268
PEMILIHAN SISTEM KROMATOGRAFI PADA PENENTUAN
99mTc-TEREDUKSI RADIOFARMAKA
99mTc-SIPROFLOKSASIN
Eva Maria Widyasari, Nurlaila Zainuddin, Epy Isabela dan Witri Nuraeni
Pusat Teknologi Nuklir Bahan dan Radiometri, Badan Tenaga Nuklir NasionalJl. Tamansari No.71 Bandung 40132
ABSTAK
PEMILIHAN SISTEM KROMATOGRAFI PADA PENENTUAN 99mTc-TEREDUKSI
RADIOFARMAKA 99mTc-SIPROFLOKSASIN. Radiofarmaka 99mTc-Siprofloksasin telah berhasil diteliti dan dikembangkan sebagi radiofarmaka untuk diagnosis infeksi. Pada beberapa penelitian terdahulu, penentuan kemurnian radiokimia dari 99mTc-Siprofloksasin dilakukan menggunakan 2 macam sistem kromatografi, yaitu kromatografi kertas Whatman 1 menggunakan eluen metil etil keton untuk memisahkan pengotor radiokimia 99mTc-perteknetrat bebas dan ITLC-SG menggunakan eluen etanol:air:ammonia=2:5:1 yang dapat memisahkan 99mTc-tereduksi bebas. Dengan tidak tersedianya lagi ITLC-SG di pasaran maka perlu dicari sistem kromatografi baru pengganti ITLC-SG. Pada penelitian ini berbagai sistem kromatografi dicoba untuk mendapatkan sistem kromatografi pengganti ITLC-SG. Sistem kromatografi TLC-SG menggunakan eluen etanol:air:amonia=2:5:1 memberikan pengotor radiokimia 99mTc-tereduksi yang mirip dengan sistem kromatografi ITLC-SG menggunakan eluen etanol:air:amonia=2:5:1 namun waktu elusi yang dibutuhkan cukup panjang yaitu 2 jam. Penambahan amonia dalam eluen yang digunakan akan memperpendek waktu elusinya 15-30 menit. Selain TLC-SG menggunakan eluen (etanol:air:amonia=2:5:1) sistem kromatografi ITLC-SA menggunakan eluen etanol:air:amonia=2:7:1 dapat juga digunakan sebagai pengganti sistem kromatografi ITLC-SG menggunakan eluen etanol:air:amonia=2:5:1 dan waktu elusinya lebih singkat dibandingkan sistem kromatografi TLC-SG menggunakan eluen etanol:air:amonia=2:5:1.
Kata kunci: kromatografi, ITLC-SG, 99mTc-siprofloksasin
...
...
ABSTRACT
ELECTION OF SYSTEM CHROMATOGRAPHY IN DETERMINING 99mTc-REDUCED
99mTc-CIPROFLOXACIN RADIOPHARMACEUTICAL. 99mTc-Ciprofloxacin radiopharmaceutical
has successfully researched and developed as a radiopharmaceutical for the diagnosis of infection. In some previous studies, the determination of radiochemical purity of 99mTc-Ciprofloxacin performed using 2 kinds of chromatographic systems, paper chromatography Whatman 1 using eluent methyl ethyl ketone to separate the free 99mTc-perteknetrat radiochemical impurities and ITLC-SG using eluent ethanol:water: ammonia = 2: 5:1 which can separate the free 99mTc-reduced. With the unavailability of longer ITLC-SG in the market it is necessary to look for a new chromatography system replacement ITLC-SG. In this study various chromatography systems tried to get a replacement ITLC-SG chromatography system. Chromatography system TLC-SG using eluent ethanol: water :ammonia =2:5:1 gave radiochemical impurities of 99mTc-reduced similar to the ITLC-SG using eluent ethanol:water: ammonia = 2:5:1 chromatograpy system, but the elution time required 2 hours. The addition of ammonia in the eluent used will shorten the elution time 15-30 minutes
.
In addition to TLC-SG using eluent ethanol: water: ammonia = 2:5:1, ITLC-SA using eluent ethanol: water: ammonia = 2:7:1 chromatography system can also be used as a substitute for ITLC-SG using eluent ethanol : water: ammonia = 2:5:1 chromatography system and the elution time even shorter than the TLC-SG using eluent ethanol: water: ammonia =2:5:1 chromatography system.269
Keywords: chromatography, ITLC-SG, 99mTc-ciprofloxcin
1. PENDAHULUAN
Sejak tahun 2003 PTNBR telah melakukan penelitian pengembangan dan modifikasi radiofarmaka 99mTc-siprofloksasin sebagai penyidik infeksi dan hingga saat ini masih
dilakukan pengembangan untuk
menyempurnakan radiofarmaka tersebut. Secara umum faktor utama penentu keberhasilan dari pencitraan suatu organ tubuh dengan radiofarmaka bertanda radioaktif, baik untuk deteksi atau terapi suatu penyakit salah satunya ditentukan oleh kemurnian radiokimia dari radiofarmaka yang digunakan. Oleh karena itu pengawasan terhadap mutu dari radiofarmaka yang diproduksi khususnya kemurnian radiokimianya merupakan hal yang mutlak dilakukan untuk memastikan radiofarmaka layak atau tidak digunakan untuk pasien. Dari penelitian sebelumnya kemurnian radiokimia dari 99mTc-siprofloksasin ditentukan menggunakan metode kromatografi dengan dua macam sistem kromatografi, yaitu kromatografi kertas Whatman 1 dengan eluen metil etil keton untuk memisahkan pengotor radiokimia 99m Tc-perteknetrat bebas dan ITLC-SG dengan campuran eluen etanol : air : amonia dengan perbandingan 2 : 5 : 1 untuk memisahkan pengotor 99mTc-tereduksi bebas. [1]
Pada tahun 1970an ITLC-SG (Instant
Thin Layer Chromatography Silica Gel)
merupakan plat kromatografi yang direkomendasikan untuk digunakan sebagai fasa stasioner yang ideal dan paling banyak digunakan dalam penentuan kemurnian radiokimia radiofarmaka [2]. Namun pada tahun 2008, perusahaan Pall Corporation sebagai produsen utama ITLC-SG menghentikan produksinya. Sehingga hal ini menimbulkan masalah bagi radiofarmaka yang sebagian besar menggunakan ITLC-SG sebagai fasa stasioner dalam penentuan kemurnian radiokimianya. Sehingga berbagai penelitian dilakukan untuk menentukan sistem kromatografi baru sebagai pengganti dari ITLC-SG.
99m
Tc-siprofloksasin adalah radiofarmaka dalam perkembangannya menggunakan ITLC-SG sebagai fasa stasioner dalam menentuan kemurnian radiokimianya. Dengan menggunakan campuran eluen etanol : air :
amonia = 2 : 5 : 1 dapat memisahkan pengotor
99m
Tc-tereduksi bebas dari 99m Tc-siprofloksasin. Tujuan dari penelitian ini adalah mengembangkan sistem kromatografi baru sebagai pengganti ITLC-SG yang dapat memisahkan 99mTc-tereduksi dari 99m Tc-siprofloksasin.
2. TATA KERJA
2.1. Bahan dan peralatan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : Siprofloksasin HCL (Zhejiang Xianju Shifang Pharmaceutical-Cina), SnCl2 (E.
Merck), asam tartrat (E. Merck), akuabidest steril pro njeksi (IPHA lab.), NaCl fisiologis (IPHA lab.), HCl (E. Merck), NaOH (E. Merck), etanol absolut (E. Merck), amonia (E. Merck), metil etil keton (E. Merck), aseton (E. Merck), asetonitril (E. Merck), ITLC-SG (PALL Scientific), ITLC-SA (PALL Scientific), kertas kromatografi Whatman 1, kertas kromatografi Whatman 3, kertas kromatografi Whatman 3 MM, kertas kromatografi Whatman 31 ET, TLC-SG, (E. Merck) dan TLC-alumina (E. Merck). Semua pereaksi di aliri nitrogen sebelum digunakan.
Peralatan yang digunakan dalam penelitian antara lain: pH meter (Denver instrument),
vortev mixer, dose calibrator (victoreen), Single Chanel Analizer (Ortec), lemari es
(electrolux), vial 10 ml, tutup vial dan almunium, peralatan kromatografi dan peralatan gelas.
2.2. Pembuatan kit cair radiofarmaka siprofloksasin [3]
Sebanyak 1 mL larutan siprofloksasin (2mg/ml NaCl fisiologis) ditambahkan dengan 100 L larutan SnCl2 (1 mg/2 mL HCl 0,01 N)
dan 100 L larutan asam tartrat 0,04 N. Setelah homogen keasaman larutan diatur menjadi pH=3 dengan penambahan NaOH 0,01 N atau HCl 0,01 N. Setiap pembuatan kit cair umumnya dilakukan dalam jumlah yang cukup banyak , sekitar 30 kit disimpan dalam lemari es pada temperatur < 0oC (beku/freezer). Kit cair ini stabil hingga 30 hari penyimpanan.
270
Tabel 1. Hasil analisis jumlah pengotor 99mTc-tereduksi radiofarmaka 99mTc-siprofloksasin dengan berbagai
sistem kromatografi
2.3. Penyiapan radiofarmaka 99m Tc-siprofloksasin
Ke dalam kit cair yang telah dibuat ditambahkan larutan natrium perteknetat (Na99mTcO4) dengan aktivitas 1-5 mCi/0,3 mL.
Campuran dikocok dengan menggunakan pengocok vortex, diinkubasi selama 15 menit pada temperatur kamar kemudian ditentukan kemurnian radiokimianya.
2.4. Penentuan jumlah pengotor 99m Tc-tereduksi radiofarmaka 99m Tc-siprofloksasin
Senyawa bertanda 99mTc-siprofloksasin ditentukan jumlah pengotor 99mTc-tereduksi-nya dengan menggunakan sistem kromatografi dengan memvariasikan berbagai macam fasa stasioner dan berbagai macam fasa gerak. Fasa stasioner yang digunakan berupa kertas kromatografi, plat KLT atau ITLC. Sedangkan fasa gerak yang digunakan dapat berupa eluen tunggal atau campuran. Hasil pengujian jumlah pengotor 99mTc-tereduksi bebas yang diperoleh dibandingkan dengan hasil yang didapatkan dari pengukuran jumlah pengotor 99mTc-tereduksi bebas menggunakan ITLC-SG dengan eluen etanol : air : amonia = 2 : 5 : 1.
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan kadar 99mTc-tereduksi dari radiofarmaka 99mTc-siprofloksasin pada penelitian
ini mulanya dicoba menggunakan berbagai macam sistem kromatografi yang umumnya digunakan untuk memisahkan pengotor 99m Tc-tereduksi pada berbagai radiofarmaka [4], sistem
kromatografi tersebut antara lain adalah Thin
Layer Chromatography-Silica Gel (TLC-SG)
dengan eluen NaCl Fisiologis, Whatman dengan eluen asetonitril 50%, Whatman 31 ET dengan eluen Saline : aseton (1 : 1), Whatman 31 ET dengan eluen asetonitril 50%, Whatman 31 ET dengan eluen NaCl fisiologis, Whatman 3MM dengan eluen air dan Whatman 3MM dengan eluen asetonitril 50%. Hasil yang didapatkan dari pengujian dengan dua kali pengulangan dapat dilihat pada Tabel 1. Dari 7 macam sistem kromatografi yang dicoba tidak ada satu pun sistem kromatografi yang memberikan hasil jumlah pengotor 99m Tc-tereduksi yang sama atau mendekati jumlah pengotor 99mTc-tereduksi yang dihasilkan dengan menggunakan sistem kromatografi ITLC-SG menggunakan campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 5 :1. Semua sistem kromatografi yang diujikan memberikan nilai jumlah pengotor 99mTc-tereduksi yang lebih tinggi dari jumlah pengotor 99mTc-tereduksi yang dihasilkan dengan menggunakan sistem kromatografi ITLC-SG dengan campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 5 : 1, hal ini menunjukkan bahwa kepolaran dari ketujuh sistem kromatografi yang diujikan tidak sesuai untuk memisahkan 99mTc-tereduksi dengan 99mTc-siprofloksasin dan dengan
99mTc-perteknetrat bebas. Bila dilihat dari
eluen yang digunakan oleh ketujuh sistem kromatografi yang diujikan terlihat bahwa eluen yang digunakan memiliki kecenderungan bersifat polar sehingga eluen-eluen tersebut tidak dapat memisahkan dengan baik 99mTc-siprofloksasin yang bersifat non polar dari 99mTc-tereduksi sehingga ada sebagian besar 99mTc-siprofloksasin yang tertinggal di titik 0 bersatu dengan 99m Tc-tereduksi.
No. Fase Diam Fase Gerak 99mJumlah pengetor
Tc-tereduksi % 1. 2. 3. 4. 5 6 7 8 ITLC-SG TLC-SG Whatman 1 Whatman 31-ET Whatman 31-ET Whatman 31-ET Whatman 3MM Whatman 3MM etanol:air:amonia = 2:5:1 NaCl Fisiologis Asetonitril 50 % Saline Aseton (1:1) Asetonitril 50 % NaCl Fisiologis Air NaCl Fisiologis 4,9 ± 1,9 49,2 ± 6,4 57,3 ± 5,3 47,2 ± 0,5 50,3 ± 3,0 64,1 ± 1,4 71,6 ± 6,2 71,1 ± 0,3
271
Hal ini menyebabkan seolah-olah nilai jumlah pengotor 99mTc-tereduksi lebih besar dari pada sistem ITLC-SG dengan campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 5 :1. Oleh sebab itu dicoba menggunakan sistem kromatografi lain yaitu dengan memvariasikan fase diam atau fase stasionernya sedangkan fase geraknya dibuat tetap yaitu menggunakan fase gerak seperti yang digunakan oleh ITLC-SG yaitu campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 5 : 1. Fase diam yang digunakan adalah berbagai macam fase diam yang tersedia di laboratorium Sintesis Senyawa Bertanda BATAN Bandung. Hasil pengujiannya dapat dilihat pada Tabel. 2. Dari 7 macam fase diam yang digunakan TLC-SG menunjukkan nilai jumlah pengotor 99m Tc-tereduksi dari dua kali pengulangan sebesar 6,0 ± 0,7, nilai ini hampir sama dengan nilai yang dihasilkan dengan menggunakan ITLC-SG yaitu 5,8 ± 1,1, Gambar kromatogram ITLC-SG : TLC-SG dapat dilihat pada Gambar 1. Seperti yang terlihat pada Gambar 1, kromatogram yang dihasilkan TLC-SG mirip dengan kromatogram yang dihasilkan oleh ITLC-SG. Kelemahan penggunaan TLC-SG dibandingkan ITLC-SG adalah waktu elusinya yang panjang , untuk TLC-SG dengan panjang 10 cm membutuhkan waktu elusi sekitar 2 jam, sedangkan dengan menggunakn ITLC-SG dengan panjang yang sama yaitu 10 cm hanya membutuhkan waktu elusi sekitar 15 menit. Dari percobaan yang dilakukan oleh Gasiglia [5] pada penentuan kemurnian radiokimia dari 153 Sm-EDTMP penambahan kadar amonia pada eluen yang digunakan akan mengurangi waktu elusi ±15 menit. Oleh karena itu pada penelitian ini juga dicoba menambahkan kadar amonia pada eluen yang digunakan. Dari Tabel 3 terlihat bahwa penambahan kadar amonia dalam eluen tidak berpengaruh terhadap hasilpemisahan jumlah pengotor 99mTc-tereduksi, penambahan kadar amonia dalam eluen hanya berpengaruh terhadap waktu elusi yang dibutuhkan. Penambahan kadar amonia dalam eluen akan mempersingkat waktu elusi antara 15-30 menit. Selain TLC-SG, pengujian jumlah pengotor 99mTc-tereduksi dengan menggunakan fase diam Instant Thin-Layer
Cromatography Silisic Acid (ITLC-SA) seperti yang terlihat pada Tabel 2 menunjukkan nilai pengotor 99mTc-tereduksi yang sedikit lebih tinggi dari yang dihasilkan oleh ITLC-SG yaitu 8,0 ± 2,7. Dengan mengubah kepolaran eluen diharapkan akan didapatkan sistem kromatografi dengan menggunakan ITLC-SA yang memberikan hasil jumlah pengotor 99mTc-tereduksi yang sama atau mendekati hasil yang ditunjukkan dengan menggunakan ITLC-SG. Hasil pengujian dengan menggunakan fase diam ITLC-SA dengan mengatur kepolaran dari eluen yang digunakan dapat dilihat pada Tabel 4. Dari Tabel 4 terlihat bahwa penambahan kadar air dalam eluen yang digunakan berpengaruh terhadap jumlah pengotor 99mTc-tereduksi. 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Jarak, cm A k ti v it a s , c ps ITLC-SG TLC-SG
Gambar 1. Kromatogram ISG dan TLC-SG dengan eluen etanol:air:amonia=2:5:1
Tabel 2. Hasil analisis jumlah pengotor 99mTc-tereduksi radiofarmaka 99mTc-siprofloksasin dengan berbagai fase diam dan fase gerak etanol:air:amonia=2:5:1
No. Fase Diam Fase Gerak 99mJumlah pengetor Tc-tereduksi %
1. 2. 3. 4. 5 6 7 8 ITLC-SG Whatman 1 ITLC-SA Whatman 31-ET Whatman 3MM Whatman 3 TLC-alumina TLC-SG etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:1 5,8 ± 1,1 40,3 ± 7,5 8,0 ± 2,7 48,2 ± 3,2 29,9 ± 1,3 21,9 ± 1,5 24,2 ± 7,0 6,0 ± 0,7
272
Tabel 3. Pengaruh penambahan kadar amonia dalam eluen terhadap jumlah pengotor 99mTc-
tereduksiradiofarmaka 99mTc-siprofloksasin
No. Fase Diam Fase Gerak 99mJumlah pengetor Tc-tereduksi %1
Waktu Elusi (menit) 1. 2. 3 4. ITLC-SG TLC-SG TLC-SG TLC-SG etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:2 etanol:air:amonia = 2:5:3 5,3 ± 0,3 5,3± 0,6 5,1 ± 0.2 5,1 ± 0,3 15 120-145 105-120 90-105 1.Pengukuran rata-rata ± standar deviasi dari empat kali pengulangan
Tabel 4. Pengaruh penambahan kadar air dalam eluen terhadap jumlah pengotor 99mTc-tereduksi radiofarmaka 99mTc-siprofloksasin
No. Fase Diam Fase Gerak Jumlah pengetor
99mTc-tereduksi %1 1. 2. 3. 4. 5. ITLC-SG ITLC-SA ITLC-SA ITLC-SA ITLC-SA etanol:air:ammonia=2:5:1 etanol:air:amonia = 2:5:1 etanol:air:amonia = 2:4:1 etanol:air:amonia = 2:6:1 etanol:air:amonia = 2:7:1 5,3 ± 0,3 8,0 ± 0,6 9,1 ± 0,2 6,0 ± 1,0 5,3 ± 0,6 1. Pengukuran rata-rata ± standar deviasi dari enam kali pengulangan
Eluen No 5 yaitu campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 7 : 1 menghasilkan sistem kromatografi dengan menggunakan fase diam ITLC-SA yang memberikan nilai jumlah pengotor 99mTc-tereduksi yang sama dengan hasil yang diperoleh dengan menggunakan fase diam SG, hal ini disebabkan karena ITLC-SA yang bersifat lebih non polar dibandingkan dengan ITLC-SG [6] maka ITLC-SA memiliki kemampuan yang lebih kuat untuk berinteraksi dengan senyawa – senyawa nonpolar seperti 99mTc-siprofloksasin dibandingkan ITLC-SG, sehingga untuk mendorong agar senyawa 99mTc-siprofloksasin dapat naik dan terpisah dengan baik dengan pengotor 99mTc-tereduksi yang bersifat lebih nonpolar dibandingkan 99mTc-siprofloksasin dibutuhkan eluen yang lebih polar. Selain itu waktu elusi yang dibutuhkan oleh ITLC-SA dengan eluen etanol : air : amonia = 2 : 7 : 1 lebih singkat dibandingkan TLC-SG, ITLC-SA dengan panjang 10 cm membutuhkan waktu elusi sekitar 20 menit.
4. KESIMPULAN
TLC-SG menggunakan campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 5 : 1 dapat digunakan
sebagai sistem kromatografi pengganti ITLC-SG menggunakan campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 5 : 1 pada penentuan 99mTc-tereduksi radiofarmaka 99mTc-siprofliksasin meskipun membutuhkan waktu elusi yang cukup lama. Penambahan kadar amonia dalam eluen yang digunakan dapat mempersingkat waktu elusinya sekitar 15-30 menit.
Selain sistem kromatografi TLC-SG menggunakan campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 5 : 1 sistem kromatografi ITLC-SA menggunakan campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 7 : 1 juga dapat digunakan sebagai sistem kromatografi pengganti ITLC-SG menggunakan campuran eluen etanol : air : amonia = 2 : 5 : 1 bahkan waktu elusi yang dibutuhkannya juga lebih singkat dibandingkan elusi menggunakan TLC-SG yaitu sekitar 20 menit.
5. DAFTAR PUSTAKA
1. NURLAILA Z., MAULA EKA S., EVA
MARIA W., Pengembangan formulasi
radiofarmaka siprofloksasi dalam wadah tunggal, Majalah Farmasi Indonesia, Fakultas Farmasi Universitas Gajah Mada (dalam proses), (2010).
273
2. ROBBINS P. J., “Chromatography ofTechnetium-99m Radiopharmaceuticals”, A Practical Guide, The Society of Nuclear Medecine, New York (1984).
3. MAULA EKA S., NURLAILA Z., Karekteristik penyimpanan kit cair radiofarmaka siprofloksasin dalam wadah tunggal (Prosiding Seminar Nasional V SDM Teknologi Nuklir), Yogyakarta, (2009) 661.
4. GOPAL B.S.,”Fundamentals of Nuclear Pharmacy”, Fifth Ed., Springer, USA, (2004).
5. GASIGLIA, H. T. and OKADA, H., Preparation of samarium-153-EDTMP: Previous result (Proc. 5th General Congress on Nuclear Energy, Rio de Janeiro, Aug. 28 – Sep 02), Rio de Janeiro (1994) 647.
6. Pall Corp – Life Science, “Filter Media, ITLCTM “.
Available:http://www.medibix.com/runse arch.jsp?view=sku&product_id=454653
6. DISKUSI
Maula Eka:
Hal apa yang menyebabkan sistem kromatografi ITLC-SA / etanol : air : ammonia = 2 : 7 : 1 dapat juga digunakan sebagai pengganti sistem kromatografi ITLC-SG / etanol : air : ammonia = 2 : 5 : 1. Faktor apa yang menyebabkan hal tersebut ?
Eva Maria:
ITLC-SA memiliki sifat yang lebih non polar dibandingkan ITLC-SG, hal ini menyebabkan nilai pengotor 99mTc-tereduksi yang dihasilkan dengan menggunakan ITLC-SA/etanol : air : ammonia = 2:5:1 nilainya lebih tinngi dibandingkan ITLC-SG/etanol : air : ammonia = 2 : 5 : 1 karena ada sebagian
99m
Tc-siprofloksasin yang tertinggal di RF 0 bersatu dengan 99mTc-tereduksi. Dengan mengubah kepolaran eluen yaitu menjadi lebih polar (etanol : air : ammonia = 2 : 7 : 1) dapat memisahkan dengan baik 99mTc-siprofloksasin dengan 99mTc-tereduksi karena 99mTc-siprofloksasin lebih polar dibandingkan
99mTc-tereduksi, sehingga eluen dapat membawa 99mTc-siprofloksasin naik keatas terpisah dengan 99m
Tc-tereduksi.
