BAB VIII
BAB VIII
KROMATOGRAFI KOLOM
KROMATOGRAFI KOLOM
PRELAB
PRELAB
A. Pre-lab A. Pre-lab 1. Apa yang di1. Apa yang dimaksud kromatografmaksud kromatografi?i?
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran diantara dua fase, yakni fase diam dan fase distribusi dari komponen-komponen campuran diantara dua fase, yakni fase diam dan fase bergerak. Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatogradi diklasifikasikan mnejadi dua bergerak. Berdasarkan fase gerak yang digunakan, kromatogradi diklasifikasikan mnejadi dua bagian, yakni gas kromatografi dan liquid kromatografi. Beberapa tujan penggunaan bagian, yakni gas kromatografi dan liquid kromatografi. Beberapa tujan penggunaan kromatografi adalah (1) untuk mengetahui ada tidaknya senyawa tertentu dalam cuplikan (2) kromatografi adalah (1) untuk mengetahui ada tidaknya senyawa tertentu dalam cuplikan (2) menunjukkan banyaknya masing-masing komponen dalam campuran (3) untuk memperoleh menunjukkan banyaknya masing-masing komponen dalam campuran (3) untuk memperoleh komponen dalam jumlah memadai dalam keadaan yang murni (Luktianingsih, 2012).
komponen dalam jumlah memadai dalam keadaan yang murni (Luktianingsih, 2012). 2. Jelaskan pengertian fase stasioner dan fase
2. Jelaskan pengertian fase stasioner dan fase mobil!mobil! a. fase diam
a. fase diam
Fase diam merupakan komponen yang digunakan sebagai pemisah campuran. Fase Fase diam merupakan komponen yang digunakan sebagai pemisah campuran. Fase diam dapat berupa bahan padat atau bahan porus yang berukuran kecil. serta dapat berupa diam dapat berupa bahan padat atau bahan porus yang berukuran kecil. serta dapat berupa cairan yang dilapiskan pada dinding kolom. Beberapa contoh fase diam yang sering cairan yang dilapiskan pada dinding kolom. Beberapa contoh fase diam yang sering digunakan adalah silica gel, selulosa dan alumunium oksida (Noviyanti, 2010).
digunakan adalah silica gel, selulosa dan alumunium oksida (Noviyanti, 2010). b. Fase gerak
b. Fase gerak
Fase bergerak merupakan komponen yang berfungsi sebagai pembawa campuran. Fase bergerak merupakan komponen yang berfungsi sebagai pembawa campuran. Fase gerak yang digunakan dapat berupa gas atau cairan. Pada gas kromatografi, fase Fase gerak yang digunakan dapat berupa gas atau cairan. Pada gas kromatografi, fase bergerak yang digunakan adalah gas. Sedangkan pada liquid cromatografi, fase bergerak bergerak yang digunakan adalah gas. Sedangkan pada liquid cromatografi, fase bergerak yang di
yang digunakan adalah gunakan adalah cair. Saat cair. Saat melewati fase melewati fase gerak, setiap gerak, setiap komponen komponen mempunyaimempunyai kecepatan yang berbeda-beda. setelah melewati fase bergerak, barulah akan terjadi kecepatan yang berbeda-beda. setelah melewati fase bergerak, barulah akan terjadi pemisahan (Noviyanti, 2010).
pemisahan (Noviyanti, 2010).
3. Apa fungsi alumina pada penentuan beta karoten? 3. Apa fungsi alumina pada penentuan beta karoten?
Dalam kromatografi, aluminia yang bersifat basa dapat digunakan untuk memisahkan Dalam kromatografi, aluminia yang bersifat basa dapat digunakan untuk memisahkan senyawa yang bersifat basa. Aluminia berungsi sebagai fase diam untuk mengadsopsi solute senyawa yang bersifat basa. Aluminia berungsi sebagai fase diam untuk mengadsopsi solute solute yang bersifat polar. Pada penentuan beta karoten, karena beta karoten merupakan solute yang bersifat polar. Pada penentuan beta karoten, karena beta karoten merupakan senyaw yang bersifat non polar, maka beta karoten akan larut bersama fase gerak. Sedangkan senyaw yang bersifat non polar, maka beta karoten akan larut bersama fase gerak. Sedangkan senyawa lain selain beta karoten akan diikat oleh fase diam berupa aluminia (Khopkar, 2008). senyawa lain selain beta karoten akan diikat oleh fase diam berupa aluminia (Khopkar, 2008). 4. Jelaskan prinsip kromatografi adsorpsi?
4. Jelaskan prinsip kromatografi adsorpsi?
Kromatografi adsorpsi menggunakan fase cair atau gas bergerak (fase
Kromatografi adsorpsi menggunakan fase cair atau gas bergerak (fase mobilemobile) ke) ke permukaan padat (fase stasioner). Prinsip dari kromatografi adsorpsi ialah memisahkan permukaan padat (fase stasioner). Prinsip dari kromatografi adsorpsi ialah memisahkan komponen secara selektif berdasarkan sifat fisik adsorp dengan fase diam berupa alumina dan komponen secara selektif berdasarkan sifat fisik adsorp dengan fase diam berupa alumina dan fase mobile PE-aseton. Pada kromatografi adsorpsi, fasa stasionernya terdiri atas zat padat fase mobile PE-aseton. Pada kromatografi adsorpsi, fasa stasionernya terdiri atas zat padat dan fasa mobilnya terdiri atas zat gas
dan fasa mobilnya terdiri atas zat gas atau zat cair (atau zat cair ( Pherman, 2008).Pherman, 2008).
5. Apa yang dipisahkan pada proses kromatografi adsorbsi pada penentuan kadar beta 5. Apa yang dipisahkan pada proses kromatografi adsorbsi pada penentuan kadar beta karoten?
karoten?
Senyawa atau zat yang dipisahkan pada proses kromatografi pada kadar beta karoten Senyawa atau zat yang dipisahkan pada proses kromatografi pada kadar beta karoten ialah pigmen beta karoten dan komponen lain. Pemisahan beta karoten berdasarkan ialah pigmen beta karoten dan komponen lain. Pemisahan beta karoten berdasarkan polaritasnya. Beta karotene bersifat non-polar, sehingga untuk memisahkan beta karoten polaritasnya. Beta karotene bersifat non-polar, sehingga untuk memisahkan beta karoten dari senyawa lain dilakukan menggunakan pelarut heksana, karena heksana adalah pelarut dari senyawa lain dilakukan menggunakan pelarut heksana, karena heksana adalah pelarut non polar, sehingga beta karoten
B.
B. Diagram Diagram AlirAlir Ekstraksi Sampel Ekstraksi Sampel Dihaluskan Dihaluskan Ditimbang 3 gram Ditimbang 3 gram
Dimasukkan dalam erlemeyer Dimasukkan dalam erlemeyer Erlemeyer ditutup alumunium foil Erlemeyer ditutup alumunium foil Aduk dengan shi
Aduk dengan shieve shaker seleve shaker selama 15 meniama 15 menitt Disaring
Disaring Filtrate dimasukkan dalam
Filtrate dimasukkan dalam erlemeyererlemeyer
Diencerkan dengan cara dikocok menggunakan shieve shaker 15 menit Diencerkan dengan cara dikocok menggunakan shieve shaker 15 menit
Filtrate diambil 25 ml Filtrate diambil 25 ml
Dimasukkan dalam corong pemisah Dimasukkan dalam corong pemisah
Dikocok Dikocok
Dibiarkan hingga terjadi pemisahan Dibiarkan hingga terjadi pemisahan
Fase
Fase eter eter dalam dalam corong corong pemisah pemisah Lapisan Lapisan bawah bawah (air-aseton)(air-aseton) Dikocok
Dikocok Dialirkan Dialirkan keluar keluar dari dari corong corong pemisahpemisah Dibiarkan
Dibiarkan hingga hingga terjadi terjadi pemisahan pemisahan DibuangDibuang
Fase
Fase eter eter lapisan lapisan bawah bawah (air-aseton)(air-aseton) Dialirkan keluar dari corong pemisah Dialirkan keluar dari corong pemisah
Dibuang Dibuang 25 ml aquades 25 ml aquades Sampel Sampel 20 ml
20 ml petroleum eter-aseton (1:1)petroleum eter-aseton (1:1)
100 ml petroleum eter-aseton (1:1) 100 ml petroleum eter-aseton (1:1)
Proses Pemisahan Fraksi Senyawa Menggunakan Kromatografi Kolom
Ditambahkan Na2SO4 sebanyak 1 gram untuk setiap 20 ml fase eter Dielusikan petroleum eter : aseton (10:1) ke dalam kolom
dimasukkan fase eter ke dalam kromatografi Diencerkan dengan petroleum eter : aseton (10:1) diberi tekanan agar fase lebih cepat melewato kolom
ditampung menggunakan erlenmeyer
dihitung absorbansi menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 450 nm Fase Eter
Pembuatan Larutan Standar Betakaroten
diencerkan dengan petroleum eter-aseton 25 ml dishaker hingga larut
diambil masing-masing 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,25 ml dan diletakkan dalam tabung reaksi diencerkan dengan petroleum eter-aseton (10:1) pada labu takar 25 ml hingga tanda batas
dihomogenkan
masing-masing diambil 1 ml dan dimasukkan dalam labu takar 10 ml ditambah petroleum eter-aseton (10:1) hingga tanda batas dan dihomogenkan
diukur absorbansi pada panjang gelombang 450 nm dibuat kurva standar
dicari persamaan liner dan regresinya dihitung kadar beta karoten Beta Karoten 10 mg
Tinjauan Pustaka
1. Kromatografi KolomKromatografi Kolom merupakan Metode pemisahan yang didasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya.. Prinsip dari kromatografi kolom ialah teknik pemisahan yang didasarkan pada peristiwa adsorpsi. Sampel yang biasanya berupa larutan pekat diletakkan pada ujung atas kolom. Eluen atau pelarut dialirkan secara kontinu ke dalam kolom. Dengan adanya gravitasi atau karena bantuan tekanan, maka
eluen/pelarut akan melewati kolom dan proses pemisahan akan terjadi. Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat. (Prasetyo, 2015).
2. Beta Karoten
Beta karoten merupakan pigmen atau zat kimia alami yang berwarna merah, kuning, hingga jingga yang terdapat dalam buah-buahan dan sayuran. Beta karoten yang kita konsumsi terdiri atas 2 grup retinil, yang di dalam usus kecil akan dipecah oleh enzim betakaroten dioksigenase menjadi retinol, yaitu sebuah bentuk aktif dari vitamin A. Karoten dapat disimpan di hati dalam bentuk provitamin A dan akan diubah menjadi vitamin A sesuai dengan kebutuhan tubuh.. Beta karoten merupakan karotenoid, precursor vitamin A dan sebagai antioksidan. Beta karoten tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut non polar (Lundanes, 2013).
(Lundanes, 2013). 3. Petrolium Eter
Petrolium Eter merupakan pelarut organik non polar. Petroleum eter sangat mudah terbakar dengan auto-ignition suhunya sebesar 288°C atau 550,4°F. Untuk penyimpanannya sebaiknya disimpan di tempat terpisah dan tempat yang sejuk, berventilasi baik. petrolium eter dapat digunakan untuk mengekstrak pigmen di dalam sampel dan sebagai fase gerak pada kromatografi kolom (Kurniawati, dkk, 2007).
4. aseton
Aseton Dikenal sebagai propanon, dimetil keton, 2-propanon, propan-2-on, dimetilformaldehida, dan β-ketopropana, merupakan keton yang paling sederhana, digunakan sebaga i pelarut polar dalam kebanyakan reaksi organik. Aseton merupakan senyawa keton paling sederhana berbentuk cairan yang tidak berwarna dan mudah terbakar. Serta merupakan keton yang paling sederhana. Dalam
industri, aseton biasanya digunakan dalam pembuatan serat dan industri farmasi (Kurniawati, dkk, 2007).
5. alumina
Alumina (Al2O3) adalah bahan baku utama untuk memproduksi Aluminium, Alumina berbentuk putih bubuk dan memiliki sifat basa dan polar. Di dalam proses industri, alumina digunakan sebagai bahan baku untuk memproduksi alumunium. Sedangkan pada kolom, alumina digunakan sebagai fase diam karena sifatnya yang polar, sehingga dapat mengadsorpsi beta karoten dan membentuk pita warna di dalam kolom yang nantinya akan berfungsi dalam pemisahan beta karoten (Noviyanti, 2010).
6. Total beta karoten Pada Ubi Orange dan Wortel
Beta karotene merupakan pigmen pada bahan pangan yang biasanya memiliki warna jingga. Beta karotene umumnya ada pada wortel dan ubi jalar. Total beta karoten pada ubi orange adalah 1,90 μg/g – 5,33 μg/g (Sabuluntika, 2013). Sedangkan total beta karoten pada wortel adalah sekitar 50% dari total karotenoid, yaitu 8285 mcg per 100 gram wortel. Kedua senyawa ini merupakan sumber provitamin A dan prekursor vitamin A. (Lundanes, 2013).
Daftar Pustaka
Khopkar, SM. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik . Jakarta: UI-Press Noviyanti, l. 2010. Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom Untuk Pemisahan Trigliserida dari Ekstrak Buah Merah . Surakart: Universitas Sebelas Maret
Kurniawati, Pipin, dkk. 2007. Antioxidant And Antibacterial Activities Of Bixin Pigment From Annato (Bixa orellana L.) Seeds. Indo Journal Chemicals 7 (1) : 88-92
Lukitaningsih, Endang. 2012. Kromatografi . Yogyakarta : Universitas Gadjah Mada
Lundanes, Elsa. 2013. Chromatography: Basic Principles, Sample Preparations and Related Methods. New York: John Wiley and Sons
Noviyanti, Lenia. 2010. Modifikasi Teknik Kromatografi Kolom untuk Pemisahan Trigliserida dari Ekstrak Buah Merah. Surakarta: Universitas Sebelas Maret
Pherman. 2008. Isolation of Chlorophyll and Carotenoid Pigments From Spinach . http://fog.ccsf.cc.ca.us diakses pada tanggal 11 Mei 2016 Pukul 10.00
Prasetyo, Susiana, dkk. 2015. The Pre-chromatography Purification of Crude Oleoresin of Phaleria Macrocarpa Fruit Extracts by Using 70%-v/v Ethanol . Bandung : Universitas Parahyangan
BAB VIII
KROMATOGRAFI KOLOM LAPORAN
Persamaan regresi kurva standar : Tabel Poin + Kurva Tabel
No. Konsentrasi Absorbansi
1. 0,0004 0,004 2. 0,0008 0,052 3. 0,0012 0,100 4. 0,0016 0,140 5. 0,002 0,207 Y = 123,5x
–
0,0476 R 2= 0,9933 KurvaPerhitungan kadar beta karoten dari sampel yang dianalisis :
Y = 123,5x – 0,0476 0,279 = 123,5x – 0,0476 123,5x = 0,279 + 0,0476 x = 2,64 x 10-3 y = 123.5x - 0.0476 R² = 0.9933 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 A b s o r b a n s i konsentrasi
Berat sampel Absorbansi
3,0006 gram 0,279
Kadar beta karoten = konsentrasi x Fp x V filtrat x 100/37
berat sampel
=2,64 x 10
x 20,83 x 100
3,006
= 1,835 mg/g
Faktor pengenceran = volume dalam labu
volume keluar kolom
= 25
1,2
LKP
1. Apa yang menjadi fase stasioner dan fase mobil pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom?
Fase stasioner yang digunakan pada analisis beta karoten kali ini adalah alumina. Dimana alumina berfungsi sebagai adsorben yang akan mengikat senyawa senyawa polar yang ada pada sampel. Sedangkan fase mobile yang digunakan adalah petroleum eter – aseton (10 : 1) dan juga petroleum eter – aseton (1 : 1). Petroleum eter-aseton (10:1) berfungsi untuk mengelusi senyawa senyawa non polar dan mengekstrak betakaroten yang ada pada sampel karena sifatnya yang sangat non polar, sehingga senyawa non polar akan ikut terlarut dalam larutan tersebut. Sementara itu petroleum eter-aseton (1:1) berfungsi untuk memaksimalkan proses ekstraksi, dimana senyawa non polar, dalam hal ini beta karoten yang sudah terekstrak masih berikatan dengan senyawa semi polar. Fungsi petroleum eter-aseton (1:1) adalah untuk memaksimalkan agar tinggal senyawa non polar yang benar benar terlarut dan bukan lagi betakaroten yang masih berikatan dengan senyawa semi polar.
2. Komponen apa yang terelusi pada analisis beta karoten dengan kromatografi kolom? Pada analisis ini, yang terelusi pada kromatografi kolom adalah komponen non polar atau dalam hal ini adalah betakaroten. Kelompok karotenoid seperti betakaroten larut terhadap pelarut non polar seperti n-heksan dan petroleum eter sehingga komponen beta karoten akan terelusikan oleh fase mobile yang digunakan yaitu petroleum eter sehingga komponen beta karoten akan ikut terbawa turun karena sifat kepolarannya yang sama dengan pelarut yang digunakan (Wahyuni, 2015).
3. Komponen apa yang teradsorbsi kuat pada adsorben?
Komponen yang memiliki kepolaran yang sama dengan adsorben. Adsorben yang digunakan pada kromatografi ini yaitu alumina yang bersifat polar seperti air maupun aquades yang digunakan saat preparasi sampel. Komponen polar akan terikat pada adsorben karena memiliki afinitas atau polaritas yang lebih besar dari komponen atau senyawa lainnya. Komponen dengan tingkat kepolaran paling tinggi dalam sampel ketika dilakukan pemisahan dengan kromatografi kolom, akan tertahan dan teradsorbsi pada fase stasioner yang digunakan.
4. Apakah analsis tersebut dapat memisahkan beta karoten dengan karotenoid lain seperti alfa dan gama karoten?
Analisis ini tidak dapat memisahkan betakaroten dengan karotenoid lain seperti alfa dan gamma karoten karena alfa, beta, dan gamma karoten memiliki kepolaritasan yang berdekatan atau yang hamper sama sehingga analisis dengan kromatografi ini dgunakan untuk menentukan total karoten dalam bahan.
5. Apa fungsi pengukuran kadar beta karoten dalam eluen dengan spektrofotometer?
Fungsinya untuk mengetahui nilai absorbansi betakaroten dimana nilai absorbansi tersebut dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi betakaroten dalam suatu sampel.
6. Apa fungsi ekstraksi dengan petroleum eter-aseton?
Fungsi ekstraksi dengan petroleum eter-aseton adalah untuk mengeskstrak komponen non polar dalam hal ini betakaroten yang ada pada sampel. Betakaroten yang termasuk karotenoid akan larut dalam pelarut PE-aseton yang juga memiliki kepolaran yang sama dengan
betakaroten (Wahyuni, 2015). Dengan larutnya betakaroten pada pelarut maka beta karoten akan lebih mudah dipisahkan dari sampel dengan komponen yang lain.
7. Fraksi apa saja yang terekstrak pada proses ekstraksi tersebut?
Fraksi yang terekstrak yaitu fraksi polar dan non polar. Fraksi polar berupa aquades-aseton, tetapi fraksi tersebut tidak digunakan dalam analisis ini. Yang digunakan dalam analisis yaitu fraksi non polar yang berupa fase eter. Fase eter yang akan dianalisis kadar beta karoten dengan kromatografi kolom.
8. Apa fungsi penambahan akuades pada ekstrak petroleum eter-aseton?
Fungsinya yaitu untuk melarutkan komponen-komponen yang bersifat larut aquades dan aseton yang masih tersisa, sehingga didapatkan hasil larutan yang tidak mengandung aquades dan aseton.
9. Fraksi apa yang larut pada aseton-air dan petroleum eter?
Fraksi yang larut pada aseton-air yaitu komponen-komponen yang bersifat polar seperti pigmen yang larut dalam air karena aseton bersifat semipolar dan air bersifat polar. Sedangkan, fraksi yang larut pada petroleum eter yaitu komponen-komponen yang bersifat non polar seperti betakaroten.
10.Sebutkan beberapa sumber-sumber bahan pangan yang yang tinggi beta karoten?
Sumber-sumber yang kaya akan betakaroten yaitu sayur dan buah-buahan seperti wortel, ubi, labu siam, labu, parika orange, apricot, blewah, papaya dan manga. Sayur dan buahan tersebut tentunya berwarna orange, namun ada juga sayur-sayuran dan buah-buahan yang merupakan sumber beta karoten walaupun tidak berwarna orange tetapi merah dan hijau, seperti tomat, paprika merah, lobak, kubis, selada, dan semangka (Mohrman, 2012).
Selain dari tanman, sumber beta karoten juga dapat berasal dari kelompok cyanobacteria dan alga biru-hijau seperti spirulina. Fungi yang dapat dimakan seperti Monascus purpureus juga kaya akan betakaroten. Seelain itu, juga dapat berupa andum seperti oats (Mohrman, 2012). Prinsip disertai literature dan Rumus
Prinsip kerja kromatografi kolom yaitu senyawa campuran yang akan dipisahkan akan tertahan pada fase diam dan saat solven dialirkan, maka senyawa-senyawa yang kepolarannya sesuai dengan solven akan bergerak dan terbawa oleh solven. Senyawa yang terlarut dalam solven akan bergerak lebih cepat sedangkan senyawa yang berikatan dengan fase diam akan bergerak lebih lambat sehingga senyawa-senyawa tersebut dapat berpisah dan membentuk fraksi (Sastrohamidjojo, 2006).
Rumus untuk menentukan kadar beta karoten yaitu (Satriyanto, 2012): Total Karoten (ppm) = A x Vc x V − K
0.25 x M x 1000 x 50
Keterangan:
A = Absorbansi
Vencer = Volume hasil pengenceran
Veter = Volume eter K = Karoten
Analisa Prosedur
1. Proses Ekstraksi Betakaroten dari Sampel
Siapkan alat-alat yang digunakan pada praktikum yaitu timbangan analitik untuk menimbang berat; pipet tetes dan bulb untuk memindahkan larutan dengan volume tertentu; labu takar berfungsi untuk mengencerkan sampel; kertas saring dan corong sebagai penyaring sampel (memisahkan komponen natan dan supernatant); labu pemisah untuk memisahkan komponen polar dan non-polar dengan pengocokan. Bahan-bahan yang dibutuhkan adalah sampel wortel, Petroleum Aseton (1:1), akudes, dan Petroleum Eter- Aseton (10:1).
Pertama-tama sampel yaitu wortel dicuci, dikupas, dan dipotong-potong. Setelah itu wortel dihaluskan dengan mortar dan lumpang. Setelah itu sampel ditimbang dengan timbangan analitik hingga mencapai 3 gram. Caranya adalah dengan menaruh cawan kosong ke dalam timbangan kemudian ditekan ‘0’. Setelah itu masukkan wortel dan timbang sampai 3 gram. Pindahkan wortel ke dalam labu Erlenmeyer. Tambahkan petroleum eterl-aseton 1:1 sebanyak 30ml menggunakan pipet ukur yang atasnya dipasang bulb. SIfat petroleum eter adalah non-polar sehingga dapat mengikat dan melarutkan komponen non polar dan aseton bersifat semi polar yang juga dapat mengkat beta karoten (proses ekstraksi lebih optimal). Masukkan labu erlenmeyer ke dalam shaker dan biarkan selama 10 menit. Kemudian saring larutan tersebut. Caranya adalah dengan memasang kertas saring pada corong kemudian letakkan di atas labu Erlenmeyer. Penyaringan berfungsi untuk memisahkan beta karoten dari komponen lain dari wortel. Saring lagi sebanyak 2 kali sehingga dihasilkan filtrate sebanyak 90ml. Pindahkan filtrate ke dalam labu ukur. Tambahakan PE Aseton 1:1 hingga tanda batas dengan pipet ukur yang atasnya dipasang bulb. Homogenkan dengan cara menggojog sebanyak 12 kali. Ambil 50 ml larutan tersebut kemudian pindahkan ke dalam labu pemisah. Masukkan akuades sebanyak 50ml ke dalam labu pemisah. Penambahan akuades berguna untuk mengikat komponen polar pada bahan. Kocok hingga terjadi pemisahan antara zat yang polar dan non-polar. Buka ujung labu pemisah sesekali untuk mengeluarkan gas. Pengocokan akan menghasilkan 3 lapisan, lapisan paling atas berwarna kuning bening yang merupakan larutan non polar, lapisan kedua merupakan larutan semi-polar yang berwarna kuning, dan lapisan ketiga yang merupakan larutan polar. Buang larutan pada lapisan kedua dan ketiga melalui ujung corong. Lakukan hal ini sebanyak dua kali agar pemisahan komponen polar dan non-polar semakin optimal. Masukkan zat yang non-polar ke dalam labu Erlenmeyer, zat ini dinamakan sebagai fase eter sebanyak 19ml.
2. Proses Pemisahan Fraksi Senyawa Menggunakan Kromatografi Kolom
Siapkan alat-alat yang digunakan pada praktikum yaitu timbangan analitik untuk menimbang berat; pipet tetes dan bulb untuk memindahkan larutan dengan volume tertentu; labu takar berfungsi untuk mengencerkan sampel; kertas saring dan corong sebagai penyaring sampel (memisahkan komponen natan dan supernatant); kolom untuk memisahkan komponen polar dan non-polar; spektrofotometer untuk mengukur absorbansi sampel. Bahan-bahan yang dibutuhkan adalah sampel wortel, Natrium sulfat, kapas, alumina, dan Petroleum Eter-Aseton (10:1).
Fase eter dalam erlenmeyer ditambahkan dengan Natrium Sulfat. Perbandingan natrium sulfat yang ditambahkan pada sampel sebanyak 1:5, maka 19 ml fase eter ditambahkan dengan 0.95 gram natrium sulfat. Fungsi penambahan natrium sulfat adalah
untuk mengikat sisa akuades karena sifat natrium sulfat higroskopis dan polar. Kemudian larutkan.Natrium sulfat tidak sepenuhnya terlarut karena fase eter bersifat non-polar. Persipkan fase stasioner pada sampel, caranya adalah memasukkan kapas pada bagian paling bawah kolom hingga ketinggian 1.5 cm, kemdian ditumpuk dengan alumina setinggi 10cm, natrium sulfat setinggi 1.5 cm, dan yang paling ats adalah 1.5cm kapas. Fungsi kapas adalah untuk menyaring komponen, alumina berfungsi untuk mengikat komponen polar, dan natrium sulfat untuk mengikat komponen polar lanjutan. Kemudian masukkan fase eter ke dalam kolom yang sudah siap. Masukkan larutan PE-aseton (10:1) ke dalam kolom. Tutup kolom dengan plastic berlubang. Masukkan pompa vakum ke dalam lubang pada plastic agar proses pemisahan dalam kolom semakin cepat. Tunggu hingga komponennya terpisah. Indikasi bahwa beta karoten akan turun adalah pita berwarna kuning berada di dekat keran kolom. Siapkan gelas beker. Tampung beta karoten yang terpisahkan. Ukur berapa volumenya. Pindahkan ke labu ukur. Tambahkan PE-Aseton (10:1) hingga tanda batas. Ukur absorbansinya dengan spektrofotometer panjang gelombang 45nm. Cari nilai konsentrasinya dan buat grafik persamaannya.
3. Pembuatan Larutan Standar Betakaroten
Ambil beta-karoten kemudian timbang dengan timbangan analitik sebanyak 10mg (0.001 gram) dengan timbangan analitik. Kemudian pindahkan ke dalam labu Erlenmeyer/. Tambahkan petroleum eter-aseton 10:1 sebanyak 25 ml. Cara mengambil dengan menuangnya ke dalam gelas ukur, baru kemudian dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer. Larutkan dengan menggoyang-goyangkan. Siapkan tablabu takar 25ml sebanyak 5 buah. Masukkan campuran tadi dengan volume yang berbeda-beda yaitu: 0.25, 0.5, 0.75, 1, dan 1.25. Pada masing-masing labu ukur diisi dengan Petroleum eter-aseton (10:1) hingga tanda batas. Homogenkan dengan cara digojog sebanyak 12 kali. Ambil dari masing-masing labu ukur sebanyak 1ml dan pindahkan ke dalam labu ukur 10 ml. Tambahkan PE-aseton 10:1 sebanyak tanda batas. Digojog 12 kali agar homogen. Kemudian ukur absorbansinya dengan panjang gelombang 450nm. Dengan Microsoft excel carilah persamaannya dan buat kurva. Kemudian ukur kadar beta karoten dan catat hasilnya.
Analisa DHP dibandingkan dengan literatur
Sampel wortel ditimbang sebesar 3 gram yang dihitung absorbansinya dan didapatkan sebesar 0,279 Selanjutnya, dimasukkan ke dalam persamaan y=123,5x – 0,0496. Didapatkan nilai konsentrasinya sebesar 2,64 x 10-3. Selanjutnya dimasukkan pada rumus kadar beta karoten dan didapatkan hasil 1.835 mg/g.
Menurut literatur, kadar betakaroten pada wortel berkisar 8.1 -19.3 mg/100 g atau dapat dikatakan sebesar 0.08-0.193 mg/g (Mustafa dkk, 2012). Hal ini data hasil praktikum tidak sesuai dengan literatur dan terjadi kesalahan positif. Faktor yang mempengaruhi kesalahan dapat berupa kesalahan identifikasi, ekstraksi yang belum cukup, proses kromatografi yang belum sempurna, kesalahan perhitungan, dan terjadinya isomerisasi dan oksidasi pada karoten selama proses analisa atau penyimpanan sampel sebelum dianalisa, pengenceran yang berlebih, dan perpindahan jenis carotene dari satu pelarut ke pelarut lain yang belum maksimal ketika proses pemisahan (Rodriguez, 2007).
(Mustafa dkk, 2012).
Analisa Kurva Larutan Betakaroten Standar dibandingkan dengan literature
Berdasarkan kurva standart yang diperoleh, dapat dijelaskan bahwa konsentrasi berbanding lurus dengan absorbansi. dimana peningkatan absorbansi maka otomatis juga konsentrasinya akan meningkat. Berdasarkan hasil absorbansi dengan spektrofotometer pada kurva standar, didapatkan persamaan Y =123,5x-0,0476 dan nilai R2=0,9933. Nilai R2 hampir mendekati 1 menunjukkan data hasil praktikum sudah mendekati kebenaran uji. Semakin tinggi konsentrasi dari sampel uji, maka nilai absorbansi yang dihasilkan dari pembacaan spektrofotometer juga semakin tinggi, dan semakin banyak ulangan sampel, maka nilai R yang didapatkan akan semakin akurat. Menurut Sathya dkk (2014), kurva standar untuk betakaroten linear, dimana semakin besar konsentrasi maka nilai absorbansinya semakin tinggi. Pada literatur menggunakan panjang gelombang 440nm dimana didapatkan persamaan regeresi linearnya yaitu y=0,012x+0.002 dan nilai R2=0,988. Nilai R pada literatur juga mendekati 1 dimana sudah mendekati uji kebenaran. Hal ini dapat diakatakan bahwa data hasil praktikum sudah sesuai dngan literatur.
Kesimpulan
Prinsip dari kromatografi kolom adalah memisahkan komponen secara selektif berdasarkan sifat adsorbsi senyawa terhadap fase mobile maupun fase stasioner yang digunakan. Tujuan dari praktikum ini adalah mampu mengidentifikasi peralatan yang diperlukan untuk analisis dengan kromatografi kolom adsorbs, mampu mengoperasikan peralatan yang digunakan untuk analisis dengan kromatografi kolom adsorpsi dengan benar, mengetahui prinsip dasar analisis dengan kromatografi kolom adsorpsi, serta mengetahui prinsip dasar kromatografi kolom adsorpsi.
Adapun hasil dari praktikum, nilai absorbansi yang didapatkan dari sampel adalah 0.279 sehingga didapatkan hasil perhitungan konsentrasi betakaroten 2,64x10-5. Sedangkan hasil perhitungan kadar betakaroten pada sampel wortel adalah 1,835 mg/gram.
Daftar Pustaka tambahan
Mohrman, J. 2012. Foods That Contain Beta-Carotene. [online].
(http://www.livestrong.com/article/111260-foods-contain-betacarotene/ diakses pada tanggal 17 Mei 2016 pukul 16.03)
Mustafa, A., Leire M., dan Charlotta T. 2012. Pressurized Hot Ethanol Extraction of Carotenoids from Carrot By-Products. Journal Molecule. Vol. 17
Rodriguez, D. B. 2007. A Guide To Carotenoid Analysis In Foods. Washington D.C: ILSI Press
Sathya, M., Sumanthi, dan John J. 2014. A Simple and Rapid Screening Technique for Grain Beta Carotene content in Pearl Millet Through Spectrophotometric Method. African Journal of Agricultural Research. Vol. 9 No. 5
Satriyanto, Budi dkk. 2012. Stabilitas Warna Ekstrak Buah Merah (Pandanus conoideus) Terhadap Pemanasan Sebagai Sumber Potensial Pigmen Alami . Fakultas Teknologi Pertanian, Universitas Brawijaya. Malang
Wahyuni, Dyah Tri dkk. 2015. Pengaruh Jenis Pelarut dan Lama Ekstraksi Terhadap Ekstrak Karotenoid Labu Kuning dengan Metode Gelombang Ultrasonik . Jurnal Pangan dan Agroindustri. 3(2): 390-401
Diagram Alir
1. Proses Ekstraksi Betakaroten dari Sampel Wortel
Dihaluskan dan ditimbang sebanyak 3 gram Dimasukkan erlenmeyer
Ditutup dan dishaker selama 10 menit, kecepatan skala 3 Disaring
Dituangkan kedalam labu ukur 100 ml
Ditambahkan hingga tanda batas dan dihomogenkan Diambil 50 ml dan dimasukkan corong pemisah
Dimasukkan pada corong pemisah dan digojog Dibiarkan sampai membentuk lapisan
Lapisan bening bawah dibuang
Lapisan kuning dimasukkan dalam gelas ukur untuk mengukur volume Dipindahkan ke gelas beker
Hasil 30 ml petroleum eter-aseton 1:1 Residu total3 X 30 ml petroleum eter-aseton 1:1 50 ml a uades total3 X
2. Proses Pemisahan Fraksi Senyawa Menggunakan Kromatografi Kolom Fase eter
Dimasukkan gelas ukur untuk menghitung volume
Ditambahkan tiap 20 ml fase eter Dimasukkan dalam kolom kromatografi
Dipompa vakum
Dielusikan ke dalam kolom
Didapatkan betakaroten dan dimasukkan labu ukur 25 ml
Ditambahkan hingga tandabatas
Diukur absorbansi panjang gelombang 450 nm Dihitung kadar betakaroten
Hasil 1 gram Na2SO4 Larutan petroleum eter-aseton (10:1) Larutan petroleum eter-aseton (10:1)
3. Pembuatan Larutan Standar Betakaroten
10 mg betakaroten
Dimasukkan dalam labu ukur 25 ml
Ditambahkan hingga tanda batas dan dihomogenkan Dishaker hingga larut
Diambil pada volume
0.25 ml, 0.5 ml, 0.75 ml, 1 ml, dan 1.25 ml Dimasukkan masing-masing pada labu ukur 25 ml
Ditambahkan hingga tanda batas dan dihomogenkan Diambil 1 ml untuk masing-masing volume Dimasukkan dalam masing-masing labu ukur 10 ml
Ditambahkan masing-masing hingga tanda batas dan dihomogenkan Diukur absorbansi masing-masing larutan
Dibuat kurva hubungan konsentrasi dan absorbansi Dihitung persamaan linear
Larutan petroleum eter-aseton (10:1) Larutan petroleum eter-aseton (10:1) Larutan petroleum eter-aseton (10:1) Hasil
