Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sains dan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas
Bandung, 8-10 Oktober 1991 PPTN - BATAN
IMOBILISASI ANTIBODI T4 PADA PARfIKEL MAGNET
Ratnawati Kukuh, Daniel SantosoPusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional
AHSTRAK
IMOBILISASI ANTIBODI T4 PADAPARTlKEL MAGNET. Metode pemisahan antigen terikat dari antigen bebas merupakan komponen esensial dari sistem RIA. Dalam penelitian ini dikembangkan metode pemisahan fase padat dengan tujuan menghindarkan penggunaan alat sentrifugasi, sehingga diharapkan Kit RIAfase padat dapat digunakan secara lebih luas. Untuk maksud ini antibodi diimobilisasikan pada partikel magnet sebagai penunjang padat dengan pengikatan secara kimiawi menggunakan l,l-karbonil-diimidazol (CD!). Antibodi yang digunakan perlu dalam bentuk IgG -T4 murni. Pemurnian dilakukan dengan menggunakan protein-A-sepharosa dan diperoleh fraksi IgG-T4sebesar 610 l1g/ml.Antibodi yang telah diimobilisasikan ini ditentukan titernya. Untuk memperoleh daerah kerja yang diinginkan, ditentukan volume pereaksi dan waktu inkubasi optimal. Data percobaan menunjukkan bahwa disain penentuan dengan 50111larutan baku T4/cuplikan, 50 111T4 bertanda 1251,dan 50 111suspensi IgG-T4-partikel magnet serta waktu inkubasi 2 jam memberikan hasil yang cukup peka pada daerah keIja yang diperlukan, yaitu antara 25 ->1500 nmol/l. Evaluasi lebih lanjut dari hasil kinerja penentuan menunjukkan bahwa kit yang telah dibuat sebanding dengan kit buatan DPC dan Amersham. Untuk menguji kestabilan suspensi IgG- T4 partikel magnet dilakukan penentuan waktu kadaluwarsa (shelf life). Hasil pengamatan menunjukkan bahwa untukjangka waktu lebih kurang 5 bulan masih cukup stabil. Dari data yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa pemisahan fasa padat menggunakan partikel magnet memberikan hasil yang cukup memuaskan.
ABSTRACT
IMMOBILIZATION OF T4 ANTIBODIES ON MAGNETIC PARTICLES An efficient method to separate bound from free antigen is an essential component ofa radioimmunoassay system. In the present study a solid phase separation method has been developed with the aim to avoid centrifugation and thus enabling more extensive use of radioimmunoassay kits in hospitals where centrifuges are not available. Antibodies were immobilised onto magnetised particles as solid support by means of chemical binding using 1,1- carbonil-diimidazole (CDI). The antibodies to be immobilized should be in the form of purified T4-lgG. Purification was performed using Protein-A-Sepharose and a fraction containing 0.610 I1g/ml of T4 was obtained. The titre of the immobilized antibodies was then determined. Assay design was optimised by determining the reagent volumes and length of incubation time suitable for the desired working range. An assay design using 50111ofT4 standard solution or sample, 50 111 of 1251_labeledT4and 50 111of magnetised T4- IgG suspension was found to yield reasonably sensitive results in the working range of interest, i.e. between 25 -> 1500 nmol/l. Further evaluation showed that the in-house kit performs comparably with those produced by DPC and Amersham. Stability testing was carried out to determine shelflife. Experimental results showed that up to about 5 months the kits are fairly stable. In general it can be concluded from the data obtained, that satisfactory results are obtained using a solid phase separation method employing magnetic particles.
PENDAHULUAN
Metode RIA untuk penentuan T4 sudah merupakan cara pengujian yang rutin diguna-kan, termasuk di antaranya Kit RIA-T4 PPTN yang menggunakan cara pemisahan antibodi kedua (second antibody) dan larutan polietilen-glikol dalam fase cairoUntuk keperluan rumah sakit metode pemisahan yang menggunakan fase pad at dinilai lebih ekonomis.
Sistem pemisahan fase padat mulai dikem-bangkan dengan tujuan menghindarkan
peng-gunaan alat sentrifugasi yang diperlukan pada pemisahan dalam fase cair, sehingga diharap-kan bahwa Kit RIA fase padat dapat digunadiharap-kan secara lebih luas, terutama pada rumah- rumah sakit yang belum atau tidak mempunyai alat sentrifugasi.
Salah satu bagian terpenting dalam sistem penentuan imunoradio adalah suatu prosedur efisien untuk memisahkan antigen yang terikat pada antibodi terhadap antigen bebas. Pada
pe-Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sains dan Teknologi Menuju Era Tinggal Landas
misahan dengan cara fase padat antibodi diimo-bilisasikan pada suatu penunjang padat (3,5).
Pada penelitian ini sebagai penunjang fase padat dipakai partikel magnet (magnetic solid phase microbead) yang pengikatannya dilaku-kan secara kimiawi menggunadilaku-kan 1,1- karbo-nil-diimidazol (CD!). Dengan digunakannya partikel magnet sebagai cara pemisah fase padat, maka tidak diperlukan penggunaan alat sentrifugasi. Antigen yang terikat dapat mudah dipisahkan dengan menggunakan pelat magne-tik. Pemisahan cara ini sangat sederhana, mu-dah, efisien, spesifik, memberikan nilai ikatan tak spesifik (NSB) rendah, dan dapat dikerja-kan dalam waktu yang relatif singkat (4).
Antibodi yang akan diimobilisasikan pada partikel magnet haruslah IgG-T4 yang murni. Pad a penelitian ini pemurnian dilakukan de-ngan menggunakan kolom protein-A- sepharosa (1,2). IgG-T4yang telah dimurnikan kemudian diimobilisasikan pada partikel magnet dengan cara kimiawi menggunakan 1,1-karbonil- diimi-dazol (CDI)(4).
Hasil imobilisasi antibodi diuji dengan me-lakukan penentuan titer. Titer ditentukan de-ngan cara menginkubasi berbagai variasi volu-me suspensi IgG-T4partikel magnet dengan se-jumlah tertentu antigen radioaktif. Pada akhir
inkubasi fraksi terikat dipisahkan mengguna-kan pelat magnetik, dan persen ikatan BIT
(fraksi terikatl keaktifan total) dapat ditentu-kan.
Disain dan optimasi penentuan dilakukan dengan menentukan volume pereaksi dan wak-tu inkubasi optimal unwak-tuk memperoleh daerah keIja yang diinginkan.
Pengujian kinerja penentuan (assay performance) dilakukan dengan mengevaluasi nilai besaran karakteristik yang diperlukan un-tuk penentuan imunoradio, misalnya besaran ikatan tak spesifik (NSB), ikatan maksimum (Borr), konsentrasi pada 50%BlBo (Ed 50), koe-fisien variasi antar penentuan cuplikan kontrol dan penentuan profil presisi. Sebagai pemban-ding digunakan kit RIA-
l'
4tabung bersalut duksi DPC dan kit RIA-T4 cara magnetik pro-duksi Amersham.Untuk menguji kestabilan suspensi IgG-T4 partikel magnet, dilakukan penentuan waktu kadaluwarsa (shelf life).
Tujuan penelitian ini adalah untuk menja-jaki pembuatan kit RIAfase padat dengan mem-pelajari imobilisasi antibodi 1'4 pada partikel magnet.
Bandung, 8 -10Oktober 1991
PPTN - BAT/1N
BAHAN DAN TATI\. KERJA
BAHAN DAN PERA U TAN
Bahan yang digunakan
Antibodi yang digunakan adalah antibodi hasil penelitian yang terdahulu (6), protein A-sepharosa produksi Pharmacia. Larutan dapar fosfat O,lM pH 7,4, larutan dapar borat 0,05 M pH 9,6, larutan dapar glisin-HCI pH 2,8, larutan dapar Tris, larutan dapar bikarbonat pH 8, dan larutan dapar asetat pH 4. Partikel magnet yang telah ditempeli
cm
diperoleh dari IAEA. Ase- ton, etanolamin dari E. Merck. Kit RIA'r 4 cara magnetik produksi Amersham dan kit RIA-T4 tabung bersalut (coated tube- 1'4) produksi DPC.Peralatan
Peralatan yang digunakan adalah alat pe 11.-cacah sinar y (Miniassay type 6-20), pH metBr (Metrohm Herisau E 520), pelat magnetik, korn-puter IBMIPC, program disket dari IAEA, pipet ependorf dengan ukuran 51l1,10III,50 Ill, 100~Ll, tabung reaksi, dan alat suntikan.
TATA KERJA
Pemurnian Antibodi
Pemurnian antibodi 1'4 dilakukan dengan menggunakan kolom protein- A-sepharosa (~~). Ke dalam suntikan plastik berukuran 2,5 rnl dimasukkan 0,3 g protein A- sepharosa dan 2 rnl dapar fosfat 0,1 M pH 7,4. Campuran dikocok dan dibiarkan mengembang selama 15 menit. Setelah mengembang ke dalam kolom kemu-dian dimasukkan 500 IIIantibodi 1'4yang telah dilarutkan dalam 1 ml dapar fosfat 0,1 M pH 7,4. Agar seluruh y-globulin teradsorpsi ke dalam kolom protein-A-sepharosa, maka larutan anti-bodi dikocok bersama dengan seluruh isi kolom dan dibiarkan selama 30 menit. Kolom kemu-dian dielusi dengan dapar fosfat 0,1 M pH 7,4. Penampungan dilakukan sebanyak 9 fraksi dan tiap fraksi berisi 2 ml. Hasil setiap fraksi diten-tukan resapannya dengan spektroskopi UV pa-da panjang gelombang 280 nm. Setelah resapan menurun, kolom dicuci dengan 3 ml NaCI 0,9%. Untuk mendesorpsi IgG-T4dari isi kolom, maIm kolom dielusi kembali dengan dapar glisin-HCI pH 2,8.Eluat ditampung sebanyak 6 fraksi ma-sing-masing 2 ml dalam vial berisi 1 ml dapar Tris. Fraksi yang mengandung IgG dapat diten-tukan resapannya dengan spektroskopi UV pa-da panjang gelombang 280 nm. Fraksi IgG dikumpulkan dan didialisis dalam dapar borat pH 9,6 selama 24 jam pada suhu 4°C. Untuk menghitung kadar IgG yang diperoleh,
Proreemngs Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sains dan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas
ditentukan sekali lagi resapannya dan dibandingkan dengan baku IgG.
lmobilisasi hasil pemurnian antibodi T4pada partikel magnet
Mula-mula botol yang berisi partikel mag-net yang telah ditempeli CDI dalam aseton diko-cok perlahan-Iahan hingga diperoleh campuran partikel magnet yang homogen. Ke dalam vial berukuran 50 ml dimasukkan 10 ml campuran partikel magnet-CDI-aseton. Partikel diendap-kan dengan menggunadiendap-kan pelat magnetik dan, kemudian dicuci berturut-turut 4 kali dengan 20 ml akuades dan 4 kali dengan 20 ml dapar bikarbonat pH 8. Setelah dilakukan pencucian, ke dalam partikel magnet tersebut ditambah-kan 0,5 ml IgG anti T4 hasil pemisahan dan dapar bikarbonat pH 8 hingga volume keselu-ruhannya menjadi 10 m!. Campuran kemudian diputar (rotate» selama 24 jam pada suhu
y"a-mar. Partikel magnet yang telah diimobilisasi dengan IgG anti T4 ini kemudian diendapkan dicuci berturut-turut 2 kali dengan 20 ml dapar bikarbonat pH 8, dan terakhir dengan 20 ml dapar bikarbonat yang mengandung etanola-min (3mlfl). Partikel diendapkan, disuspensi-knn dalam 20 ml dapar bikarbonat yang me-ngandung etanolamin (3 mlfl), kemudian dalam 20 ml dapar asetat pH 4. Suspensi dilakukan 30 menit pada suhu kamar sambil diputar. Selan-jutnya, partikel diendapkan kembali dan dicuci
2 kali dengan 20 ml dapar fosfat.
Penentuan titer antibodi yang telah diimobi-lisasi pada partikel magnet
Titer antibodi ditentukan dengan mela-kukan suatu seri percobaan menggunakanjum-Ish suspensi partikel magnet yang berbeda. Ke dalam suatu seri tabung reaksi dimasukkan 5, 10, 20, 50, 100, 200 J.lIsuspensi partikel magnet yang telah diimobilisasi dengan antibodi T4 . Untuk memperoleh jumlah volume yang sarna ditambahkan dapar fosfat 0,05 M pH 7,5. Selan-jutnya ke dalam setia p tabung ditambahkan 100 J.llT4 bertanda 1251. Campuran diinkubasi
sam-bil diputar selama 2 jam pada suhu kamar. Setelah inkubasi ke dalam campuran tersebut ditambahkan 1 mllarutan dapar pencuci (dapar fosfat 0,05 M pH 7,5, 0.5% tween 20). Partikel magnet yang mengandung fraksi terikat dien-dapkan menggunakan pelat magnetik. Endap-an dicuci dengEndap-an 1 mllarutEndap-an dapar pencuci dEndap-an keaktifannya dicacah dengan menggunakan pencacah sinar y.
Ban-dung, 8-10 Oktober 1991 PPTN - BATAN
Penentuan daerah herja dengan kepekaan yang diinginkan
a). Pembuatau kurva baku dan kurva profil presisi dengan jumlah suspensi antibodi T4 magnetik yang memberikan 50% peru nut terikat.
Untuk pembuatan kurva baku digunakan 25 J.lliarutan baku T4 dengan konsentrasi 0,10, 50, 100, 150, dan 250 nmol/l. Kemudian ditam-bahkan 100 J.lIT4 bertanda 1251 dan 100 J.lI
suspensi antibodi T4-magnetik. Campuran dia-duk dengan pengadia-duk vortex, diinkubasi sambil diputar selama 2 jam pada suhu kamar. Selan-jutnya ke dalam campuran ditambahkan 1 ml larutan dapar pencuci. Partikel magnet yang mengandung fraksi terikat dipisahkan dengan pelat magnetik. Endapan kemudian dicuci de-ngan 1 ml larutan dapar pencuci dan keaktif-annya ditentukan dengan pencacah sinary. Pro-tokol RIA untuk percobaan ini dapat dilihat pada Tabel1 ( lihat halaman berikut).
Dari hasil percobaan kemudian dibuat grafik antara fraksi terikat dan konsentrasi T4 serta grafik profil presisi yang menggambarkan hubungan antara % koefisien variasi (% CV) dengan konsentrasi.
b). Penentuan volume pereaksi optimal untuk mendapatkan daerah kerja dengan kepeka-an ykepeka-ang diinginkkepeka-an.
Untuk maksud ini dilakukan berbagai kombinasi dengan disain percobaan sebagai berikut:
1. 25 J.lIlarutan baku T4, 100 J.lIT4 bertanda 1251,100 J.lIsuspensi T4 magnetik.
2.50 J.lI larutan baku T4, 100 J.lIT4 bertanda
1251, 100 J.lIsuspensi T4 magnetik.
3.25 J.lI larutan baku T4, 50 J.lI T4 bertanda 1251,50 J.lIsuspensi T4 magnetik.
4. 100 J.lIlarutan baku T4, 100 J.lIT4 bertanda
1251, 100 J.lIsuspensi T4 magnetik.
5. 50 J.lI larutan baku T4, 50 J.lI T4 bertanda 1251,50 J.lIsuspensi T4 magnetik.
Percobaan dilakukan sesuai dengan pro-tokol RIA yang tertera pada Tabel1. Dari selu-ruh percobaan kemudian dibuat grafik antara fraksi terikat dan konsentrasi T4 serta grafik profil presisi.
5. Optimasi waktu inkubasi
Optimasi inkubasi diperoleh dari variasi waktu.Pembuatan kurva baku dan kurva profil presisi dikerjakan sesuai percobaan di atas dengan lama inkubasi 1, 2, 4, dan 24 jam pada suhu kamar.
Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sains dun Teknologi Menuju Era Tinggal Landas
Bandung, 8 -10 Oktober 1991 PPTN - BATAN
Tabell. Protokol RIA-T4 menggunakan pemisah paartikel magnet
-Volume BlangkoKonsentrasi baku T (nmol/l)
pembanding Uti ) 0 1050 100150250cuplika.n ( I!l) T15free serum -25 - ---
-1
Larutan baku1-T4 100100100100100100100100 100 -25 25 25 25 2525 -Suspensi antibodiT 4 -100" 100 100 100 100100100100partikel magnet Cuplikan
--- 25
1nkubasi selama 2 iam pada suhu kamar sambil diputar
- Tambahkan 1 mllarutan dapar pencuci
- Pisahkan partikel magnet dengan menggunakan pelat magnetik - Pisahkan supernatan dan tentukan keradioaktifan dari endapan..
- Suspensi partikel; magnet-CD1 tanpa antibodi
6. Pengujian karakteristik RIA T4 caramagnetik Setelah diperoleh disain penentuan secara optimal maka langkah selanjutnya dilakukan pengujian beberapa parameter pengendalian mutu internal (internal quality control) yang menggambarkan karakteristik suatu kit RIA. Hal ini dilaksanakan dengan mengevaluasi ni-lai besaran: ikatan tak spesifik (NSB), ikatan maksimum (Botr), konsentrasi yang membe-rikan 50%BlBo (Ed 50) dan koefisien variasi antar penentuan (interassay) cuplikan kontrol serta profil presisi. Sebagai pembanding digu-nakan kit RIA-T4 tabung bersalut produksi DPC, dan kit RIA-T4 cara magnetik produksi Amersham.
HASILDAN DISKUSI
Dalam penggunaan RIA dengan sistem pe-misahan fase padat, antibodi spesifik diimobi-lisasikan pada suatu penunjang fase padat sebe-lum assay dilakukan. Untuk maksud ini dibu-tuhkan antibodi dengan kemurnian, titer, spesifisitas dan aviditas yang tinggi, sebab hanya antibodi dengan sifat tersebut di atas yang memungkinkan terjadinya ikatan antara antigen dengan antibodi fase padat dan diper-olehnya hasil penentuan dengan kepekaan tinggi (3).Antibodi dengan titer rendah kurang baik untuk penentuan RIA fase padat, sebab antigen yang terikat (%Bo/T) sangat rendah. Hal ini akan memberikan bentuk kurva baku landai yang akan mengurangi kepekaan dan presisi percobaan.
Untuk memperoleh antibodi yang meme-nuhi persyaratan agar dapat diimobilisasikan
pad a penunjang padat, maka dilakukan pemurnian antibodi T4' Dari berbagai cara, ter-bukti bahwa pemurnian menggunakan protein A- sepharosa adalah yang terbaik (2). Dengan cara ini diperoleh fraksi 19G-T4 sebesar H10 I!g/ml.
Sebelum dilakukan imobilisasi pada parti-kel magnet, ditentukan terlebih dahulujumlah antibodi maksimum, dan dari hasil percobaan ternyata penambahan 0,5 ml 19Ganti T4 mem-berikan hasil yang optimum. Hasil imobilisasi antibodi pada permukaan partikel magnet diuji dengan melakukan penentuan titer. Dari kuX"Va titrasi 19G-T4fase padat pada Gambar 1 dapat disimpulkan, bahwa dengan volume suspensi 19G-T4-partikel magnet sebesar 50- 100 I!lmem-berikan hasil yang cukup baik untuk penen-tuan RIA,yaitu yang memberikan 50%perunut terikat. Dengan kondisi tersebut selanjutnya dilakukan disain dan optimasi assay. Untuk maksud tersebut dilakukan penentuan volume pereaksi dan waktu inkubasi optimal. Data pe-nentuan hasil optimasi dari berbagai kombinasi volume pereaksi dapat dilihat pada Gambar 2 dan Tabel 2, dan data hasil optimasi variasi inkubasi dapat dilihat pada Tabel 3. Terbukti bahwa disain penentuan dengan 50 I!l larutan baku T4 (cuplikan), 50 I!l T4-bertanda 1251Clan 50 I!l suspensi 19G-partikel magnet serta wak-tu inkubasi 2 jam memberikan percobaan yang cukup peka pada daerah kerja yang diinginkan, yaitu antara 25 - >1500 nmol/l. Nilai normal T4 berkisar antara 60 - 150 nmol/l. Data menun-jukkan bahwa volume pereaksi mempengaruhi
batas deteksi. Bila diinginkan penentuan pnda
Pror:eedings Seminar Reakror Nuklir dalam Penelitian Sains clan Teknologi MenuJu Era Tinggal Landas
• ". " 30 '., i
,0L
.
12'5 10 "' 50 25 'Ii kel magnet200 '~ Volume par
Gambar 1. Kurva hasil penentuan titer IgG-T4 pa rtikel magnet.
Bandung, 8-10 Okrober 1991 PPTN - BATAN
Tabel 2.
. -Kombinasl Ed 50Batas profilBarr pereaksi (%) (nmoI/l)presisi (nmoI/l) 1.25 !AIbaku 50,9 93,7 44 - >1323 50 !AI 1251T - 4 50 !Alanti-T4 magnetik 2.50 !AIbaku 53,4 114,753,4 - 900 100 !AI 1251-T4 100 !AIanti-T4magnetik
3.100 !AIbaku
47,0 57,4
28,0->2000 100 !AI 1251_T4 100 !Alanti-T4magnetik
4.50 !AIbaku
51,6 49,5
25,0 - 650 50 !AI1251-T4 50 !AIanti-T4magnetik
5.25 !AIbaku
56,5 237,3180 -)1800 100 !AI1251-T4 100 !AIanti-T4magnetik
100 !AIX, 100 !AIY, 100 !AIZ;
Gambar 2. Kurva baku dan profil presisi pada berbagai kombinasi pereaksi.
B=fraksi terikat; Bo=fraksi pada konsentrasi
O·
,
X = Iarutan baku; Y = 1251-T4 ; Z = IgG-T4
partikel magnet. 50 "CV a •
.
. \ ... '. ..••....\<':,:~;;~~;~.;:~-.
_i\.~~,~,.~,<'
_..• '" ~ SO 100 500 1000 nmolll 5000 KonsentrasiTabel 3. Hasil variasi waktu inkubasi WaktuEd 50Batas profilBolT
inkubasi (%) (nmoI/l)presisi (nmoI/l) 1jam 75,9 46,121 - 700 2 jam 76,2 55,825 - > 1500 4jam 72,0 55,625 - 650 24jam 62,3 59,929 - 600
daerah konsentrasi rendah, maka dibutuhkan volume cuplikanyang Iebih besar. Faktor utama yang mempengaruhi waktu inkubasi ialah avi-ditas antibodi yang digunakan. Makin tinggi aviditas suatu antibodi, maka waktu yang dibu-tuhkan untuk mencapai keseimbangan makin pendek. Hal lain yang berpengaruh adalah bo-bot molekul antigen yang akan ditentukan. Mengingat bahwa T4 mempunyai bobot molekul 777, maka untuk mencapai keseimbangan tidak dibutuhkan waktu inkubasi yang terlalu lama. Untuk memperoleh kepekaan analisis dan
pre-Proceedings Seminar ReMwr Nuklir dalam Penelitian Sains dan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas
Bandung, 8 -10 Okwber lS91
PPTN - BATiW
.untuk kadar rendah, menengah dan tinggi. Dari hasil pengujian kinerja penentuan dapat disim-pulkan bahwa ketiga kit tersebut mempunyai persamaan karena tidak menunjukkan perbe-daan yang nyata .
Untuk menguji kestabilan suspensi IgG··T4 partikel magnet dilakukan penentuan waktu kadaluwarsa. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa suspensi partikel magnet tersebut ma:sih cukup stabil untuk jangka waktu lebih kurang 5 bulan. Hasil dapat dilihat pada Tabel 5. sisi percobaan yang lebih baik biasanya dibu- berturut-turut untult kadar rendah, menengah tuhkan waktu inkubasi yang lebih lama. dan tinggi. Untuk
h~
RIA-T4 tabung bersalut Hasil pengujian kinerja penentuan (assay produksi DPC diperoleh nilai ikatan tak spe-performance) dapat dilihat pada Tabel 4. sifik (4,5 ± 0,5)%, ikatan maksimum (55,5 ±Data percobaan menunjukkan bahwa 3,1)%, konsentrasi pada 50% B/Bo: (115,5 ± penggunaan IgG-T4 partikel magnet sebagai 13,3)nmol/l dan untuk cuplikan kontrol mem-pemisah rase padat pada kit PPTN memberikan berikan nilai (34,8 ± 6,1) nmol/l, (88,5 ± 6,5) nilai ikatan tak spesifik (NSB) berkisar antara nmol/l, dan (144,8 ± 6,9) nmol/l berturut-turut
Tabel 4. Hasil pengujian kinerja penentuan dari berbagai macam kit PPTN AmershamDPC (magnetik) (magnetik) (coated tube) Borr (%) 54,2 ± 8,3 73,7 ± 3,255,5 ± 3,1 Kemiringan 1,06 ± 0,09 1,06 ± 0,051,04 ± 0,04 Ed 50 (nmol/l) 44,9 ± 5,0 55,5 ± 1,9 115,5 ± 13,3 NSB (%) 3,9 ± 0,6 3,8± 0,44,5 ± 0,5
Cup. rendah (nmol/l)
37,7 ± 3,5 34,2 ± 0,734,8 ± 6,1
Cup.menengah
96,2 ± 5,2 94,1 ± 1,588,5 ± 6,5
(nmol/l) Cup. tinggi (nmol/l)
146,3 ± 6,7 149,7 ± 7,9144,8 ± 6,9
(3,9 ± 0,6)%, ikatan maksimum (Bo/T)(54,2 ± 8,3)%. Konsentrasi 50% B/Bo (Ed 50) diperoleh nilai (44,9 ± 5,0) nmol/l dari 9 kali penentuan. Penentuan cuplikan kontrol antar assay mem-berikan hasil (37,7 ± 3,5) nmol/l untuk cuplikan kadar rendah, (96,2 ± 5,2) nmol/l untuk cuplikan kadar menengah, dan (146,3± 6,7) nmol/l untuk cuplikan kontrol kadar tinggi. Untuk kit RIA-T4 cara magnetik produksi Amersham diperoleh nilai-nilai ikatan takspesifik (3,8± 0,4)%,ikatan maksimum (73,7± 3,2)%,konsentrasi pada 50% B/Bo :(55,5 ± 1,9)nmol/l dan untuk cuplikan kontrol memberikan nilai (34,2 ± 0,7) nmol/l, (94,1 ± 1,5) nmol/l, dan (149,7 ± 7,9)nmol/l
Tabel 5. Hasil penentuan kestabilan suspensi IgG-T4 partikel magnet Waktu 1141190 (minggu) Borr (%) 55,4 61,6 64,559,753,2 Kemiringan 0,9 1,1 1,01,20,9 Ed 50 (nmol/l) 45,9 43,8 46,037,433,9 NSB (%) 3,1 4,4 4,44,8 10,1 QC-A (nmol/l) 34,5 32,3 35,838,348,8 QC-B (nmol/l) 101,2 88,8 106,299,494,1 QC-C(nmol/l) 159,8 147,4 142,6145,0162,5 Catatan : Batas nilai cuplikan kontrol
Prcx<eedingsSerrU/'UU"Reahtor Nuklir dalam Penelitian Sains clan Tekrwlogi Menuju Era TInggal Landas
KESIMPUIAN:
Pemisahan fase padat menggunakan par-tikel magnet memberikan hasil yang cukup me-m\.:laskan.Hasil penelitian ini diharapkan akan DAFfAR PUSTAKA
Bandung, 8 -10 Oktober 1991 PPTN - BATAN
sangat bergun..l untuk pembuatan Kit RIA-T4 fase padat.
1. Gembicki, M., A. Polanska, J. Kosowicz, "T3 dan T4 solid phase radioimmunoassay with the Ispesificantibodies isolated by affinity chromatography", Radioimmunoassay and Related Pro-.:;edurein Medicine, 1982, IAEA, Vienna (1982) 95-105.
2. Nanny, K H. dan kawan-kawan, "Isolasi imunogamaglobulin anti-T4 dari antisera", Seminar Pendayagunaan Reaktor Nuklir untuk Kesejahteraan Masyarakat, PPTN- BATAN, Ban-dung (1990).
3. Edward, R., "Solid-phase immunoassay", Regional Training Course on Production and Use of Bulk Reagents for RIA of Thyroid Related Hormones, Bangkok, Thailand (1986).
4. Sufi, S. and Micallef, J., "Immobilisation of antibodies", International Atomic Energy Agency Regional Course on Optimisation of Production Techniques and Distribution Schemes for Reagents for Radioimmunoassay, National Institute of Health Nonthabury, Thailand (1989). 5. Catt, KJ., Niall, H.D., Tregear,G.W., Solid-phase radioimmunoassay of .human growth
hor-mone, Biochem.J. 100 (1966) 31c.
6. Ratnawati K., dan Pringgo Soedigdo, "Pembuatan antibodi T4 untuk bahan pereaksi RIA", Seminar Pendayagunaan Reaktor Nuklir untuk Kesejahteraan Masyarakat , PPTN-BATAN, Bandung (1990).
DISKUSI
Nanny Kartini:
1. Bila dilihat dari hasil percobaan membandingkan RIA-magnetik yang dibuat dengan kit RIA komersiallain, terlihat bahwa ED-50 dari partikel magnetik 49 nmol/l sedangkan DPC = 115 nmol/l. Apakah yang menyebabkan perbedaan ini?
2. Berapakah kadar normal dari T4?
Ratnawati
K :
1. Biasanya Ed-50 berada disekitar daerah normal T4 dan terlihat bahwa pada kit DPC, ED-50 nya cenderung lebih tinggi, ini berarti bahwa kit DPC lebih peka di daerah tinggi. Ed50 dari partikel magnet PPTN = 49 nmol/l, walaupun ED-50 nya berbeda cukup besar, tetapi masih mencakup daerah kerja yang cukup lebar yaitu antara 25 -> 1500 nmol/l, sehingga perbedaan ED-50 antara kit DPC dan kit PPTN partikel magnet tidak berpengaruh besar.
2. Kadar normal dari T4 adalah 60 - 150 nmol/l.
n[)onSuparman :
Mohon dijelaskan prinsip penempelan antibodi T4 pada partikel magnet!
Ratnawati Kukuh:
Prinsip penempelan antibodi T4 pada cellulosa-partikel magnet adalah sebagai berikut : Penempelan dilakukan secara kimia dengan terlebih dahulu mereaksikan cellulosa-partikel magnet +CDI (carboni! di imidazol). Selanjutnya antibodi T4 (gugus amida pada antibodi T4 ) bereaksi dengan gugus carbonil dari CD!.
