BAB IV. KROMATOGRAFI CAIR
A. INTERAKSI SOLUT-FASE GERAK-FASE DIAM
Sistem paling sedrhana dari kromatografi cair adalah kromatografi kolom terbuka. Sistem ini tergolong non-instrumental method. Hampir semua sampel dapat dianalisis dengan metode ini dan tidak perlu pre treatment seperti penguapan pada kromatografi gas. Hal yang menjadi kekurangan dari sistem ini adalah keterbatasannya dalam menjaga laju alir fase gerak dan membuat fase diam terpacking secara merata. Oleh karena itu dalam banyak kasus sering terjadi pelebaran pita kromatogram.
Ada banyak macam interaksi solut-fase diam-fase gerak yang mendasari terjadinya proses pemisahan dalam kromatografi ini, yaitu : Adsorpsi permukaan (didasarkan pada mekanisme adsorpsi-desorpsi solut dalam fase diam)
1. Partisi (didasarkan pada partisis solut dalam fase diam dan fase gerak) 2. Ion exchange atau pertukaran ion (didasarkan pada pertukaran ion solut
dan fase diam)
3. Eksklusi (didasarkan pada perbedaan ukuran partikel solut)
Kromatografi adsorpsi
Dalam kromatografi adsorpsi fase diam yang digunakan merupakan padatan biasanya silika dan alumina. Solut dan fase gerak dapat berinteraksi dengan sisi polar dari fase diam. Pemisahan terjadi oleh karena perbedaan kekuatan adsorpsi solut terhadap fase diam.
Fase diam alumina dapat digunakan untuk analisis amina dan derivatnya. Fase gerak yang dapat dipakai adalah heksana, kloroform atau 2-propanol. Sedangkan fase diam silika dapat digunakan untuk analisis eter, ester, porphirin dan vitamin larut lemak. Fase gerak yang dapat dipakai adalah heksana, kloroform dan 2-propanol.
Kromatografi Partisi
Pemisahan dalm kromatografi partisi terjadi oleh karena adanya partisis solut dalam dua fase cair yang berbeda. Perjalanan solut dalam kolom hampir sama dengan perjalanan solut dalam ekstraksi berkelanjutan. Solut yang lebih larut dalam fase diam akan tertahan lebih lama dalam kolom daripada solut yang
kelarutannya dalam fase diam kecil. Ada dua tipe dalam kromatografi partisi yaitu :
1. Normal phase chromatography atau kromatografi fase normal, bila fase diamnya bersifat polar dan fase geraknya bersifat non polar. Fase diam yang dapat digunakan adalah amino (-NH2), Cyano (-CN) dan Diol (glycidoxy-ethilmethokxysilane)
2. Reverse phase chromatography atau kromatografi fase terbalik, bila fase diamnya bersifat non polar dan fase geraknya bersifat polar. Fase diam yang dapat digunakan adalah RP-2 ( Si-CH2-CH3 ), RP-8 (Si-(CH2)7 -CH3), RP-18 (Si-(CH2)17-CH3.
Ion Exchange Chromatography atau Kromatografi Penukar Ion
Fase diam yang digunakan adalah molekul yang memiliki muatan ionik di permukaannya dan muatannya berlawanan dengan muatan ionik solut. Kadang molekul fase diam ini diikatkan pada bahan penyangga. Kromatografi tipe ini cocok digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa ionik.
Pada gambar di atas fase diam mempunyai muatan positif. Bila ada solut yang bermuatan positif lebih kuat maka dapat mendesak dan menggantikan muatan positif fase diam dan terjadilah proses retensi solut dalam fase diam. Adanya perbedaan kekuatan interaksi antara solut dan fase diam menyebabkan terjadinya pemisahan. Ada dua macam kromatografi penukar ion yaitu :
1. Penukar kation (cationic exchange}, bila muatan yang dipertukarkan adalah positif
X+ + R-K+ X+R- + K+
Penukar kation kuat dapat menggunakan golongan asam sulfonat, sedangkan penukar kation lemah dapat menggunakan golongan karboksilat (-COOH)
2. Penukar anion (anionic exchange), bila muatan yang dipertukarkan adalah negatif
x- + R+Cl- X-R+ + Cl
-Penukar anion kuat dapat menggunakan golongan amino quarterner, sedangkan penukar anion lemah dapat menggunakan golongan amin primer.
Di samping pemilihan fase diam, perlu mendapat perhatian adalah pemilihan buffer. Derajat keasaman (pH) buffer harus dipilih pada pH di mana komponen sampel yang akan dianalisis berada dalam bentuk ion. Untuk pemisahan anion disarankan pH>6 atau pH>pKa, sedangkan untuk pemisahan kation disarankan pH<6 atau pH<pKa. Konsentrasi buffer juga harus seminimal mungkin untuk menghindari terjadinya kompetisi dengan solut.
Size Exclusion Chromatographyatoau Kromatografi Eksklusi
Kromatografi eksklusi juga disebut kromatogarfi permeasi gel. Proses pemisahan didasarkan pada ukuran partikel solut. Sebagai fase diam adalah material yang terkontrol ukuran partikelnya, bisa silika atau gelas yang ukuran partikelnya terkontrol atau gel organik seperti agarosa dan poliakrilamid. Sistem kromatografi ini biasa dipakai untuk menentukan ukuran partikel dari senyawa polimer seperti protein. Partikel solut denan ukuran partikel besar akan terelusi lebih cepat karena mereka melewati ruang antar partikel fase diam. Sebaliknya, partikel solut dengan ukuran partikel kecil akan terelusi lebih lama karena mereka harus melewati pori-pori fase diam.
Ion Pair Chromatography atau Kromatografi Pasangan Ion
Prinsip pemisahan tidak berbeda jauh dengan kromatografi penukar ion yaitu adanya pergantian ion solut dengan ion fase diam seperti pada gambar III.6. Hanya saja fase diam yang dipakai adalah fase diam reverse phase Q atau C18. Lapisan muatan fase diam dibuat dengan jalan melewatkan fase gerak yang berisi pasangan ion. Pasangan ion selanjutnya akan mengimpregnasi C8 atau C18 sehingga fase diam menjadi bermuatan. Pasangan ion fase gerak tertata melapisi C8 atau C18 dengan muatan positif berada bebas dan muatan negatif terikat pada C8 atau Q8. Bila terdapat ion positif lebih kuat daripada muatan positif fase gerak, maka ion solut ini akan mengganti kedudukannya dan menjadi tertahan dalam kolom. Untuk mengeluarkan solut maka dilakukan pendesakan dengan fase gerak yang memiliki kekuatan muatan positif jauh lebih kuat daripada muatan ion positif ion solut.
B. Pemilihan Fase Gerak
Untuk menentukan jenis fase gerak maka perlu mengetahui terlebih dahulu sistem kromatografi apa
kromatografi didasarkan pada jenis dan sifat dari solut yang akan dianalisis. Berikut ini garis besar menentukan sistem kromatografi yang sesuai.
Dalam memilih fase gerak, perlu memperhatikan dua hal penting yaitu : 1. Solvent strength,
Sebagai fase diam acuan adalah silika atau alumina.
2. Polarity index, yaitu kepolaran dari fase gerak, terutama dalam kromatografi fase terbalik.
Harga solvent strength
mencampur lebih dari satu macam pelarut.
Pemilihan fase gerak untuk kromatografi fase terbalik didasarkan pada hukum Snyder. Menurut Snyder solven atau pelarut dapat diklasifikasikan menjadi tujuh golongan berdasarkan keasaman,
sifat kimianya, seperti gambar IV. 1 dan tabel IV. 1 berikut ini.
Gambar IV. 1. Skema pemilihan sistem kromatografi Pemilihan Fase Gerak
Untuk menentukan jenis fase gerak maka perlu mengetahui terlebih dahulu sistem kromatografi apa yang akan dikerjakan. Pemilihan sistem kromatografi didasarkan pada jenis dan sifat dari solut yang akan dianalisis. Berikut ini garis besar menentukan sistem kromatografi yang sesuai.
Dalam memilih fase gerak, perlu memperhatikan dua hal penting yaitu : Solvent strength, yaitu kemampuan membawa solut melintasi fase diam. Sebagai fase diam acuan adalah silika atau alumina.
yaitu kepolaran dari fase gerak, terutama dalam kromatografi
solvent strength dan plarity yang optimum dapat dicari dengan mencampur lebih dari satu macam pelarut.
Pemilihan fase gerak untuk kromatografi fase terbalik didasarkan pada Menurut Snyder solven atau pelarut dapat diklasifikasikan menjadi tujuh golongan berdasarkan keasaman, kebasaan, momen dipol dan sifat kimianya, seperti gambar IV. 1 dan tabel IV. 1 berikut ini.
Gambar IV. 1. Skema pemilihan sistem kromatografi
Untuk menentukan jenis fase gerak maka perlu mengetahui terlebih yang akan dikerjakan. Pemilihan sistem kromatografi didasarkan pada jenis dan sifat dari solut yang akan dianalisis. Berikut ini garis besar menentukan sistem kromatografi yang sesuai.
Dalam memilih fase gerak, perlu memperhatikan dua hal penting yaitu : yaitu kemampuan membawa solut melintasi fase diam.
yaitu kepolaran dari fase gerak, terutama dalam kromatografi
optimum dapat dicari dengan
Pemilihan fase gerak untuk kromatografi fase terbalik didasarkan pada Menurut Snyder solven atau pelarut dapat diklasifikasikan kebasaan, momen dipol dan
Tabel IV. 1. Klasifikasi solven menurut Snyder GOLONGAN
I ETER ALIFATIK, ALKIL II ALKOHOL ALIFATIK
III TETRA HIDRO FURAN, PIRIDIN, DIMETIL SULFOKSIDA, AMIDA
IV FORNAMIDA, ASAM ASETAT, GLIKOL
V DIKLORMETAN, 1,2
VI ALKIL HALIDA, ESTER, KETON, NITRIL VII BENZENA DAN DERIVATNYA
VIII KLOROFORM, M
Gambar IV.2. Pembagian solven berdasarkan Snyder
Dalam praktek tidak semua solven tersebut dapat dipakai karena beberapa alasan, antara lain :
Tidak semua dapat dicampur pada berbagai perbandingan Menimbulkan interaksi kimia
Mengganggu sinyal de Viskositas sangat tinggi Toksik dan mudah terbakar
Tabel IV. 1. Klasifikasi solven menurut Snyder
CONTOH SOLVEN ETER ALIFATIK, ALKIL AMINA
ALKOHOL ALIFATIK
TETRA HIDRO FURAN, PIRIDIN, DIMETIL SULFOKSIDA, AMIDA
FORNAMIDA, ASAM ASETAT, GLIKOL DIKLORMETAN, 1,2-DIKLOROETIL ALKIL HALIDA, ESTER, KETON, NITRIL BENZENA DAN DERIVATNYA
KLOROFORM, M-KRESOL, AIR
Gambar IV.2. Pembagian solven berdasarkan Snyder
Dalam praktek tidak semua solven tersebut dapat dipakai karena beberapa alasan, antara lain :
Tidak semua dapat dicampur pada berbagai perbandingan Menimbulkan interaksi kimia
Mengganggu sinyal detektor, seperti dapat menyerap sinar ultra violet Viskositas sangat tinggi
Toksik dan mudah terbakar
TETRA HIDRO FURAN, PIRIDIN, DIMETIL SULFOKSIDA,
Gambar IV.2. Pembagian solven berdasarkan Snyder
Dalam praktek tidak semua solven tersebut dapat dipakai karena
Tidak semua dapat dicampur pada berbagai perbandingan
Tekanan uapnya terlalu tinggi Terlalu mahal
Dari sekian jenis solven yang paling sering digunakan adalah : Metanol, mewakili golongan asam
Asetonitril, mewakili golongan basa
Terra hidro furan, mewakili golongan yang mempunyai momen dipol besar
Air, untuk mengatur polaritas
Syarat fase gerak yang baik untuk kromatografi cair adalah : Viskositas rendah
Tersedia dalam kemurnian yang tinggi Tidak menginterferensi sinyal detektor
Dapat bercampur dengan fase gerak yang lain
Untuk meningkatkan resolusi pemisahan dan efektifitas elusi, maka teknik elusi dapat dikembangkan, yaitu dengan teknik elusi gradien. Elusi gradien adalah elusi menggunakan komposisi fase gerak yang diubah-ubah secara terprogram, sedangkan bila elusi dikerjakan dengan satu macam komposisi fase gerak mulai dari start hingga finish disebut elusi isokratik. Perubahan komposisi fase gerak dapat dikerjakan secara linear atau non linear (curved program). Dengan teknik elusi gradien maka resolusi dapat diatur sedemikian rupa sehingga waktu analisis dapat dipersingkat. Teknik elusi gradien ini terutama ditujukan untuk :
Sampel yang terdiri dari campuran senyawa yang meiliki kisaran harga factor kapasitas 0.5<k'<20
Sampel yang terdiri dari molekul-molekul dengan berat molekul cukup besar (BM>1000)
Sampel yang mengandung senyawa pengganggu dengan waktu retensi sangat besar
Sampel dengan konsentrasi sangat encer sehingga volume yang dianalisis sangat banyak. Dengan teknik ini diharapkan dapat meminimalkan pelebaran pita kromatogram karena overload volume.
C. Instrumentasi Kromatografi Kolom Terbuka
Instrumentasi dalam kromatografi cair kolom terbuka hanya terdiri dari kolom tempat fase diam yang terbuat dari kaca, tempat fase gerak dan tampungan hasil elusi yang dapat menggunakan erlenmeyer atau beker glass. Hasil elusi selanjutnya dapat dianalisis menggunakan detektor yang sesuai.
Gambar IV.3. Instrumentasi kromatografi kolom
Kromatografi kolom terbuka biasanya dimanfaatkan untuk clean up atau pembersihan suatu larutan atau ekstrak sampel sebelum akhirnya dianalisis secara instrumentasi. Seperti misalnya pada penghilangan klorofil dari ekstrak tanaman menggunakan kolom berisi fase diam florisil atau penghilangan lemak dari ekstrak makanan dengan menggunakan kolom berisi fase diam alumina.
D. Solid Phase Extraction SPE (Ekstraksi Padat Cair)
Bila dibandingkan dengan ekstraksi cair-cair seperti yang umum dipakai, SPE memiliki banyak keuntungan, yaitu :
Ekstraksi analit lebih komplit atau sempurna
Pemisahan bahan pengganggu dari analit lebih efisien Mengurangi kebutuhan pelarut
Fraksinasi terhadap larutan sampel lebih mudah dikerjakan Dapat menghilangkan partikulat
Mudah dilakukan otomatisasi
cartridge cukup besar dan sering terjadi adsorbs! irreversibel komponen dalam cartridge.
Teknik SPE ini dapat diaplikasikan untuk keperluan antara lain : Menghilangkan material pengganngu dan perusak kolom HPLC Pemekatan sampel
Desalting atau menghilangkan garam Penggantian pelarut
Derivatisasi in situ
Penyimpanan sampel terutama dalam masa transportasi sampel
E. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
HPLC merupakan pengembangan dari kromatografi kolom terbuka. HPLC digunakan untuk analisis senyawa yang non vol
dalam HPLC merupakan material yang dipacking dalam kolom dan memiliki ukuran partikel berdiameter 3
melewati fase diam hanya dengan mengandalkan gaya gravitasi seperti pada kromatografi kolom terbuka. Diperlukan suatu pompa yang mendorong fase gerak agar dapat melewati fase diam dengan kecepatan tertentu yang dapat memberikan jumlah lempeng teoritik maksimum, sehingga mendapatkan pemisahan yang maksimal.
Pilihan detektor untuk HPLC
kromatografi gas. Detektor yang paling banyak dipergunakan adalah spektrofotometer dengan keterbatasan hanya molekul yang dapat mengabsorpsi sinar saj'a yang dapat dianalisis.
cartridge cukup besar dan sering terjadi adsorbs! irreversibel komponen dalam cartridge.
Teknik SPE ini dapat diaplikasikan untuk keperluan antara lain : Menghilangkan material pengganngu dan perusak kolom HPLC Pemekatan sampel
Desalting atau menghilangkan garam-garam Penggantian pelarut
Derivatisasi in situ
Penyimpanan sampel terutama dalam masa transportasi sampel
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
HPLC merupakan pengembangan dari kromatografi kolom terbuka. HPLC digunakan untuk analisis senyawa yang non volatil dan termolabil. Fase diam dalam HPLC merupakan material yang dipacking dalam kolom dan memiliki ukuran partikel berdiameter 3-10µm. Oleh karena itu fase gerak tidak dapat melewati fase diam hanya dengan mengandalkan gaya gravitasi seperti pada grafi kolom terbuka. Diperlukan suatu pompa yang mendorong fase gerak agar dapat melewati fase diam dengan kecepatan tertentu yang dapat memberikan jumlah lempeng teoritik maksimum, sehingga mendapatkan pemisahan yang maksimal.
Pilihan detektor untuk HPLC lebih terbatas bila dibandingkan dengan kromatografi gas. Detektor yang paling banyak dipergunakan adalah spektrofotometer dengan keterbatasan hanya molekul yang dapat mengabsorpsi sinar saj'a yang dapat dianalisis.
Gambar IV.4. Bagan alat HPLC
cartridge cukup besar dan sering terjadi adsorbs! irreversibel beberapa
Teknik SPE ini dapat diaplikasikan untuk keperluan antara lain : Menghilangkan material pengganngu dan perusak kolom HPLC
Penyimpanan sampel terutama dalam masa transportasi sampel
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi
HPLC merupakan pengembangan dari kromatografi kolom terbuka. HPLC atil dan termolabil. Fase diam dalam HPLC merupakan material yang dipacking dalam kolom dan memiliki m. Oleh karena itu fase gerak tidak dapat melewati fase diam hanya dengan mengandalkan gaya gravitasi seperti pada grafi kolom terbuka. Diperlukan suatu pompa yang mendorong fase gerak agar dapat melewati fase diam dengan kecepatan tertentu yang dapat memberikan jumlah lempeng teoritik maksimum, sehingga mendapatkan
lebih terbatas bila dibandingkan dengan kromatografi gas. Detektor yang paling banyak dipergunakan adalah spektrofotometer dengan keterbatasan hanya molekul yang dapat mengabsorpsi
Solven atau fase gerak untuk HPLC hendaknya memenuhi kriteria : Mempunyai kemurnian tinggi
Sebelum digunakan disaring terlebih dahulu dengan kertas saring dengan ukuran pori 0.2 µm
Bebas dari gas yang dapat mengganggu detektor atau menyumbat kolom.Dapat dilakukan dengan memanaskan solven sebelum digunakan atau mengaplikasikan motor vaccum.
Keterangan Bagan Alat HPLC
Gradient controller atau pengatur gradien, adalah alat untuk mengatur komposisi fase gerak apabila elusi dikerjakan secara gradien
Pump/dampning system, adalah pompa yuntuk menyedot fase gerak yang dilengkapi dengan peredam getaran, sehingga aliran fase gerak stabil tidak dipengaruhi oleh getaran pompa selama bekerja.
Sample introduction, adalah alat untuk memasukkan sampel biasanya berupa rotary loop. Ketika injektor berada dalam posisi load sampel dimasukkan dengan bantuan syringe, sehingga sampel akan memenuhi tempat penampungan sampel. Bila volume sampel terlalu besar, maka kelebihan sampel akan terbuang secara otomatis ke saluran pembuangan (vent). Ketika injektor ini diposisikan inject, maka aliran fase gerak akan berubah, fase gerak akan mengalir dengan membawa sampel ke arah kolom.
Column/Pre column, adalah bagian jantung pemisahan dalam HPLC. Kolom biasanya terbuat dari bahan stainless steel dan ukuran diameter dalam terukur dengan presisi tinggi. Guard column adalah kolom berukuran kecil yang diletakkan di antara injektor dan kolom analitik. Fungsinya adalah untuk menahan senyawa yang kemungkinan dapat menyumbat kolom analitik. Fase diam dibuat dari jenis bahan yang sesuai dengan fase diam pada kolom analitik. Kolom analitik biasanya berukuran panjang 15 cm, diameter dalam 4.6 mm dengan ukuran partikel fase diam 10 µm (memiliki jumlah lempeng teoritik sekitar 5000), 5 µm (memiliki jumlah lempeng teoritik sekitar 9000), 3 µm (memiliki jumlah lempeng teoritik sekitar 15000). Agar diperoleh hasil pemisahan yang baik, maka perlu dilakukan evaluasi kolom secara berkala. Evaluasi terhadap kelayakan kolom dapat dipantau dengan mengevaluasi harga beberapa parameter di bawah ini secara berkala :
Faktor kapasitas berkisar 2-10
Jumlah lempeng teoritik tidak mengalami perubahan yang signifikan Faktor resolusi (Rs) harus > 1.5
Peak asimetri < 1.2
Tekanan kolom dalam kisaran normal (dapat dikerjakan oleh pompa dengan ringan)
Ada banyak faktor yang mempengaruhi efisiensi kolom sehingga harus dioptimasi agar diperoleh pemisahan yang baik, yaitu :
Kecepatan alir fase gerak, kecepatan alir yang sangat lambat akan menyebabkan terjadinya difusi longitudinal, sedangkan bila terlalu cepat akan menyebabkan terjadinya transfer masa non ekuilibrium, sehingga terjadi pelebaran pita kromatogram
Ukuran partikel fase diam, semakin kecil ukuran partikel maka efisiensi semakin baik Tetapi menyebabkan tekanan dalam kolom semakin besar sehingga dibutuhkan kekuatan pompa yang semakin besar.
Panjang kolom, semakin panjang akan semakin besar harga efisiensi kolom, tetapi dapat menyebabkan terjadinya pelebaran pita.
Viskositas fase gerak, semakin kecil harga viskositas fase gerak maka efisiensi kolom semakin besar.
Temperatur, semakin tinggi temperatur maka viskositas semakin rendah dan efisiensi kolom menjadi lebih besar.
Volume ekstra kolom, semakin besar volume ekstra kolom maka kemungkinan terjadinya pelebaran pita semakin besar, sehingga efisiensi semakin berkurang.
Jumlah sampel dan volume sampel, bila jumlah maupun volume sampel sangat besar (overload) maka kemungkinan terjadinya pelebaran pita semakin besar, sehingga efisiensi semakin berkurang.
Detector, merupakan alat untuk melihat adanya sinyal dari analit atau solut yang sedang dianalisis. Hendaknya memiliki kriteria : sensitivitasnya tinggi, batas deteksi rendah, linearitas respon tinggi dan reprodusibilitasnya tinggi. Ada banyak detektor yang dapat diaplikasikan, yaitu :
Detektor spektrofotometer UV/Vis, merupakan detektor universal dan dapat diaplikasikan pada semua analit yang dapat menyerap sinar uv/vis.
Fase gerak yang dipakai tidak boleh menyerap sinar uv/vis pada panjang gelombang yang dipilih.
Detektor spektrofluorometer, merupakan detektor yang lebih selektif dan lebih sensitif daripada detektor spektrofotometer. Tidak semua senyawa bersifat fluoresens dan tidak semua senyawa yang berfluorsens memiliki panjang gelombang eksitasi dan emisi yang sama dengan senyawa lain. Detektor indeks bias, merupakan detektor yang sinyalnya tergantung
pada perubahan harga indeks bias fase gerak oleh karena adanya analit atau solut.
Detektor elektrokimia, ada banyak jenisnya antara lain : detektor konstanta dielektrika (didasarkan pada perubahan polaritas fase gerak oleh karena adanya solut), detektor konduktometer (didasarkan pada perubahan sifat penghantaran listrik dari fase gerak oleh karena adanya solut), detector amperometer (didasarkan adanya perubahan kekuatan medan listrik dari fase gerak karena adanya solut).
Contoh Aplikasi Pemisahan Peptida Dan Protein Dengan Rp-HPLC
Kondisi Awal Yang Bisa Dipakai:
VARIABEL PEPTIDA PROTEIN
Kolom Bonded phase Dimensi Partikel C18 atau C8 0.46 X 15 atau 25 cm 3.5-10 µm (diameter) 80-300 A° (pori) C4, C3, CN 0.46 x 5-15 cm 3.5-10 µm (diameter) 300 A° (pori)
Fase gerak Solven A Solven B Gradien 0.12% TFA/air 0.10%TFA/air 0-60% B/60 menit 0.12% TFA/air 0.10%TFA/air 0-60% B/60 menit Temperatur 40 - 80 °C 40 - 80 °C
Kecepatan alir 0.5 - 2 ml/menit 0.5 - 2 ml/menit Ukuran sampel Volume
Berat
10-50 µL 1-100 µg
10-50 µL 1-100 µg
Problem yang mungkin muncul:
Bentuk pita yang jelek : melebar, tailing Recovery rendah
Timbul pita yang misterius Pita ganda untuk satu jenis analit
Performance kolom berubah, tr tidak reprodusibel Faktor penyebab :
Kolom rusak, terlalu asam, terlalu hidrofob, terlalu kecil ukuran pori-porinya
Denaturesi sampel Isomerisasi (cis ke trans) Pengatasannya :
Pemisahan pada ph rendah (fase gerak 0.1 % Tetra fluoro Acid)
Gunakan asetonitril sebagai solven organik. Untuk sampel yang hidrofob gunakan propanol
Analisis dikerjakan pada temperatur kolom 50 - 80°c Gunakan zwitterionic detergent
Contoh aplikasi pemisahan peptida dan protein dengan ion exchange HPLC Kondisi yang bisa dipakai :
VARIABEL PROTEIN ASAM
(ANION EXCHANGE) PROTEIN BASA (KATION EXCHANGE) Kolom Bonded phase Ukuran
DEAE, SAX, PEI 5-25 x 0.46cm CM, SP 5-25 x 0.46 cm Fase gerak Solven A Solven B Gradien
10mm tris atau phosphat (pH 8) Solvent A + 0.5m NaCI atau Na-asetat
0-100% B dalam 30 menit
10mm bis-tris atau phosphat (pH 6) Solvent A + 0.5m NaCI atau Na-asetat
0-100% B dalam 30 menit
Temperatur 35 °c 35 °c
Ukuran sampel Volume Berat 10-50 µl 1-100 µg 10-50 µl 1-100 µg Keuntungan :
Konformasi protein tetap terjaga, Kemungkinan denaturasi kecil,
Dapat digunakan untuk isolasi dan purifikasi protein dengan tetap berbentuk bioaktif
Protein basa biasa memakai kation exchange, dengan ph 3 Problem yang sering muncul:
Recovery rendah dan dapat diatasi dengan menggunakan gradien elusi dengan fase gerak mengandung garam.
Contoh analisis campuran aspartam, benzoat dan kafein dengan RP-HPLC
Variabel Kondisi
Fase diam C18, panjang 15 cm
Fase gerak A : asam asetat 0.02 M dalam air pH 4.0; B : asetonitril
Elusi 85 % A dan 15 % B, kecepatan alir 1 ml/menit
Temperatur Temperatur kamar
Detektor Spektrofotometer UV 254 nm
Volume injeksi 20 µl
Perhitungan Standard eksternal
Contoh analisis campuran asam salisilat, kafein dan parasetamol dengan RP-HPLC
Variabel Kondisi
Fase diam C18, panjang 15 cm
Fase gerak A : buffer TBA, dibuat dengan melarutkan 4.0 gram KH2P04 dan 1.5 gram Tetra butilamonium bromida dalam 350 ml aquadest (larutan 1).
Melarutkan NaaHP04 dalam aquadest hingga diperoleh konsentrasi lg/100 ml (larutan 2). Campur larutan 1 dan 2 hingga diperoleh pH 6. Encerkan dengan aquadest hingga 1 L.
B : Asetonitril
Elusi 85 % A dan 15 % B, kecepatan alir l ml/menit
Temperatur Temperatur kamar
Detektor Spektrofotometer UV 254 nm atau ߣ, maksimumnya
Volume injeksi 20 µl
