktu. Sedangkan anti serum monospesifik dapat disimpan dalam freezer –200C dan siap dipakai sewaktu waktu bila diperlukan. Teknik koaglutinasi yang dikembangkan sangat sensitip, spesifik dan mudah dilakukan.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr.H.Supar, MS, APU atas dukungan, saran serta binbingannya yang telah diberikan dalam penulisan makalah ini.
DAPTAR BACAAN
Guinee, P. A. M. J. Veldkam and W. H. Jansen. 1977. Improved Minca medium for the detection of K99 antigen in calf enterotoxigenic strains of Esherichia coli. Infec. Immun. 15: 676 – 678.
Honda, T., R. Samakoses, c. Somchai, y. Takeda and T. Miwatani. 1983. Detection by Staphylococcal co-agglutination test of heat-labile enterotoxin producing Esherichia coli. J. Clinic. Microbiol. 17: 592 – 595.
Orskov, I,. F. Orskov H. w. Smith and W. J.Syoka. 1975. The establishment of K99 hermolabile Esherichia coli K antigen, previously called Koopossessed by calf K lamb enteropathogenic strains. Actapathol. Microbiol. Scand. B. 83: 31 – 36.
Sojka. W.J. 1965. Esherichia coli in domestik animal and Poultry. Commonwealth AgculturalBureau of animal health Weybrbrige. Review Series no. 7:205-212.
Supar, 1986. Penggunaan metode enzym linked immunosorbent assay (ELISA) untuk deteksiantigen pili K99. K88 pada Esherichia coli dari anak sapi dan anak babi diare. Penyakit Hewan XV11 (32) : 159 – 168.
Supar, 1987a. Diagnosis Kolibasillosis pada anak sapi. Penggunaan anak mencit untuk Identifikasi enterotoksin tahan panas. Penyakit Hewan, 19 (34): 54 – 57.
Supar, R. G, Hirst and B. E Patten. 1988. K-adhesins and O-serogroups of Esherichia coli In calves and piglets with diarrhoea. Proceedings of the sixth Congress of Federation Asian Veterinary Association (FAVA). Bali indonesia: 479-485
Supar, 1993. Prospek pengendalian kolibasillosis neonatal dengan vaksin Esherichia coli Multivalen pada peternakan intensif di Tangerang Jawa Barat. Penyakit Hewan XXV (46): 114-119.
Supar, 1994. Distribusi infeksi Esherichia coli enterotoksigenik pada anak babi di Sumatra Utara Dan prospek pengendaliannya dengan vaksin. Prosiding seminar Nasional Teknologi Veteriner untuk meningkatkan Kesehatan hewan dan Pengamanan Bahan pangan asal ternak. : 173-179.
.
